吳瑕，馬穎超，劉秀菊，楊秀嶺，董維沖，殷立新（河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院藥學(xué)部，石家莊 050000）

頭孢曲松為第三代頭孢菌素，對(duì)大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、流感嗜血桿菌等革蘭氏陰性菌，及甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌等革蘭氏陽(yáng)性菌均具有良好抗菌活性[1]。棘白菌素類抗真菌藥，用于治療曲霉菌屬、念珠菌屬等引起的深部真菌感染[2]。臨床治療病原菌不明的嚴(yán)重感染時(shí)常需聯(lián)合使用抗細(xì)菌、真菌藥物以求對(duì)致病菌的廣覆蓋[3]，頭孢曲松與米卡芬凈聯(lián)合應(yīng)用可作為一種抗感染治療方案應(yīng)用于臨床。

頭孢曲松和米卡芬凈具有相似的藥動(dòng)學(xué)（pharmacokinetics，PK）特征，血漿蛋白結(jié)合率（plasma protein binding，PPB）高、表觀分布容積小、半衰期長(zhǎng)[4]，高PPB 的藥物合用可能因競(jìng)爭(zhēng)血漿蛋白而增加游離型藥物濃度，同時(shí)也增加表觀分布容積[5]，使藥物PK 發(fā)生改變。目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)兩藥合用時(shí)頭孢曲松PPB 變化的報(bào)道，本試驗(yàn)采用超濾-高效液相色譜法測(cè)定正常人血漿中頭孢曲松的游離藥物濃度及PPB，并進(jìn)一步考察米卡芬凈對(duì)頭孢曲松體外PPB 的影響。

1 材料

1.1 儀器

Waters e2695 高效液相色譜儀（配2489 型紫外檢測(cè)器），Diamonsil C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱；超濾離心管（0.5 mL，10 kD，美國(guó) Millipore公司）；離心機(jī)（ABBOTT，德國(guó)）；渦旋混合器（XW-80A，上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠）；低溫冰箱（MDF-U2086S，日本三洋）；冷藏柜（YC-180，澳柯瑪）；電子分析天平（CPA225D，德國(guó) Sartorius）；pH 計(jì)（pH213，意大利 HANNA）。

1.2 試藥

頭孢曲松對(duì)照品（批號(hào)：130480-201704，含量：83.9%）、內(nèi)標(biāo)頭孢呋辛對(duì)照品（批號(hào)：130493-201706，含量：91.9%）（中國(guó)食品藥品檢定研究院）；注射用米卡芬凈鈉（批號(hào)：027880，Astellas Pharma Tech Co.，Ltd.Takaoka Plant）；人血漿由河北省血液中心提供；乙腈（分析純，賽默飛世爾科技有限公司）；其他試劑均為分析純；水為蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.03 mol·L－1磷酸二氫鉀溶液（12∶88，V/V，三乙胺調(diào)pH 7.5）；流速：1.0 mL·min－1；柱溫：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液的配制

① 分別精密稱取頭孢曲松、米卡芬凈鈉11.92 mg、25 mg，分別置于10 mL 量瓶中，用水溶解定容，配制成1 mg·mL－1頭孢曲松對(duì)照品溶液、2.5 mg·mL－1米卡芬凈藥品溶液，4℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

② 精密稱取內(nèi)標(biāo)頭孢呋辛對(duì)照品10.88 mg置于50 mL 量瓶中，用水溶解定容，配制成200 μg·mL－1內(nèi)標(biāo)溶液，4℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 血漿樣品處理

2.3.1 游離型藥物濃度測(cè)定的樣本處理 取血漿500 μL 加入到超濾離心管內(nèi)管中，室溫12 639 r·min－1離心10 min，棄去超濾液，將內(nèi)管中的血漿加至500 μL，重復(fù)上述操作1 次，取超濾液進(jìn)行分析。

2.3.2 總血藥濃度測(cè)定的樣本處理 參考文獻(xiàn)[6]的方法并進(jìn)行改良，于1.5 mL 離心管中加入200 μL 血漿及20 μL 內(nèi)標(biāo)頭孢呋辛溶液，加入300 μL甲醇沉淀蛋白，渦旋1 min，13 000 r·min－1離心10 min，取上清液進(jìn)行分析。

2.4 方法專屬性

取人空白血漿、人空白血漿＋頭孢曲松對(duì)照品＋注射用米卡芬凈鈉、人空白血漿＋頭孢曲松對(duì)照品＋內(nèi)標(biāo)頭孢呋辛對(duì)照品，分別按“2.3.1”項(xiàng)下方法處理后進(jìn)行分析并記錄色譜圖。頭孢曲松和內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間分別為7.36 min、20.41 min，峰形良好，米卡芬凈在監(jiān)控時(shí)間30 min 內(nèi)未洗脫，人血漿中的內(nèi)源物質(zhì)不干擾測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 頭孢曲松高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatogram of ceftriaxone

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 游離型藥物濃度測(cè)定 用人空白血漿超濾液逐步稀釋頭孢曲松對(duì)照品溶液，制得質(zhì)量濃度為0.5、1、5、10、20、50、100 μg·mL－1系列樣品溶液進(jìn)行分析。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x），峰面積為縱坐標(biāo)（y）作線性回歸分析（權(quán)重因子1/c2），標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y＝2.18×104x－4.45×103，r＝0.9999，表明頭孢曲松游離質(zhì)量濃度在0.5 ～100 μg·mL－1與峰面積線性關(guān)系良好。檢測(cè)限（S/N＝3）為0.05 μg·mL－1，定量限（S/N＝10）為0.1 μg·mL－1。

2.5.2 總血藥濃度測(cè)定 將不同質(zhì)量濃度的頭孢曲松對(duì)照品溶液置于1.5 mL 離心管中常溫氮?dú)獯蹈?，加入空白血漿，制成質(zhì)量濃度為5、10、50、100、200、500 μg·mL－1的頭孢曲松血漿樣品，按“2.3.2”項(xiàng)下方法處理，取上清液進(jìn)行分析。以待測(cè)物質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x），待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)物峰面積比值為縱坐標(biāo)（y）作線性回歸分析（權(quán)重因子1/c2），標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y＝0.0539x＋0.0463，r＝0.9998，表明頭孢曲松總質(zhì)量濃度在5 ～500 μg·mL－1與峰面積線性關(guān)系良好。

2.5.3 精密度試驗(yàn) 取人空白血漿超濾液配制低、中、高質(zhì)量濃度（1、10、80 μg·mL－1）的頭孢曲松對(duì)照品溶液各5 份，在1 d 內(nèi)分析，按隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算日內(nèi)精密度；再連續(xù)5 d 分析，計(jì)算日間精密度。結(jié)果低、中、高濃度日內(nèi)精密度RSD分別為1.6%、2.4%和 2.1%，日間精密度RSD分別為1.9%、2.9%和 2.7%。

2.5.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取人空白血漿配制低、中、高質(zhì)量濃度（10、200、400 μg·mL－1）的頭孢曲松血漿樣品各5 份，渦旋混勻，37 ℃水浴0.5 h，按“2.3.2”項(xiàng)下方法處理后4℃冰箱放置0、1、2、4 h 后進(jìn)行測(cè)定，考察處理后4℃放置穩(wěn)定性；血漿樣品于－40℃冰箱低溫保存5 d，考察低溫保存穩(wěn)定性；血漿樣品反復(fù)凍融3 次，考察反復(fù)凍融穩(wěn)定性。結(jié)果RSD均＜10%，表明在上述條件下相關(guān)樣品均穩(wěn)定。

2.5.5 超濾膜回收率 將低、中、高質(zhì)量濃度（1、10、80 μg·mL－1）的頭孢曲松對(duì)照品溶液進(jìn)行超濾離心，考察超濾離心次數(shù)對(duì)超濾膜回收率的影響。試驗(yàn)表明經(jīng)1 次超濾離心后待測(cè)物的回收率還較低（低、中、高濃度分別為86.40%、83.26%、82.89%）；經(jīng)2 次超濾離心后待測(cè)物的回收率提高（低、中、高濃度分別為97.09%、95.64%、96.82%），第3 次超濾離心回收率無(wú)明顯增加（低、中、高濃度分別為98.52%、95.43%、97.01%），因此確定經(jīng)2 次超濾離心后的超濾液用于分析，非特異性吸附造成的待測(cè)物濃度損失可忽略。

2.5.6 平衡時(shí)間的考察 用人空白血漿配制低、中、高質(zhì)量濃度（10、100、300 μg·mL－1）的頭孢曲松血漿樣品，渦旋混勻，37 ℃水浴0.5、1、1.5、2 h，考察頭孢曲松與血漿白蛋白達(dá)到平衡所需的時(shí)間。結(jié)果表明37 ℃水浴0.5 h 頭孢曲松游離濃度維持穩(wěn)定。

2.5.7 超濾離心時(shí)間的考察 以不漏蛋白且超濾液體積與超濾前血漿總體積的比值在0.3 ～0.6 為標(biāo)準(zhǔn)[7]，考察最佳的超濾離心條件為室溫12 639 r·min－1，離心10 min。

2.6 米卡芬凈對(duì)頭孢曲松PPB 的影響

配制100、300、500 μg·mL－1的頭孢曲松血漿樣品，渦旋混勻，37℃水浴0.5 h，每個(gè)質(zhì)量濃度分別取適量按照“2.3.2”項(xiàng)下方法測(cè)定總血藥濃度（Ct），剩余血漿按照“2.3.1”項(xiàng)下方法測(cè)定游離濃度（Cf），計(jì)算頭孢曲松PPB ＝[（Ct－Cf）/Ct]×100%。

在上述血漿樣品中加入不同質(zhì)量濃度的注射用米卡芬凈鈉溶液，得到約含2、10、20 μg·mL－1米卡芬凈的頭孢曲松血漿樣品，考察米卡芬凈對(duì)頭孢曲松PPB 的影響。

用SPSS 20.0 軟件配對(duì)樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著血漿中頭孢曲松濃度的升高，其體外PPB 下降明顯（P＜0.05）。低、中、高質(zhì)量濃度（2、10、20 μg·mL－1）米卡芬凈對(duì)頭孢曲松的PPB 均無(wú)顯著影響。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 米卡芬凈對(duì)頭孢曲松PPB 的影響(n ＝3)Tab 1 Effect of micafungin on the plasma protein binding rate of ceftriaxone (n ＝3)

3 討論

頭孢曲松為親水性抗菌藥物，不易透過(guò)脂質(zhì)細(xì)胞膜，主要分布于血液和體液中，PPB 約為85%～95%，評(píng)價(jià)該藥的藥動(dòng)/藥效學(xué)指數(shù)為抗菌藥物游離濃度超過(guò)最低抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）的時(shí)間（time，T）占給藥間隔的比率，即f%T＞MIC[8]，因?yàn)橹挥杏坞x型藥物才能從血液向組織中轉(zhuǎn)運(yùn)，在感染部位發(fā)揮抗菌作用。當(dāng)患者處于某些特殊病生理狀態(tài)時(shí)，如低蛋白血癥、肝炎、肝硬化、尿毒癥、腎病綜合征等，PPB 會(huì)發(fā)生改變而影響游離藥物濃度[9]。本研究建立了超濾-高效液相色譜法測(cè)定頭孢曲松游離藥物濃度，較傳統(tǒng)的平衡透析法操作簡(jiǎn)單、耗時(shí)短，可用于臨床樣本的測(cè)定。

超濾離心管濾膜孔徑的選擇，頭孢曲松主要與人血清白蛋白（HSA）結(jié)合，白蛋白分子量為66.3 kD，選擇常用的截留分子量為10 kD 的超濾離心管可滿足測(cè)定要求。

頭孢曲松在體內(nèi)不被代謝，試驗(yàn)測(cè)定無(wú)需考慮代謝產(chǎn)物的影響。健康人群靜脈滴注頭孢曲松0.5、1、2 g，穩(wěn)態(tài)時(shí)Cmax分別為80、150、250 μg·mL－1，臨床治療中度敏感菌引起的感染或細(xì)菌性腦膜炎時(shí)，單次劑量最大可給予4 g，因此本研究考察了頭孢曲松血藥濃度為100、300、500 μg·mL－1時(shí)的PPB 值。有研究給予健康人群靜脈滴注米卡芬凈50、100、150 mg，Cmax分別為2.68、5.53、8.26 μg·mL－1，臨床治療嚴(yán)重或難治性曲霉菌病時(shí)單次劑量可增至300 mg，Cmax與給藥劑量基本呈線性關(guān)系[10]，因此本研究考察了2、10、20 μg·mL－1米卡芬凈對(duì)不同濃度頭孢曲松PPB 的影響。

頭孢曲松可在HSA 的位點(diǎn)Ⅰ（華法林結(jié)合位點(diǎn)）上通過(guò)氫鍵和范德華力可逆性結(jié)合[11]，且結(jié)合具有飽和性，隨著藥物濃度增加，蛋白上的結(jié)合位點(diǎn)趨于飽和，導(dǎo)致游離藥物比率加大，本試驗(yàn)也驗(yàn)證了隨著頭孢曲松血藥濃度的升高PPB明顯下降，但下降幅度與 Perry 等[12]報(bào)道的隨著頭孢曲松血清濃度從0.5 mg·L－1升高至300 mg·L－1，游離部分從4%增加到17%存在一定差異。由于體外試驗(yàn)無(wú)法完全模擬藥物在體內(nèi)分布和消除的動(dòng)態(tài)過(guò)程，需進(jìn)一步開(kāi)展體內(nèi)研究。

試驗(yàn)證明米卡芬凈對(duì)頭孢曲松PPB 影響小，僅可使高濃度頭孢曲松的PPB 下降約4%，這是因?yàn)轭^孢曲松結(jié)合常數(shù)（Ka）大，為3.67×104M－1[13]，與HSA 的結(jié)合能力強(qiáng)，不易被米卡芬凈置換；頭孢曲松治療窗較寬，安全性好，推測(cè)兩藥合用時(shí)不會(huì)因?yàn)轭^孢曲松游離濃度的少量升高而引起不良反應(yīng)，但這一結(jié)論仍有待臨床進(jìn)一步觀察驗(yàn)證。