黃倩倩，鮑倩倩，吳成圓，胡夢茹，陳云娜，王雷*，陳衛(wèi)東*（1.安徽中醫(yī)藥大學藥學院，合肥 230012；2.中藥復方安徽省重點實驗室，合肥 230012；3.藥物制劑技術(shù)與應用安徽省重點實驗室，合肥 230012；4.現(xiàn)代藥物制劑安徽省工程技術(shù)研究中心，合肥 230012）

碳點，一種新型的零維碳質(zhì)納米材料，粒徑1 ～10 nm，制備方法簡單，具有良好的光致發(fā)光性[1]、低細胞毒性[2]、高水溶性和生物相容性等特點，被廣泛地運用于生物成像[3]、分析傳感[4]、藥物輸送[5]以及癌癥治療等領域。目前針對于碳點合成原料多注重于天然化學物質(zhì)[6-8]及食源性材料[9-11]，以傳統(tǒng)中藥材[12-14]為原料制備而成的碳量子點研究報道較少。所謂以中藥為源合成碳點是指將中藥材通過一定的物理或化學手段加工處理使其成為粒徑小于10 nm 的碳基納米材料，由于不同的中藥材中活性成分存在著差異，其衍生出的碳點藥理活性也各不相同，主要發(fā)揮著止血[15]、抗腫瘤[16]、抗菌[17]、抗病毒[18]等藥理作用。此外有學者發(fā)現(xiàn)中藥衍生的碳量子點還可以改善原中藥材的某些固有特性（如溶解度[19]），或保留中藥材本身的藥理活性[20]，或增加新的藥理活性[21]等。因此，拓寬以中藥材為原料合成具有熒光特性的碳量子點，可為中藥納米制劑提供新的研究方向。

中藥藤黃（gamboge）是藤黃科植物藤黃樹（Garcinia hanburyiHook.f.）的樹干切傷后分泌的膠樹脂[22]?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)藤黃具有抗腫瘤、抗炎和抗病毒活性，但也具有強烈的刺激性和一定的毒性，其主要毒性成分為藤黃酸和新藤黃酸[23]。使用中為降低其毒性作用，常采用不同的炮制方法，高壓蒸制[24]、豆腐制[25]、清水制[26]等。此炮制過程與碳量子點合成途徑相似，因此聯(lián)想到是否能合成其衍生碳點，在改善原料水溶性差和保留原材料抗腫瘤活性的同時降低其高毒性問題。故本研究采用一步水熱法，以中藥材藤黃為原材料，通過堿摻雜法，制備了一種中藥衍生型藤黃碳量子點（gamboge carbon quantum dots，GCDs），制備過程如圖1所示。研究發(fā)現(xiàn)GCDs 具有優(yōu)異的光致發(fā)光性特性及熒光穩(wěn)定性，且水溶性好，無需超聲處理即可均勻分散，改善了原料藤黃水溶性差的問題，此外細胞毒性實驗研究發(fā)現(xiàn)GCDs 對癌細胞具有抑制作用，對正常免疫細胞毒性較低，表明GCDs 可保留原材料藤黃的藥理作用，發(fā)揮一定的抗腫瘤活性同時又顯著地降低其高毒性。

圖1 GCDs 的合成示意圖Fig 1 Synthesis schematic diagram of GCDs

1 材料

1.1 儀器

AB135-S 型十萬分之一電子分析天平（德國METTLER TOLEDO 公司）；TG16-WS 臺式高速離心機（長沙湘儀離心機儀器有限公司）；KQ-300B 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；F-4600 熒光分光光度計（日本Hitachi 公司）；Nicolet 6700 傅里葉紅外光譜儀（美國賽默飛儀器公司）；FEI Tecnai G2 F20 型透射電子顯微鏡（美國FEI Co 公司）；SPECORD S600 型紫外分光光度計（德國Analytik Jena 公司）。

1.2 試藥

藤黃藥材（安徽亳州藥材交易市場）；氫氧化鈉（上海阿拉丁生化科技股份有限責任公司）；透析袋1000 Da（USA 進口透析袋）；硫酸奎寧（上海阿拉丁生化科技股份有限責任公司）；DMEM 高糖培養(yǎng)基、RPMI1640 培養(yǎng)基（美國Gibco 公司）；MTT（美國Sigma 公司）；其他試劑均為分析純。

1.3 細胞

小鼠巨噬細胞RAW 264.7、人肝癌細胞株Bel 7402 購自中國科學院上海細胞庫。

2 方法

2.1 碳量子點的制備

采用一步水熱法制備碳量子點：藥材藤黃經(jīng)研磨后過80 目篩，得藤黃粉末。稱取0.45 g 藤黃粉末于50 mL 燒杯中，加入30 mL 0.1 mol·L－1的NaOH溶液，超聲攪拌10 min，然后將混合物轉(zhuǎn)移到50 mL 特氟隆高壓釜中，180℃水熱反應5 h，待反應冷卻至室溫下，溶液由無色變?yōu)楹谧厣?，表明GCDs的形成。將溶液以13 000 r·min－1離心10 min，除去沉淀，上清液采用0.22 μm 有機膜過濾，然后在超純水中用透析袋透析24 h（透析液每6 h 更換一次），去除雜質(zhì)，最后冷凍干燥得GCDs 固體粉末。

2.2 量子產(chǎn)率計算

量子產(chǎn)率（quantun yield，QY）是指激發(fā)態(tài)分子因受激發(fā)，發(fā)射熒光躍遷到基態(tài)的分子與所有激發(fā)態(tài)分子的比例，它是衡量GCDs 性能的重要指標。QY通常采用參比法進行檢測，本實驗選用硫酸奎寧作為熒光對照品（λex＝360 nm，QY＝54%），將其溶于0.1 mol·L－1H2SO4作為參比物質(zhì)，根據(jù)以下公式計算GCDs 的QY。

QYC和QYS分別表示GCDs 和硫酸奎寧的量子產(chǎn)率；I代表相同激發(fā)波長下的積分熒光強度；ηC和ηS分別表示GCDs 和硫酸奎寧的溶劑折射率；AC和AS分別表示GCDs 和硫酸奎寧在相同激發(fā)波長下的紫外吸光度。

2.3 GCDs 的細胞毒性評價

分別取對數(shù)期生長的RAW 264.7 細胞和Bel 7402細胞，以1×105/孔的細胞密度接種于96 孔板中，于細胞培養(yǎng)箱內(nèi)5% CO2、37℃培養(yǎng)24 h 后棄去培養(yǎng)基。加入200 μL 無血清培養(yǎng)基稀釋的300、250、200、150、100 μg·mL－1GCDs 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)細胞24 h 后，在避光條件下每孔加入20 μL MTT 溶液（現(xiàn)配現(xiàn)用），于細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h。隨后吸凈上層培養(yǎng)液，每孔平行加入150 μL 二甲基亞砜（DMSO），置于搖床上緩慢震蕩10 min 至藍紫色結(jié)晶溶解，使用酶標儀于490 nm 波長處檢測吸光度（OD）值。

3 結(jié)果與討論

3.1 TEM 表征

取適量GCDs 粉末，溶于少量超純水中加以稀釋，并滴加于超薄碳膜上風干過夜。待樣品完全干燥后，于透射電子顯微鏡下觀察GCDs 的形貌和尺寸。結(jié)果如圖2所示，GCDs 在水溶液中為球形，分散均勻，平均粒徑為3.33 nm。

圖2 GCDs 的透射電鏡TEM 圖（A）及粒徑分布圖（B）Fig 2 Transmission electron micrograph（TEM）diagram（A）and particle size distribution diagram（B）of GCDs

3.2 FT-IR 分析

圖3所示為藤黃原材料及其衍生碳點GCDs 的FT-IR 譜圖。由圖可見GCDs 與原料藤黃相比在3400 cm－1左右的吸收峰變寬，1450 ～1750 cm－1的吸收峰減少，其中3399 cm－1的寬吸收峰是羧酸上羥基的伸縮振動峰[27]，2936 cm－1、1566 cm－1處的吸收峰分別為亞甲基結(jié)構(gòu)的伸縮振動和不對稱面內(nèi)彎曲振動，1394 cm－1處的吸收峰為甲基的對稱面內(nèi)彎曲振動，1101 cm－1的弱吸收峰歸因于酚羥基碳氧鍵的伸縮振動，綜上表明新的納米材料GCDs 的形成。

圖3 藤黃及其衍生碳量子點的紅外光譜圖Fig 3 FT-IR spectrum of gamboge and GCDs

3.3 XPS 分析

通過XPS 元素對GCDs 的化學成分和表面含有的化學鍵進行分析[28]，結(jié)果如圖4A 所示，GCDs的主要吸收峰分別對應著C 1s、O 1s 等元素，鍵能分別為285.08、532.08 eV，其中C、O 含量比例占據(jù)主導，即藤黃為該碳量子點的主要骨架。隨后對XPS 的主要吸收峰進行分峰處理，結(jié)果如圖4B、4C 所示。圖4B 為C 1s 的分峰圖，主要鍵能分別為284.8、286.47、288.12 eV，分別對應C ＝C/C-C、C-O/C-OH、O-C＝O 鍵[29]。圖4C 為O 1s 的分峰圖，主要鍵能分別為531.10、532.78、535.62 eV，分別對應C ＝O、C-O-C/C-OH、O-C ＝O 鍵[30]。這些結(jié)果與紅外圖譜分析相一致，綜上分析結(jié)果表明，該碳點表面含有羥基等親水性官能團，使其在水中易于分散，提高水溶性，改善了藤黃的疏水性能。

圖4 GCDs 的XPS 總譜（A）和高分辨率C 1s（B）和O 1s（C）譜圖Fig 4 XPS survey spectrum（A）and high resolution（B）C 1s and（C）O 1s of GCDs

3.4 熒光光譜及UV-Vis 分析

將GCDs 粉末溶解于超純水中，稀釋至適宜濃度后置于比色皿中，使用紫外和熒光分光光度計進行掃描檢測，記錄GCDs 的紫外及熒光光譜，結(jié)果見圖5。GCDs 的紫外-可見光吸收光譜，GCDs在297 nm 處有特征吸收峰，對應于GCDs 上C ＝C 鍵π-π*躍遷。此外，GCDs 溶液最大激發(fā)波長在367 nm，發(fā)射波長位于455 nm，如圖5A 所示，且在日光下為淺黃色液體，在365 nm 紫外燈照射下發(fā)出藍色熒光，與CIE 色相圖5B 相一致。

圖5 GCDs 的紫外吸收和熒光光譜圖（A）及CIE 圖（B）Fig 5 UV-Vis absorption and fluorescence spectra of GCDs（A）and CIE diagram（B）

3.5 熒光穩(wěn)定性分析

3.5.1 濃度穩(wěn)定性 通過對碳量子點溶液濃度考察，選擇合適的濃度用以熒光檢測，結(jié)果如圖6所示，隨著GCDs 的濃度增大，熒光強度先增加后降低，推測濃度過高導致熒光降低可能是由于激發(fā)分子碰撞概率增加及自吸收加強，導致熒光發(fā)生淬滅[31]。當碳量子點溶液質(zhì)量濃度在0.5 mg·mL－1時，熒光強度最大。

圖6 GCDs 濃度穩(wěn)定性Fig 6 Concentration stability of GCDs

3.5.2 激發(fā)波長穩(wěn)定性 利用熒光分光光度計在激發(fā)波長300 ～400 nm 間進行檢測，熒光譜圖如圖7。由圖7A 可以看出，隨著激發(fā)波長的增加，熒光強度先增加后降低。由圖7B 可以看出，隨著激發(fā)波長的增加，發(fā)射峰位置發(fā)生明顯紅移，說明該碳量子點具有典型的激發(fā)波長依賴性熒光特性，這可能與GCDs 的不同粒徑分布和不同表面態(tài)有關(guān)。通過參比法可知該碳點的熒光量子產(chǎn)率為0.4%。

圖7 激發(fā)波長在300 ～400 nm 的GCDs 的熒光光譜圖（A）和歸一化熒光光譜圖（B）Fig 7 Fluorescence spectra of GCDs with excitation wavelength of 300～400 nm（A）and corresponding normalized fluorescence spectra（B）

3.5.3 離子強度穩(wěn)定性 通過配制不同濃度梯度的NaCl 溶液（0.2 ～2 mol·L－1），加入等體積的GCDs 溶液，于最佳激發(fā)波長下測定熒光發(fā)射光譜（F表示加入NaCl 后的溶液熒光強度，F(xiàn)0表示未加入NaCl 溶液的熒光強度），結(jié)果如圖8所示，隨著NaCl 溶液濃度的增加，碳量子點的熒光強度沒有受到過大的波動，即該量子點不易受到離子強度的影響，在NaCl 溶液中可保持良好的熒光穩(wěn)定性。

圖8 不同氯化鈉濃度下的GCDs 熒光強度（ ±s，n ＝3）Fig 8 Fluorescence intensity of GCDs under different sodium chloride concentrations（ ±s，n ＝3）

3.5.4 pH 穩(wěn)定性 為進一步研究GCDs 對于介質(zhì)pH 的敏感性，考察了其在pH 1 ～14 的溶液中熒光強度變化。結(jié)果如圖9可知，隨著pH 的增大，溶液堿性越強，熒光強度越高。這一特性可能是因為GCDs 表面基團在酸性條件下容易發(fā)生氫鍵締合作用，使GCDs 產(chǎn)生聚集現(xiàn)象，導致熒光淬滅，而在堿性條件下，容易發(fā)生解離或電荷轉(zhuǎn)移，出現(xiàn)去質(zhì)子化現(xiàn)象，使得GCDs 表面帶上負電荷，分子之間產(chǎn)生靜電排斥作用呈現(xiàn)單分散，熒光強度增加?；诖藀H 敏感性效應，可用于腫瘤檢測方面，因為通常情況下腫瘤細胞內(nèi)的pH 呈現(xiàn)酸性，而正常細胞為中性，利用GCDs 在酸性條件下熒光強度減弱的特性，來檢測腫瘤細胞的位置和狀態(tài)。

圖9 不同pH 條件下的GCDs 熒光強度Fig 9 Fluorescence intensity of GCDs under different pH conditions

3.5.5 不同金屬陽離子對碳量子點熒光穩(wěn)定性的影響 取等體積的碳量子點溶液，分別加入濃度均 為50 μmol·L－1的K＋、Na＋、Mg2＋、Ba2＋、Ca2＋、Zn2＋、Mn2＋常見金屬離子，在最佳激發(fā)波長下測定其發(fā)射光譜，以未加金屬離子的作為對照組，然后以熒光強度（F/F0）對不同金屬離子作圖（F表示加入金屬離子后的溶液熒光強度，F(xiàn)0表示未加入金屬離子的溶液熒光強度），通過對碳量子點在各種常見金屬離子中的穩(wěn)定性進行考察發(fā)現(xiàn)（見圖10），當加入這些金屬陽離子后，熒光強度大都保持在0.9 以上，即可以穩(wěn)定存在于各種金屬離子中，不會對其熒光強度產(chǎn)生猝滅現(xiàn)象，具有良好的穩(wěn)定性和抗外界干擾能力。

圖10 GCDs 在常見金屬離子中的穩(wěn)定性（ ±s，n ＝3）Fig 10 Stability of GCDs in common metal ions（ ±s，n ＝3）

3.5.6 氙燈照射時間穩(wěn)定性 為了研究GCDs 對外界環(huán)境的抗干擾能力，配制一定濃度的GCDs溶液，置于氙燈下照射30 min，觀察GCDs 熒光強度變化，結(jié)果如圖11 所示，可明顯看到GCDs的熒光強度趨于平衡，波動較小，說明該方法制備的GCDs 具有良好的抗光干擾性能。

圖11 GCDs 在氙燈照射下的熒光穩(wěn)定性Fig 11 Fluorescence stability of GCDs under xenon lamp irradiation

3.6 細胞毒性評價

通過MTT 細胞毒性研究觀察GCDs 對小鼠巨噬細胞RAW 264.7 和人肝癌細胞Bel 7402 的作用，結(jié)果如圖12 所示，GCDs 在100 ～300 μg mL－1時對小鼠正常免疫細胞呈現(xiàn)較低的細胞毒性，細胞存活率在75%以上，而對于腫瘤細胞而言，GCDs 在低濃度100 μg·mL－1時無明顯的細胞毒性，在150 ～300 μg·mL－1時隨著劑量增加，細胞存活率逐漸降低，具有一定的細胞毒性，當濃度高于200 μg·mL－1時細胞存活率降低至50%以下，其IC50為199.1 μg·mL－1，綜上結(jié)果表明GCDs 對正常細胞毒性較低，而對腫瘤細胞產(chǎn)生明顯的抑制增殖作用，即可保留原料藤黃抗腫瘤活性的同時降低其高毒性，推測這一現(xiàn)象可能是由于原材料在水熱反應過程中發(fā)生重構(gòu)，形成新成分碳量子點，而該碳量子點表面的活性官能團是其發(fā)生選擇性細胞毒性的主要原因[32]。

圖12 GCDs 對RAW 264.7、Bel 7402細胞存活率的影響（ ±s，n＝3）Fig 12 Effect of GCDs on the cell viability of RAW 264.7 and Bel 7402 cells（ ±s，n ＝3）

4 結(jié)論

本研究從藤黃炮制角度出發(fā)，考慮到炮制過程與碳量子點合成途徑相似，利用堿摻雜法，首次以藤黃為原料，通過一步水熱反應合成具有熒光特性的藤黃衍生碳量子點，通過TEM、FT-IR、熒光分光光度計及XPS 等對其進行了一系列表征發(fā)現(xiàn)GCDs 具有極好的水溶性和優(yōu)異的光致發(fā)光性。通過細胞毒性實驗，發(fā)現(xiàn)GCDs 對腫瘤細胞表現(xiàn)出優(yōu)異的抑制效率，呈現(xiàn)抗腫瘤作用而對正常免疫細胞僅表現(xiàn)出輕微的細胞毒性，表明該GCDs 可大大降低原料藤黃的高毒性，改善藥理活性，這為后期進一步研究其抗腫瘤活性機制提供一定的基礎。