張安龍 王哲毅 王雪青， 羅 清 張仕南

（1.陜西科技大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，陜西西安，710021；2.陜西科技大學(xué)輕工科學(xué)與工程學(xué)院，輕化工程國家級實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，陜西西安，710021；3.西安隆華環(huán)保技術(shù)有限公司，陜西西安，710019）

竹材制漿企業(yè)多采用化學(xué)法制漿，其工業(yè)廢水主要由蒸煮過程中產(chǎn)生的糖類、有機(jī)酸、氨基酸、類黃酮、單寧和光敏色素等組成[1]?；瘜W(xué)竹漿廢水組成復(fù)雜，且排放量大，濃度和色度高[2-4]，處理困難。一般使用物理、化學(xué)和厭氧、好氧聯(lián)合的方法來處理造紙廢水[5]，如絮凝沉淀[6]結(jié)合生物酶處理法[7]。隨著科技水平的不斷提升，對于工藝的研究亦不斷深入，盡管當(dāng)前已經(jīng)取得了不錯(cuò)的進(jìn)展，但受到技術(shù)水平的制約，尚有很多問題亟待解決；尤其是對關(guān)鍵的微生物群落結(jié)構(gòu)了解還不夠深入，使對此類廢水的處理效率不能得到有效提升，從而使后端深度處理的成本偏高[8]。使用生物強(qiáng)化技術(shù)可提高難降解有機(jī)物的去除效率，對菌種進(jìn)行篩選或?qū)⒕N進(jìn)行基因改造形成高效降解菌并加入到系統(tǒng)內(nèi)，可有效處理特定種類的有害物質(zhì)。對于微生物群落結(jié)構(gòu)的深入研究將有利于提高特征污染物的去除效率。

生物處理單元中復(fù)雜的微生物群落結(jié)構(gòu)對于廢水處理有指導(dǎo)作用，尤其是厭氧處理。邢雅娟等人[9]研究了UMIC 反應(yīng)器微生物的縱向分布，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌的多樣性高于古菌，且反應(yīng)器的空間維度也會(huì)影響微生物的菌落結(jié)構(gòu)。易敏等人[10]比較了廢紙制漿廢水與蔗渣噴淋廢水厭氧顆粒污泥中的微生物群落，結(jié)果表明細(xì)菌的種類和豐度受底物成分及周圍理化環(huán)境（包括重金屬成分）影響較大。郭建國等人[11]比較了蘆葦制漿造紙廢水的細(xì)菌群落變化，優(yōu)勢菌由γ變形菌和衣原體變?yōu)棣磷冃尉f明微生物群落構(gòu)成及其多樣性在不同的外界環(huán)境調(diào)控下會(huì)隨時(shí)間進(jìn)行動(dòng)態(tài)演變。

Xia 等人[12]利用454 高通量測序，使用厭氧膜生物反應(yīng)器和竹炭增強(qiáng)的厭氧膜生物反應(yīng)器處理竹漿制漿廢水的古菌群落，發(fā)現(xiàn)此系統(tǒng)中甲烷螺旋菌和甲烷細(xì)菌在甲烷生產(chǎn)中占主導(dǎo)地位；竹炭的增加提高了微生物多樣性，促進(jìn)了甲烷菌體的活性，提高了系統(tǒng)的COD 去除率和甲烷生成率。劉春等人[13]對EGSB 反應(yīng)器處理竹漿制漿廢水的過程和啟動(dòng)規(guī)律進(jìn)行分析，但并未對群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析。厭氧處理雖然起著重要作用，但好氧處理的出水水質(zhì)決定著深度處理的成本。Liang 等人[14]以楊木化機(jī)漿制漿廢水為目標(biāo)，研究了EGSB 反應(yīng)器和曝氣活性污泥的微生物群落結(jié)構(gòu)；在EGSB 反應(yīng)器中，優(yōu)勢菌為Euryarchaeota，豐度為40.5%，曝氣活性污泥的優(yōu)勢菌門為放線菌門和變形菌門，豐度分別為40.0%和28.6%。實(shí)際化學(xué)竹漿廢水進(jìn)水COD 較低，常見的處理方法為活性污泥法，處理率及成本受其菌群的復(fù)雜性及多樣性影響較大，然而現(xiàn)階段對化學(xué)竹漿廢水活性污泥菌群結(jié)構(gòu)及生物多樣性的研究仍未見報(bào)道。

因此，本研究針對4 個(gè)不同化學(xué)竹漿廢水處理廠樣品，使用超高通量基因組454高通量測序技術(shù)，對其菌群結(jié)構(gòu)及生物多樣性進(jìn)行研究，旨在為當(dāng)前的微生物法處理難降解有機(jī)物中微生物種群結(jié)構(gòu)調(diào)控提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

活性污泥取自4 個(gè)不同化學(xué)竹漿廢水處理廠（永豐紙業(yè)股份有限公司、永豐漿紙股份有限公司、鳳生紙業(yè)科技股份有限公司、金福紙品有限責(zé)任公司），處理工藝分別為水解+好氧、好氧（流量1200 m3/h）、好氧（流量800 m3/h）、ABR（厭氧折流板反應(yīng)器）+好氧（以好氧為主），編號分別為1#～4#?；瘜W(xué)竹漿廢水CODCr含量為500～1500 mg/L，停留時(shí)間為24～32 h。具體指標(biāo)如表1所示。

表1 化學(xué)竹漿廢水主要水質(zhì)指標(biāo)和好氧單元工藝參數(shù)Table 1 Main water quality indexes and oxygen unit process parameters of chemical bamboo pulp wastewater

1.2 污泥細(xì)菌總DNA提取、PCR和16SrDNA測序

將樣品在-20℃下冷凍保存，加干冰運(yùn)輸至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）擴(kuò)增和16SrDNA 測序。細(xì)菌總DNA 的提取工作利用E.Z.N.A.? soil 試劑盒完成；利用338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）和806R （5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）引物對V3-V4 可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增；擴(kuò)增程序?yàn)?5℃預(yù)變性3 min，27個(gè)循環(huán)（95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s），72℃延伸10 min（PCR 儀：ABI GeneAmp?9700 型）；擴(kuò)增體系為20 μL，4 μL 5×FastPfu 緩沖液，2 μL 2.5 mmol/L dNTPs，0.8 μL 引物，0.4 μL FastPfu 聚合酶，10 ng DNA 模板。各樣品進(jìn)行PCR 擴(kuò)增后，再通過Miseq PE300 進(jìn)行測序。通過Trimmomatic 對原始序列數(shù)據(jù)進(jìn)行操控，使用FLASH 軟件進(jìn)行拼接。使用UPARSE 軟件，基于OUT 聚類使用97%的相似度對序列進(jìn)行操作，之后在該過程中將單序列及嵌合體排除，利用RDP classifier將所有序列中的物種標(biāo)注，并針對Silva 數(shù)據(jù)庫（SSU123）進(jìn)行考量，將比對閾值設(shè)為70%。

2 結(jié)果與討論

2.1 細(xì)菌群落多樣性分析

將1#～4#樣品利用PCR 擴(kuò)增和高通量測序后，得到的有效測序條帶在29116～48573 之間。同時(shí)，為保證研究有效的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)豐富度，對其中97%相似水平序列進(jìn)行多樣化研究，具體指標(biāo)參照表2。由表2可知，4個(gè)樣品的平均覆蓋率均能達(dá)到99%以上，說明絕大多數(shù)菌群已經(jīng)被檢測出來。OUTs（Operational Taxonomic Units）值，反映各菌群樣本的多樣性高低水平[15]。本研究中4個(gè)樣品生物分類單元OTUs分別為992、848、878 和692；Liang 等人[14]在研究楊木化機(jī)漿廢水曝氣反應(yīng)器中的菌落結(jié)構(gòu)時(shí)，得出其OUTs 達(dá)到1098，與本研究中1#樣品的數(shù)值相當(dāng)，說明竹漿廢水和楊木化機(jī)漿廢水中的菌群樣本的多樣性基本相當(dāng)。香農(nóng)指數(shù)是菌落多樣性的另一個(gè)衡量參數(shù)[16]，其數(shù)值越高，則表示該樣本菌群的微生物多樣性越高；4 個(gè)樣品香農(nóng)指數(shù)分別為5.13、4.87、5.19和4.48，與OUTs 值所反映出的微生物多樣性水平相一致。ACE 指數(shù)和Chao1指數(shù)均是衡量物種豐度的參數(shù)，即用來評估物種數(shù)目的多少，其數(shù)值越大，則表示其物種總數(shù)越多[17]。4 個(gè)樣品的ACE 指數(shù)區(qū)間為767.80～1066.15，Chao1 指數(shù)區(qū)間為769.70～1048.37。這是由于不同的竹漿廢水處理廠的處理手段和工藝不同，其群落多樣性也具有明顯的差異化。不同造紙?jiān)袭a(chǎn)生的廢水，由于進(jìn)水水質(zhì)的差異，進(jìn)一步導(dǎo)致了微生物群落結(jié)構(gòu)的差異顯著化。

圖1為細(xì)菌群落豐度稀釋曲線圖。由圖1 可知，隨著測序的不斷增多，新菌群不斷被發(fā)掘，因此OTUs（圖1(a)）及香農(nóng)指數(shù)（圖1(b)）均有著較為明顯的增加；在測序帶數(shù)量超過20000 時(shí)，OTUs 稀釋曲線末端出現(xiàn)一定程度地緩和，而香農(nóng)指數(shù)稀釋曲線不再發(fā)生明顯變化，表明此次研究的序列深度能夠?qū)航Y(jié)構(gòu)進(jìn)行有效描述。

圖1 細(xì)菌群落豐度稀釋曲線Fig.1 Rarefaction curves of bacterial community abundance

表2 細(xì)菌群落多樣性指數(shù)Table 2 Bacterial community diversity indices

針對細(xì)菌多樣性指數(shù)和豐度稀釋曲線進(jìn)行分析可知，化學(xué)竹漿廢水活性污泥細(xì)菌群落不同，且差異化較為明顯。圖2 為聚類分析熱圖及主成分分析圖。聚類分析熱圖中，種屬距離的遠(yuǎn)近用顏色的深度表示；其中距離的遠(yuǎn)近用紅色及綠色代表，紅色越深則說明距離越遠(yuǎn)則其相似度也越低。分析發(fā)現(xiàn)3#樣品與其他3 種樣品間均存在明顯差異且差異值最為顯著。而3#樣品的香農(nóng)指數(shù)也最大，說明3#樣品的微生物不僅具有較高的多樣性，而且種間差異較為顯著。通過對主成分進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，所有樣品菌落結(jié)構(gòu)的分布均在3 個(gè)不同象限內(nèi)，1#樣品與4#樣品位于同一象限，但距離相對較遠(yuǎn)，可充分說明其結(jié)構(gòu)差距較為顯著。菌落結(jié)構(gòu)種間差異（種間距離）的大小也反應(yīng)了水質(zhì)成分的復(fù)雜程度，這主要是因?yàn)椴煌M(jìn)水的污染負(fù)荷，經(jīng)過物理水解酸化及厭氧處理后，使廢水中的部分大分子物質(zhì)變?yōu)樾》肿游镔|(zhì)，進(jìn)一步增加了廢水成分的復(fù)雜程度，使各種菌屬在不同污染物（部分作為微生物生長的抑制物）的不斷選擇馴化中，群落結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出很大程度的差異性。2#樣品距離其他樣品較遠(yuǎn)，且其進(jìn)水CODCr值（表1）最高，進(jìn)一步說明進(jìn)水水質(zhì)會(huì)直接影響細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。

圖2 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)聚類分析熱圖和主成分分析圖Fig.2 Cluster analysis and principal component analysis of bacterial community structure

2.2 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)門水平上的組成和豐度

圖3 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)門水平上的組成Fig.3 Bacterial community composition at phylum level

通過RDP classifier軟件對檢測后的序列進(jìn)行物種分類，圖3 表示菌群結(jié)構(gòu)在門水平上的組成和豐度。從圖3可以看出，4個(gè)樣品的優(yōu)勢門主要有變形菌門、綠彎菌門、擬桿菌門和放線菌門，這與趙婷婷等人[18]的分析成果相似。在廢水處理中，變形菌門具有重要作用，且其豐度在4個(gè)樣品中的所有優(yōu)勢門中也最高（59.47%），因此得到了廣泛關(guān)注[19-21]。綠彎菌門、擬桿菌門和放線菌門為活性污泥細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)中的優(yōu)勢門，其豐度分別為10.08%～21.66%、5.14%～18.34%、3.59%～18.86%；綠彎菌門在4個(gè)樣品中的豐度分別為10.87%、21.66%、14.13%和10.08%，這與Mclellan等人[22]的研究結(jié)果一致。4 個(gè)樣品中放線菌門豐度分別為4.03%、3.59%、18.86%和4.56%；厚壁菌門豐度分別為1.95%、1.18%、7.87%和0.36%，而有研究表明其在市政活性污泥中的豐度可達(dá)19%[23]。盡管已將4個(gè)樣品中大部分細(xì)菌門類鑒定出，然而受技術(shù)水平限制，仍有部分門類未被鑒定出，其豐度占比分別為2.51%、1.84%、1.93%和0.89%。Liang 等人[14]對楊木化機(jī)漿廢水好氧處理系統(tǒng)中的微生物群落進(jìn)行分析，得出放線菌門的豐度為40.0%，變形菌門的豐度為28.6%；本文中放線菌門的豐度為55.89%，變形菌門的豐度為59.48%。因此同樣是造紙廢水，楊木化機(jī)漿與竹漿廢水優(yōu)勢菌門類豐度具有較大差異。綜上所述，竹漿廢水與其他的造紙廢水微生物菌落分布有本質(zhì)區(qū)別，主要原因是原料不同而導(dǎo)致廢水中碳源、氮源的比例不同，以及廢水中不同抑制物對微生物種群具有特定選擇性。

2.3 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)目水平上的組成和豐度

在目水平上進(jìn)行分類（每種目的豐度應(yīng)至少保持在其中某一個(gè)樣品大于1%），結(jié)果如表3 所示。結(jié)果表明，4個(gè)樣品的前5類優(yōu)勢目不同，1#樣品為Rhizobiales、Betaproteobacteriales、和Caulobacterales，豐度分別為18.79%、13.28%、8.61%、4.81% 和4.43%；2#樣 品 為Calditrichales、Chitinophagales、Rhizobiales、Sphingobacteriales和Caldilineales，豐度分別為9.56%、9.37%、8.15%、6.88%和6.41%；3#樣品為Betaproteobacteriales、Rhizobiales、Bacillales、Kineosporiales和Microtrichales，豐度分別為13.61%、13.52%、7.50%、5.71% 和4.05%；4#樣 品 為Rhizobiales、Betaproteobacteriales、Chitinophagales、Sphingobacteriales和Methylococcales，豐度分別為23.96%、14.61%、8.30%、8.11% 和3.78%。雖然4 個(gè)樣品共享了大多數(shù)的目，然其菌群結(jié)構(gòu)存在明顯差異，如優(yōu)勢目Rhizobiales豐度在4#樣品中為23.96%，在1#樣品中為18.79%，在2#樣品中僅為8.15%。另外，Rhizobiales，Betaproteobacteriales、Chitinophagales在1#和4#樣品中的豐度也基本一致。此結(jié)果與圖2(b)菌落結(jié)構(gòu)的種間差異的分析結(jié)果相吻合。

表3 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)目水平上的組成和豐度Table 3 Bacterial community composition and abundance at order level %

從表1 的化學(xué)竹漿廢水主要水質(zhì)指標(biāo)分析結(jié)果可以看出，1#和4#樣品經(jīng)水解和厭氧處理后進(jìn)水的污染負(fù)荷較低，CODCr含量分別為500～800 mg/L 和500～1000 mg/L，生化處理后CODCr去除率較低。2#樣品的進(jìn)水污染負(fù)荷較高，CODCr含量為1100～1500 mg/L，生化處理后CODCr去除率較高，2 個(gè)優(yōu)勢目Calditrichales和Chitinophagales的豐度分別只占9.56%和9.37%。從圖2（b）的菌落結(jié)構(gòu)的種間差異（種間距離）分析可知，2#廢水的菌落結(jié)構(gòu)差異最為顯著；因此進(jìn)水特征性污染物的濃度及種類的差異可以引起進(jìn)水CODCr含量的不同，從而導(dǎo)致水質(zhì)的根本性差異。處理工藝、水質(zhì)及其他因素（如進(jìn)水原料和地理位置等）均可引起菌群結(jié)構(gòu)的差異，其中廢水水質(zhì)是影響菌落組成的最關(guān)鍵因素[24-25]。

2.4 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)屬水平上的組成和豐度

在屬水平上細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的組成和豐度（每種屬的豐度至少在一個(gè)樣品中不小于1%）如表4 所示。從表4 可以看出，4 個(gè)樣品共享的主要屬為Hyphomicrobium、 Candidatus、 Competibacter、 JdFR-76 和SWB02。其中最大占比屬為生絲微菌屬，豐度為3.69%～18.29%，具有好氧反硝化作用[26]。盡管硝化螺菌屬、Nordella、Terrimonas和Bacillus為非優(yōu)勢菌株，但被4個(gè)樣品所共享。硝化螺菌屬作為硝化細(xì)菌，可將亞硝酸鹽氧化成硝酸鹽，從而促進(jìn)生化系統(tǒng)的脫氮效率。Bacillus作為一種簡易的細(xì)菌，其能夠針對諸如碳系、氮系、磷系、硫系等污染物進(jìn)行有效分解，也可分解蛋白質(zhì)和復(fù)雜多糖，因此對于分解水溶性有機(jī)物有著顯著作用[27]。核心屬為生絲微菌屬、SWB02、Bryobacter和Pedomicrobium，其中Pedomicro-bium可以降解多環(huán)類芳香族化合物，醇類及烷烴類物質(zhì)[28-30]。可能是由于廢紙中污染物相對復(fù)雜，存在相對較多芳香族化合物被富集吸收并降解。若要維持化學(xué)竹漿廢水處理系統(tǒng)的穩(wěn)定性，研究優(yōu)勢微生物的活性和多樣化的群落結(jié)構(gòu)間的相互關(guān)系有著至關(guān)重要的作用，其中構(gòu)成活性污泥的微生物群體較為龐雜，深入探究多菌群的相互影響和協(xié)同作用污水處理最為關(guān)鍵的手段之一。

表4 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)屬水平上的組成和豐度Table 4 Bacterial community composition and abundance at genus level %

3 結(jié)論

3.1 不同化學(xué)竹漿廢水好氧單元活性污泥中，微生物種群的結(jié)構(gòu)差異主要由進(jìn)水水質(zhì)差異和處理工藝的不同，導(dǎo)致其不斷演變而形成了菌落結(jié)構(gòu)的多樣性和差異性。

3.2 化學(xué)竹漿廢水好氧單元活性污泥細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)組成中的優(yōu)勢門為變形菌門、綠彎菌門、擬桿菌門和放線菌門，變形菌門最高豐度為59.47%；核心屬為生絲微菌屬、SWB02、Bryobacter和Pedomicrobium，其中生絲微菌屬占主導(dǎo)地位，豐度為3.69%～18.29%。這些菌屬不僅與硝化、反硝化相關(guān)，還與多環(huán)芳香族類化合物，醇類及烷烴類物質(zhì)的降解直接有關(guān)。