孫錦輝，李春潮，范旋燕，黃 聰，全娟花* （.廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，廣東湛江 5400；.北京大學(xué)深圳醫(yī)院皮膚性病科/皮膚病研究所，廣東深圳 58036）

結(jié)腸癌由遺傳和環(huán)境因素相互作用引起[1]，目前早期癌可予內(nèi)鏡黏膜下剝離術(shù)治療，中晚期癌首選根治性手術(shù)并輔以化療，但腫瘤的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移以及耐藥等問(wèn)題使近30 年結(jié)腸癌的5 年生存率維持在50%～60%。近年來(lái)，腫瘤的靶向治療可特異性作用于特定的分子，且對(duì)正常組織損傷較小，這為結(jié)腸癌的治療提供了新的方向[2]。Gefitinib 是一種酪氨酸激酶受體抑制劑，有研究報(bào)道Gefitinib 對(duì)多種腫瘤有明顯的抑制作用，而正常組織表現(xiàn)出良好的耐受性[3-4]。本研究主要通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)探討Gefitinib 對(duì)Caco-2 細(xì)胞增殖凋亡的影響及其潛在機(jī)制，為其應(yīng)用于結(jié)腸癌的治療提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑與儀器 Gefitinib(美國(guó)Sigma 公司)，人結(jié)腸癌細(xì)胞株Caco-2 購(gòu)于中科院上海細(xì)胞庫(kù)，胎牛血清FBS(烏拉圭Lonsera 公司)，RPMI1640 培養(yǎng)基(美國(guó)HyClone 公司)，100×青霉素/鏈霉素雙抗(美國(guó)Gibco 公司)，胰蛋白酶含0.25% EDTA(美國(guó)Sigma 公司)，10×PBS 緩沖液(美國(guó)Solarbio 公司)，Cell Banker2凍存液(日本ZENOAQ 公司)，MTS(美國(guó)Promega公司)，AnnexinV-FITC/PI 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(日本Dojindo 公司)，Texas RedTM-X Phalloidin 試 劑(美國(guó)Life Technologies 公司)，DAPI (美國(guó) Vector Laboratories 公司)，JC-1 線粒體膜電位試劑盒、免疫染色固定液、免疫染色洗滌液、SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒(中國(guó)碧云天公司)，CETi Lysis Buffer(韓國(guó)Trans Lab 公司)，BCA 試劑盒(中國(guó)Genstar 公司)，0.2 μm PVDF 轉(zhuǎn)印膜(美國(guó)Millipore 公司)，20×TBS(美國(guó)Solarbio 公司)，發(fā)光液(美國(guó)MILLIPORE 公司)，α-Tubulin(美國(guó)SANTA CRUZ 公司)，兔抗IgG-HRP、鼠抗IgG-HRP(美國(guó)Cell Signaling 公司)，p-p38、p38、p-ERK、ERK、p-JNK、JNK、Caspase-3、PARP(美國(guó)Cell Signaling 公司)，超聲細(xì)胞破碎儀(中國(guó)寧波新芝生物公司)，酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo 公司)Azure c500(美國(guó)Azure Biosystems 公司)，熒光顯微鏡(德國(guó)Leica 公司)，流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD 公司)

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將Caco-2 細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%抗菌-抗真菌劑(青霉素、鏈霉素、兩性霉素B)的RPMI1640 培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2環(huán)境下培養(yǎng)，每3 d 更換培養(yǎng)基，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%～90%，用含0.25%-EDTA 胰蛋白酶消化、傳代備用。

1.2.2 MTS 檢測(cè)Gefitinib 對(duì)Caco-2 細(xì)胞增殖的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后，用含10%胎牛血清的培養(yǎng)基配成活細(xì)胞密度為5×103個(gè)/mL 的細(xì)胞懸液，按每孔100 μL 接種于96 孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h 后，更換含濃度為0、2.5、7.5、15、30 μmol/L Gefitinib 的完全培養(yǎng)基，每個(gè)濃度設(shè)4 個(gè)復(fù)孔。處理24、48、72 h 后參照MTS 試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，用酶標(biāo)儀在492 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定各孔吸光值并計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，抑制率(IR)=(對(duì)照組吸光值-實(shí)驗(yàn)組吸光值)/對(duì)照組吸光值，統(tǒng)計(jì)并分析。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Gefitinib 對(duì)Caco-2 細(xì)胞凋亡的作用 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后，用含10%胎牛血清的培養(yǎng)基配成活細(xì)胞密度為3×105個(gè)/mL 的細(xì)胞懸液，接種于6 孔板中，培養(yǎng)24 h 后，更換含濃度為0、2.5、7.5、15、30 μmol/L Gefitinib 的完全培養(yǎng)基，每個(gè)濃度設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。處理48 h 后胰酶消化，收集細(xì)胞，用預(yù)冷PBS 漂洗1 次。Binding Solution 重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/mL，取100 μL 細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至流式管中，各加入FITC-Annexin V 和PI 溶液5 μL，室溫避光孵育30 min 后加Binding Solution 400 μL，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.4 細(xì)胞免疫熒光染色

1.2.4.1 細(xì)胞免疫熒光染色檢測(cè)Gefitinib 對(duì)Caco-2細(xì)胞形態(tài)的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞均勻接種于置有滅菌蓋玻片的12 孔板(2×104個(gè)/孔)培養(yǎng)。用Gefitinib 處理后，取出細(xì)胞爬片，免疫染色固定液室溫固定30 min。0.1% Triton X-100 透化10 min。滴加Texas Red?-X 鬼筆環(huán)肽(1 ∶100 稀釋)暗盒室溫放置30 min，染色細(xì)胞骨架。用DAPI 抗熒光淬滅封片劑封片，倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞并采集圖像。

1.2.4.2 細(xì)胞免疫熒光染色檢測(cè)Gefitinib 對(duì)Caco-2細(xì)胞線粒體膜電位的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞均勻接種于置有滅菌蓋玻片的12 孔板(2×104個(gè)/孔)培養(yǎng)。用Gefitinib 處理后，每孔加入1 mL 配置好的JC-1染色工作液后于細(xì)胞培養(yǎng)箱中37 ℃孵育20 min，用預(yù)冷的JC-1 染色緩沖液洗滌3 次。取出細(xì)胞爬片，用甘油抗熒光淬滅封片劑封片，倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞并采集圖像。

1.2.5 Western-blot 檢測(cè)細(xì)胞MAPK 通路及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Caco-2 細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，細(xì)胞貼壁后，用不同濃度的Gefitinib 處理Caco-2細(xì)胞48 h 后，收集上清液和貼壁細(xì)胞，用CETi Lysis Buffer 蛋白裂解液和超聲細(xì)胞破碎儀裂解提取細(xì)胞蛋白并制備蛋白樣品，進(jìn)行SDS-PAGE 凝膠電泳，將蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF 膜。5%脫脂奶粉封閉液孵育1 h，一抗孵育過(guò)夜，二抗室溫孵育1 h。用Azure Biosystems C500 近紅外成像系統(tǒng)圖像采集并利用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用Graphpad Prism 8.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以±s表示，組間差異采用單因素方差分析(One-way ANOVA)及LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Gefitinib 對(duì)Caco-2 細(xì)胞增殖的影響

不同濃度(0、2.5、7.5、15、30 μmol/L)的Gefitinib處理Caco-2 細(xì)胞24、48、72 h 后，MTS 法檢測(cè)細(xì)胞增殖。結(jié)果顯示，在同一時(shí)間點(diǎn)，Caco-2 細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率隨著Gefitinib 濃度的增加而升高，而且在藥物濃度相同的情況下，Caco-2 細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)而升高，提示Gefitinib 對(duì)Caco-2 細(xì)胞增殖的抑制呈濃度-時(shí)間依賴(lài)性，Caco-2 細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率升高，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)表1、圖1。

表1 不同濃度Gefitinib 處理Caco-2 細(xì)胞的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率（±s，n=3，%)

表1 不同濃度Gefitinib 處理Caco-2 細(xì)胞的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率（±s，n=3，%)

同一時(shí)間點(diǎn)，與0 μmol/L 組比較:aP＜0.01;與2.5 μmol/L 組比較:bP＜0.01;與7.5 μmol/L 組比較:cP＜0.01;與15 μmol/L組比較:dP＜0.01

圖1 各組Caco-2 細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率的變化趨勢(shì)

2.2 Gefitinib 對(duì)Caco-2 細(xì)胞凋亡的作用

以不同濃度(0、2.5、7.5、15、30 μmol/L)的Gefitinib處理Caco-2 細(xì)胞48 h 后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示隨著Gefitinib 濃度的遞增，Caco-2 細(xì)胞的晚期凋亡率(Q2)和早期凋亡率(Q3)呈遞增趨勢(shì)；各實(shí)驗(yàn)組與0 μmol/L 組相比，晚期凋亡率(Q2)、早期凋亡率(Q3)和總凋亡率(Q2+Q3)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，且呈濃度依賴(lài)性。結(jié)果提示Gefitinib 能促進(jìn)Caco-2 細(xì)胞凋亡并呈濃度依賴(lài)性。見(jiàn)表2、圖2。

2.3 免疫熒光染色觀察Gefitinib 對(duì)Caco-2 細(xì)胞凋亡的作用

以不同濃度(0、2.5、7.5、15、30μmol/L)Gefitinib 處理Caco-2 細(xì)胞48 h 后，利用鬼筆環(huán)肽對(duì)細(xì)胞染色。圖3 結(jié)果顯示，0μmol/L 組的細(xì)胞微絲結(jié)構(gòu)分布相對(duì)均勻，相互連成網(wǎng)狀，周?chē)吔缜逦?，有少量微絲觸角，細(xì)胞核橢圓形，邊界清晰，染色均勻。實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞隨著Gefitinib 濃度的遞增，細(xì)胞骨架微絲結(jié)構(gòu)分布不均勻，邊緣模糊，局部可見(jiàn)溶解或斷裂現(xiàn)象，細(xì)胞體積逐漸縮小，細(xì)胞漿濃縮，細(xì)胞核固縮呈均一的團(tuán)塊狀致密物，進(jìn)而斷裂為大小不一的片段。以上提示Gefitinib 可誘導(dǎo)Caco-2 細(xì)胞核碎裂和改變骨架微絲結(jié)構(gòu)及分布。

表2 Gefitinib 處理Caco-2 細(xì)胞48 h 后的Q2、Q3、Q2+Q3凋亡率 (±s，n=3，%)

表2 Gefitinib 處理Caco-2 細(xì)胞48 h 后的Q2、Q3、Q2+Q3凋亡率 (±s，n=3，%)

同一時(shí)間點(diǎn)，與0 μmol/L 組比較:aP＜0.01;與2.5 μmol/L 組比較:bP＜0.01;與7.5 μmol/L 組比較:cP＜0.01;與15 μmol/L組比較:dP＜0.01

圖2 AnnexinV-FITC/PI 雙染法檢測(cè)Gefitinib 對(duì)Caco-2 細(xì)胞凋亡的影響

圖3 免疫熒光染色觀察Gefitinib 處理Caco-2 細(xì)胞核與細(xì)胞骨架微絲結(jié)構(gòu)變化(×400)

2.4 免疫熒光染色觀察Gefitinib 對(duì)Caco-2 細(xì)胞線粒體膜電位的影響

細(xì)胞線粒體膜電位的下降是細(xì)胞凋亡早期的標(biāo)志性事件。在線粒體膜電位較高時(shí)，JC-1 聚集在線粒體的基質(zhì)中，形成聚合物(aggregate)，可產(chǎn)生紅色熒光；在線粒體膜電位較低時(shí)，JC-1 不能聚集在線粒體的基質(zhì)中，此時(shí)JC-1 為單體(monomer)，可產(chǎn)生綠色熒光。以不同濃度(0、2.5、7.5、15、30 μmol/L)Gefitinib處理Caco-2 細(xì)胞48 h 后，JC-1 染色熒光顯微鏡下觀察線粒體膜電位。圖4 結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞隨著Gefitinib 濃度的遞增，紅色熒光逐漸減弱，綠色逐漸增強(qiáng)，提示Gefitinib 可通過(guò)降低Caco-2 細(xì)胞線粒體膜電位從而誘導(dǎo)凋亡。

2.5 Western-blot 檢測(cè)細(xì)胞MAPK 通路相關(guān)蛋白表達(dá)

以不同濃度(0、2.5、7.5、15、30 μmol/L)的Gefitinib處理Caco-2 細(xì)胞48 h 后，Western-blot 檢測(cè)MAPK 信號(hào)通路及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示，Gefitinib 濃度依賴(lài)性顯著上調(diào)p-p38、p-JNK MAPK 通路相關(guān)磷酸化蛋白和Cleaved-PARP 蛋白(89 kDa) 表達(dá)。同時(shí)隨Gefitinib 濃度的增加，磷酸化p-ERK 和凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3(35 kDa)表達(dá)量逐漸下調(diào)。見(jiàn)圖5、6。

圖4 免疫熒光染色觀察Gefitinib 處理Caco-2 細(xì)胞后膜電位變化(×200)

圖5 Gefitinib 處理Caco-2 細(xì)胞中Western-blot 檢測(cè)MAPK 通路及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平

圖6 Gefitinib 處理Caco-2 細(xì)胞中檢測(cè)MAPK 通路及凋亡相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)水平

3 討論

直腸癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤，發(fā)病率及病死率在國(guó)內(nèi)外有逐年上升的趨勢(shì)，目前臨床治療以根治性手術(shù)結(jié)合化療為主，但傳統(tǒng)的放化療效果差，毒性不良反應(yīng)明顯，且細(xì)胞存在耐藥性，患者5 年生存率并不理想[5]。分子靶向治療是近年腫瘤治療的熱點(diǎn)領(lǐng)域，在對(duì)抗腫瘤方面具有較強(qiáng)的針對(duì)性，且對(duì)正常細(xì)胞的毒性不良反應(yīng)相對(duì)較小[6]。

有研究表明EGFR 在結(jié)直腸癌等多種實(shí)體瘤中存在過(guò)表達(dá)或異常表達(dá)的情況，是目前最為主要的靶點(diǎn)之一[7]。Gefitinib 作為EGFR 通路抑制劑，可競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合受體，抑制MAPK 活化，從而抑制腫瘤組織血管生成，并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[3，8]。

細(xì)胞凋亡是指為了維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制細(xì)胞的自主有序的死亡，這是一個(gè)主動(dòng)的過(guò)程，涉及細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化及一系列基因的激活、表達(dá)、調(diào)控等作用[9]。MTS 以及AnnexinV-FITC/PI 雙染檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果提示，在0～30 μmol/L 的濃度范圍和24～72 h 的時(shí)間范圍內(nèi)，Gefitinib 對(duì)Caco-2 細(xì)胞增殖的抑制呈濃度-時(shí)間依賴(lài)性，并且使細(xì)胞早期和晚期凋亡率逐步升高。在細(xì)胞形態(tài)學(xué)方面，本研究的熒光雙標(biāo)記結(jié)果提示，隨著Gefitinib 濃度的遞增，細(xì)胞核固縮破裂，染色質(zhì)皺縮濃集，骨架微絲溶解斷裂，進(jìn)一步驗(yàn)證Gefitinib 能促進(jìn)Caco-2 細(xì)胞凋亡。

細(xì)胞信號(hào)通路是細(xì)胞凋亡的重要調(diào)控機(jī)制。由于細(xì)胞凋亡啟動(dòng)階段的差異，可分為:(1)線粒體通路，受到內(nèi)源性刺激使線粒體膜電位降低，釋放凋亡酶激活因子激活caspase 級(jí)聯(lián)反應(yīng);(2)死亡受體通路，由于外界凋亡信號(hào)啟動(dòng)，TNFR 及其配體介導(dǎo)進(jìn)而激活cspase8 及隨后的級(jí)聯(lián)反應(yīng);(3)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路，由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)失常引起，從而破壞Ca2+平衡和蛋白合成，引起凋亡[10]。

有絲分裂原活化蛋白激酶(MAPK)是一種可被多種信號(hào)激活的絲/蘇氨酸激酶，經(jīng)磷酸化后可參與多種生物活性，如調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞周期、誘導(dǎo)凋亡等[11-12]。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)MAPK 有p38、ERK、ERK5、JNK4個(gè)亞族，其中p38、ERK、JNK3 條通路與腫瘤細(xì)胞凋亡尤為密切。有研究發(fā)現(xiàn)Gefitinib 能通過(guò)JNK 通路影響B(tài)ax/Bcl-2 比例從而促進(jìn)線粒體釋放細(xì)胞色素c，進(jìn)而誘導(dǎo)小細(xì)胞肺癌和前列腺癌細(xì)胞發(fā)生凋亡[13-14]。本文結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同濃度Gefitinib 處理細(xì)胞后，p-p38、p-JNK 和Cleaved-PARP 蛋白發(fā)生不同程度的濃度依賴(lài)性上調(diào)，而p-ERK 和凋亡關(guān)鍵蛋白Caspase-3 表達(dá)逐漸下降。此外JC-1 免疫熒光染色觀察顯示隨著Gefitinib 濃度升高，紅色/綠色熒光逐漸降低。這些結(jié)果提示Gefitinib 可能通過(guò)MAPK 通路介導(dǎo)線粒體膜電位減低，從而誘導(dǎo)人結(jié)腸癌Caco-2發(fā)生凋亡。

綜上所述，本研究在細(xì)胞層面證明了Gefitinib 對(duì)Caco-2 增殖有明顯抑制作用，可促進(jìn)細(xì)胞凋亡。其機(jī)制可能為Gefitinib 通過(guò)調(diào)節(jié)Caco-2 細(xì)胞中p-p38、p-ERK、p-JNK 磷酸化蛋白的表達(dá)介導(dǎo)線粒體膜電位的降低，釋放出凋亡酶激活因子激活caspase 級(jí)聯(lián)反應(yīng)，使Caspase-3 活化進(jìn)而使PARP 蛋白在內(nèi)的多種關(guān)鍵細(xì)胞底物發(fā)生裂解，最終誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。但本實(shí)驗(yàn)僅限于體外實(shí)驗(yàn)，Gefitinib 對(duì)Caco-2 細(xì)胞周期的影響，以及在動(dòng)物體內(nèi)的抗腫瘤活性尚不明確，相關(guān)機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。