李銳婷，李麗云，孫文強，丁江生**

(1.云南中醫(yī)藥大學，云南 昆明 650500；2.云南省藥物研究所，云南 昆明 650111；3.云南省中藥和民族藥新藥創(chuàng)制企業(yè)重點實驗室，云南 昆明 650111)

Fund: Supported by Yunnan Special Resources Health Food and Functional Food Development Project (2019DC008)

Keywords:bulleyaconitine A; dissolving microneedle; HPLC; content determination

草烏甲素為毛茛科烏頭屬植物龍頭烏頭(Aconitum Longtounense T.L.Ming)中提取分離出來的二萜雙酯生物堿，又名滇西嘟拉堿甲(bulleyaconitine A) 。草烏甲素具有良好的鎮(zhèn)痛、抗炎及免疫調節(jié)作用，是我國自主研發(fā)的新型第三類鎮(zhèn)痛藥物，其鎮(zhèn)痛作用分別是嗎啡的65倍和阿司匹林的7000倍，較非甾體消炎鎮(zhèn)痛藥和阿片類鎮(zhèn)痛藥有顯著的無耐受性、成癮性優(yōu)勢[1]。

微針(microneedle)是指直徑小于幾十微米、長度為25～2 000 μm 的針狀結構[2]，是一種新型的透皮給藥系統(tǒng)，通過刺穿皮膚上層組織進行給藥，無破壞性皮膚損傷和疼痛感?？扇苄晕⑨?Dissolving Microneedle，DMN)是微針中的一類，由水溶性高分子材料制備而成，具有給藥效率高、安全性好、生物相容性好等優(yōu)勢，現(xiàn)已廣泛用于多種藥物的經(jīng)皮給藥研究，如小分子藥物[3-4]、大分子類藥物[5]、疫苗[6]等。本課題組選取草烏甲素為模型藥物，以聚乙烯吡咯烷酮(PVP K30)和透明質酸(HA)為基質，制備具有鎮(zhèn)痛作用的可溶性微針。

目前，HPLC法已廣泛用于各種藥物的定量分析，但采用HPLC法測定可溶微針貼片中藥物含量的報道較少[7-8]。本實驗采用HPLC法測定可溶性微針貼片中草烏甲素的含量，旨在建立一種準確可行的含量分析方法，為后續(xù)可溶性微針的質量研究奠定基礎。

1 儀器、試藥與試劑

1.1 儀器

高效液相色譜儀(Agilent 1260，美國Agilent公司)；紫外可見光分光光度計(Evolution 300，賽默飛世爾公司)；電子天平(EX 125 ZH，奧豪斯儀器有限公司)；電子天平(1225020258，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；超純水機(ADVANTAG A10， 默克密理博)。

1.2 試藥與試劑

草烏甲素可溶性微針貼片(本研究組自制) ；草烏甲素對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：100530-201502,純度：99.5%)；透明質酸(HA，華熙福瑞達生物醫(yī)藥有限公司，批號：1906173)；聚乙烯基吡咯烷酮(PVP K30，博愛新開源醫(yī)療科技集團股份有限公司，批號：C200210012)；乙腈為色譜級，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Ecosil 120-5-C18EPS(5 μm，4.6×250 mm)；流動相：0.2%三乙胺(磷酸調pH值3.1±0.1)-乙腈(體積比，60∶40)；檢測波長為260 nm；流速：1.0 mL/min；進樣體積：20 μL；柱溫：30 ℃。理論塔板數(shù)按草烏甲素峰計算不低于3 000。

2.2 溶液的制備

2.2.1 草烏甲素對照品溶液的制備

精密稱取草烏甲素對照品粉末20.02 mg，置于100 mL容量瓶中，使用混合均勻的流動相溶液溶解并定容至刻度，作為對照品貯備溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備

將自制的草烏甲素可溶性微針每片溶于1 mL 35%的乙醇中，溶解完全后作為供試品溶液。

2.2.3 陰性溶液的制備

精密稱取PVP K30 0.300 g、HA 0.200 g，置于10 mL容量瓶中，使用35%的乙醇溶解、定容，分別制成30.00 mg/mL、20.00 mg/mL的溶液。

2.3 專屬性考察

取 2.2 項下對照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液，按 2.1項下方法進樣測定，結果見圖1。結果顯示，目標成分分離效果好，陰性樣品溶液在對照品溶液和供試品溶液色譜峰相應保留時間處均無吸收峰，表明該方法專屬性強。

2.4 線性關系考察

精密吸取2.2.1下的溶液0.1 mL，0.25 mL，0.5 mL，1.0 mL，2.5 mL，5.0 mL，7.5 mL，10.0 mL分別置于10 mL容量瓶中，加流動相溶液定容。高效液相色譜儀進樣分析，記錄色譜圖，以草烏甲素對照品濃度(μg/mL)為橫坐標，對照品溶液峰面積為縱坐標，進行線性回歸，結果如圖2所示，得到Y= 32.942X- 34.539，R2=0.999 7(n=8)。結果表明，草烏甲素對照品溶液在2.002～200.200 μg/mL濃度范圍內，與峰面積呈良好的線性關系。

A.草烏甲素對照品溶液色譜圖；B.HA溶液色譜圖；C.PVP K30溶液色譜圖； D.草烏甲素可溶性微針溶液色譜圖圖1 草烏甲素、PVP K30、HA、草烏甲素可溶性微針專屬性試驗色譜圖

圖2 草烏甲素對照品溶液線性回歸曲線

2.5 精密度實驗

2.5.1 日內精密度

取2.4項下配制的濃度為20.02，50.05，100.10 μg/mL的草烏甲素對照品溶液，按 2.1 項下色譜條件連續(xù)測定3次，記錄峰面積。結果如表1所示，3個濃度的草烏甲素對照品溶液日內精密度較好，平均 RSD 值為0.11%。

表1 草烏甲素的日內精密度檢測

2.5.2 日間精密度

取濃度為 20.02，50.05，100.10 μg/mL 的草烏甲素對照品溶液，按2.1項下的色譜條件，于 3 d 內每天的相同時段連續(xù)進樣3次，記錄色譜圖。結果如表2所示，3個質量濃度的日間精密度良好，平均RSD值為0.49%。

表2草烏甲素的日間精密度檢測

2.6 加樣回收率實驗

精密量取2.2.3項的HA、PVP K30溶液各0.5 mL制成空白輔料溶液，保持混合輔料濃度不變，加入2.2.1中配制的草烏甲素對照品溶液，分別配制成含草烏甲素對照品質量濃度為40.040，50.045，60.060 μg/mL的溶液，將藥物和輔料的混合溶液過濾后注入高效液相色譜儀進樣分析，記錄峰面積，代入回歸方程計算濃度。結果如表3所示，草烏甲素的平均加樣回收率在98.78%～100.24%，平均RSD值為0.48%。

表3 草烏甲素加樣回收率實驗

2.7 重復性試驗

取自制同一批號(20201021)的草烏甲素可溶性微針貼片6片，完全溶解于1 mL 35%乙醇中，過濾后按2.1項的色譜條件進樣，計算每片可溶微針貼片中草烏甲素的載藥量。結果得出平均每片可溶微針貼片中草烏甲素的質量為101.48 μg，RSD 為0.59%(n=6)，表明方法重復性良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗

取2.7項下某一可溶微針貼片溶液，分別于 0，1，2，4，6，8，10，12，24 h 時間點進樣，測定峰面積。草烏甲素可溶性微針貼片溶液8個時間點的峰面積RSD 值為0.10%(n=8)，表明該供試品溶液在24 h內穩(wěn)定。

2.9 樣品含量的測定

取3個不同批次的草烏甲素可溶性微針，各兩片，按“2.2.2”項下的供試品制備方法制備溶液，按“2.1”項的方法進行測定，計算含量。結果見表4，不同批次的草烏甲素可溶性微針含量在100.28～104.63 μg范圍內。

表4 不同批次的草烏甲素可溶性微針質量測定

3 討論

草烏甲素不溶于水，易溶于乙醇、乙醚、稀鹽酸等有機溶劑。為減少草烏甲素可溶性微針透皮給藥過程中對皮膚的損傷，本研究采用乙醇作為溶劑，對不同的乙醇(35%，55%，75%)進行研究。因HA不溶于乙醇，為保證輔料均能全部溶解，本研究選擇采用低濃度的乙醇作為溶劑。

實驗前期采用紫外可見分光光度計對草烏甲素對照品溶液在200～900 nm 進行全光譜掃描，結果發(fā)現(xiàn)草烏甲素在260 nm 處有最大吸收，與《中國藥典》2020版二部中的草烏甲素質量標準檢查中的檢測波長一致[9]，且使用HPLC檢測藥物含量時輔料PVP K30、HA 在260 nm處對草烏甲素峰無干擾，專屬性良好，故檢測波長選擇260 nm。

本研究建立了利用HPLC測定可溶微針中草烏甲素含量的方法，此方法簡單可行，專屬性強、精密度良好、重復性較好，結果可靠。目前，國內外藥典均未有微針的相關質量標準，本文可作為評價草烏甲素可溶微針貼片的質量方法，為鎮(zhèn)痛可溶性微針貼片的研究提供方法依據(jù)。