蔡正生，孫竹清，楊曉松，趙宏宇，鄭基永

(沈陽市骨科醫(yī)院綜合外科，遼寧沈陽，110000)

脊柱退行性疾病為臨床常見慢性病，主要表現(xiàn)為頸肩痛、腰腿痛，近年來逐漸呈年輕化態(tài)勢[1-2]。從病理基礎(chǔ)上來看，椎間盤退變?yōu)榧怪诵行约膊“l(fā)生的關(guān)鍵，但目前其確切機制尚未明晰[3]。近年有研究報道，椎間盤特定基因表達可致部分細胞功能異常，進而參與椎間退變進程[4-5]。研究表明，微小RNA(microRNA,miR)表達異常與椎間盤髓核細胞過度凋亡存在關(guān)聯(lián)性[6]。對于嚴重腰椎間盤突出癥患者，具有調(diào)節(jié)細胞凋亡作用的miR-200c在髓核組織中表達明顯增高，提示miR-200c或參與椎間盤退變進程。且有研究發(fā)現(xiàn)，miR-200c能夠調(diào)節(jié)酪氨酸激酶受體B(tyrosine kinase receptor B,TrkB)水平，從而對腫瘤細胞增殖及凋亡進行調(diào)控[7]。N-Myc下游調(diào)節(jié)基因2(N-myc downstream regulatory gene 2,NDRG2)屬于NDRG家族，可作為抑癌候選基因，在腫瘤發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)歸過程中承擔著重要角色，并可調(diào)節(jié)細胞分化、增殖與凋亡。NDRG2第一內(nèi)含子區(qū)有P53結(jié)合點，為P53新靶基因。在退變椎間盤組織中，P53表達明顯增高，提示其參與椎間盤退變病理過程[8]。然而現(xiàn)階段，TrkB、NDRG2在髓核退變中的作用在有關(guān)研究中較為鮮見?；诖?，本研究對不同退變程度腰椎間盤髓核組織中miR-200c與TrkB、NDRG2與P53的表達變化進行分析，旨在為探討TrkB、NDRG2在髓核退變進程中的作用提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年1月～2020年4月在本院行腰椎手術(shù)摘除的髓核組織標本75份，其中，男51例，女24例；年齡40～51歲。所有患者術(shù)前均行MRI檢查，基于Pfirrmann分級標準，依據(jù)髓核退變程度分級進行組別劃分。其中，Ⅱ級組：腰椎爆裂骨折25例，男16例，女9例，年齡(44.06±5.03)歲；Ⅲ級組：腰椎間盤突出癥25例，男18例，女7例，年齡(43.75±4.89)歲；Ⅳ級組：腰椎間盤突出癥25例，男17例，女8例，年齡(43.82±4.94)歲。三組患者性別、年齡等一般資料比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準?；颊呔鶎Ρ狙芯績?nèi)容知情并簽署同意書。

1.2 實驗方法

1.2.1 髓核組織中衰老髓核細胞檢測

采用細胞衰老β-半乳糖苷酶(senescence-associated β-galactosidase,SA-β-gal)試驗對髓核組織中衰老髓核細胞進行檢測。取髓核標本制冰凍切片，大小為15 μm，加入SA-β-gal染色固定液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，室溫下固定15 min，應(yīng)用PBS(0.01 mol/L)進行洗滌，重復(fù)3次后，置于搖床上輕搖，將PBS吸除，滴加SA-β-gal染色工作液，置于濕盒孵育過夜(37℃、避光)。光學顯微鏡下觀察細胞染色情況，衰老髓核細胞呈現(xiàn)為藍綠染色，即為陽性。隨機選取5個高倍視野，計算衰老髓核細胞百分比。

1.2.2 髓核組織中miR-200c、TrkB mRNA表達檢測

采用RT-PCR技術(shù)進行檢測，應(yīng)用TRIzol試劑(廠家：Invitrogen公司)對總RNA進行提取，而后去RNA 2 μg進行逆轉(zhuǎn)錄，合成cDNA，再取cDNA 1 μL進行RT-PCR檢測。相關(guān)引物序列見表1，均由上海吉凱基因公司設(shè)計合成。反應(yīng)條件：95℃ 30 s預(yù)變性，95℃ 5 s，60℃ 35 s，40個循環(huán)。采用2-ΔΔCT法計算目的基因相對表達量，重復(fù)3次取平均值。

表1 miR-200c、TrkB及內(nèi)參基因PCR引物序列

1.2.3 髓核組織中NDRG2 mRNA、P53 mRNA表達檢測

采用RT-PCR技術(shù)進行檢測，取髓核組織標本100 mg，加入RNAiso Plus(廠家：日本Takara公司)1 mL，按說明書進行操作，提取組織總RNA，溶于20 μL DEPC水，應(yīng)用Prime Script RT reagent Kit試劑盒(日本Takara公司)，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，取cDNA 1 μL作為模板，用特異性引物進行PCR反應(yīng)，引物序列見表2。采用SYBR?Premix ExTaq Ⅱ反應(yīng)試劑盒(日本Takara公司)，依據(jù)說明書配成10 μL反應(yīng)體系，每個樣本做3個腹孔，另增設(shè)不加模板cDNA作為陰性對照，應(yīng)用美國 Bio-Rad公司進行基因擴增。反應(yīng)條件：95℃預(yù)退變 5 min，95℃退變20 s，60℃退火20 s，65℃延伸20 s，40個循環(huán)。最后一循環(huán)結(jié)束后，72℃延伸10 min。采用2-ΔΔCT法計算目的基因相對表達量。

表2 NDRG2、P53及GAPDH的PCR引物序列

1.2.4 髓核組織中TckB、NDRG2蛋白檢測

均采用Western blotting法。TrkB蛋白表達檢測：選取凍存組織標本，應(yīng)用蛋白裂解液進行裂解，應(yīng)用勻漿器進行研磨，冰上裂解，經(jīng)離心處理，收集上清液，采用BCA法測定蛋白樣品濃度。取蛋白上清液樣品，每組等量，置于10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳分離，室溫下，加入5%脫脂牛奶，封閉1 h，再各自加入等量適當濃度一抗；4℃環(huán)境下孵育過夜后進行漂洗，室溫環(huán)境下加入二抗，孵育1 h，洗膜，ECL發(fā)光。TrkB蛋白相對表達量=Image J分析條帶灰度值/管家基因GAPDH條帶灰度值。NDRG2蛋白表達檢測：稱取髓核組織100 mg，將其充分剪碎，應(yīng)用PMSF裂解液進行裂解，4℃環(huán)境下經(jīng)離心10 min，收集上清液，測定總蛋白濃度。將5×SDS樣品緩沖液加入其中，95℃加熱5 min，應(yīng)用SDS-PAGE(10%)進行電泳，而后轉(zhuǎn)移至PVDF膜。洗膜5 min，室溫環(huán)境下應(yīng)用封閉液封閉60 min，應(yīng)用洗滌液進行洗滌，重復(fù)3次，每次5 min，滴加兔抗人NDRG2單克隆抗體(廠家：美國abcan公司)，4℃環(huán)境下孵育過夜，應(yīng)用洗滌液進行洗滌，而后應(yīng)用辣根過氧化物酶標記的二抗，在室溫環(huán)境下孵育60 min，再應(yīng)用洗滌液進行洗滌，重復(fù)3次，每次5 min。在黑暗的室內(nèi)環(huán)境下，與發(fā)光劑作用適量時間，曝光后再進行顯影及定影。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 三組髓核組織中衰老髓核細胞比例

就髓核組織中衰老細胞比例而言，Ⅱ級組衰老髓核細胞所占百分比為(13.6±3.8)%，Ⅲ級組為(25.1±5.4)%，Ⅳ級組為(33.7±7.5)%。三組比較，差異有統(tǒng)計學意義(F=145.315，P<0.001)，見圖1。

圖1 三組髓組織中衰老髓核細胞占比比較

2.2 三組miR-200c、TrkB mRNA及蛋白表達比較

miR-200c相對表達量：Ⅱ級組<Ⅲ級組<Ⅳ級組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；TrkB mRNA與TrkB蛋白相對表達量：Ⅱ級組>Ⅲ級組>Ⅳ級組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表3和圖2。

表3 三組miR-200c、TrkB mRNA及蛋白相對表達量比較

圖2 TrkB的蛋白電泳圖

2.3 三組P53 mRNA、NDRG2 mRNA與NDRG2蛋白相對表達量比較

三組P53 mRNA、NDRG2 mRNA與NDRG2蛋白相對表達量均存在顯著差異，Ⅱ級組<Ⅲ級組<Ⅳ級組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，詳見表4和圖3。

表4 三組P53 mRNA、NDRG2 mRNA與NDRG2蛋白相對表達量比較

2.4 相關(guān)性分析

Pearson相關(guān)性分析顯示，TrkB mRNA相對表達量、TrkB蛋白相對表達量與髓核組織中髓核細胞占比呈顯著負相關(guān)(P<0.05)；NDRG2 mRNA相對表達量、NDRG2蛋白相對表達量與髓核組織中髓核細胞占比呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，見表5；并且，miR-200c與TrkB mRNA呈顯著負相關(guān)(r=-0.792，P<0.05)，P53 mRNA與NDRG2 mRNA呈顯著正相關(guān)(r=0.974，P<0.05)。應(yīng)用Graghpad Prism軟件進行相關(guān)散點圖繪制，見圖4的①～⑥。

圖3 NDGR2的蛋白電泳圖

表5 TrkB、NDRG2表達與髓核組織中衰老髓核細胞的相關(guān)性分析

圖4 相關(guān)性分析散點圖

3 討論

椎間盤髓核細胞衰老為引發(fā)椎間盤退變的重要因素[9]。然而，目前髓核細胞衰老的分子機制尚未清晰，因此，為尋找預(yù)防、治療椎間盤退行性病變的新思路及新策略，或可從髓核細胞衰老的發(fā)生及其調(diào)節(jié)機制與衰老信號通路著手深入研究。

Pfirrmann分級的原理在于MRI成像技術(shù)，常用于退變椎間盤分級。本研究選取因腰椎手術(shù)摘除的髓核組織標本75例，基于術(shù)前Pfirrmann予以分析并分組。同時，研究樣本僅選取40～50歲年齡段患者髓核組織，以此排除年齡因素對髓核衰老凋亡所產(chǎn)生的影響。在該年齡階段，Pfirrmann Ⅰ級椎間盤已經(jīng)不存在，且Pfirrmann Ⅴ級近乎不存在髓核組織，因此，本研究中髓核組織樣本選取Pfirrmann Ⅱ～Ⅳ級。近年來學者們發(fā)現(xiàn)，退變與正常髓核組織細胞中存在一些特異性及差異表達的miR，由此提示miR或參與椎間盤退變發(fā)生及發(fā)展[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，三組髓核組織中的衰老髓核細胞百分比存在顯著差異，髓核組織隨Pfirrmann分級增加，衰老髓核細胞增多，miR-200c表達水平增高。TrkB屬于Trk家族成員，其編碼基因稱為神經(jīng)營養(yǎng)酪酸受體激酶2(neurotrophic tyrosine kinase receptor type 2,NTRK2)。TrkB為腦源性生長因子受體，也為細胞增殖、分化、凋亡信號通路中的關(guān)鍵調(diào)控因子[11]。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-200c在乳腺癌中呈現(xiàn)低表達，而NTRK2(TrkB)表達增高，上調(diào)miR-200c表達可下調(diào)NTRK2(TrkB)表達進而促使凋亡啟動，并且，經(jīng)挽救實驗證實，上調(diào)NTRK2(TrkB)能夠有效抑制miR-200c的促凋亡作用[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，TrkB mRNA相對表達量與TrkB蛋白相對表達量：Ⅱ級組>Ⅲ級組>Ⅳ級組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，提示隨著Pfirrmann分級增高，TrkB mRNA與TrkB蛋白表達水平下降；Pearson相關(guān)性分析顯示，TrkB mRNA相對表達量、TrkB蛋白相對表達量與髓核細胞占比呈顯著負相關(guān)，miR-200c與TrkB mRNA呈顯著負相關(guān)，提示miR-200c及TrkB表達異常與椎間盤退變發(fā)生及發(fā)展存在關(guān)聯(lián)。

P53為腫瘤抑制基因，可參與細胞凋亡、DNA損傷及基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)等過程[13]。同樣，P53亦為典型衰老相關(guān)基因，機體內(nèi)絕大多數(shù)細胞衰老均經(jīng)P53-P21-pRB與P16-PRb兩通路介導(dǎo)，前者可通過介導(dǎo)髓核細胞衰老進而引發(fā)椎間盤退變[14]。另有研究發(fā)現(xiàn)，P53可促新生血管形成以及毛細血管浸潤，以此參與椎間盤退變[15]。NDRG2為新近發(fā)現(xiàn)的P53下游靶基因，常作為抑癌基因，參與細胞增殖、分化以及凋亡。臨床研究發(fā)現(xiàn)，NDRG2在白內(nèi)障腦組織與晶狀體上皮細胞中均有增高表達，由此提示，P53-NDRG2途徑或與衰老聯(lián)系密切[16]。本研究顯示，三組P53 mRNA、NDRG2 mRNA與NDRG2蛋白相對表達量均存在顯著差異，Ⅱ級組<Ⅲ級組<Ⅳ級組(P<0.05)；并且，Pearson相關(guān)性分析顯示，NDRG2 mRNA相對表達量、NDRG2蛋白相對表達量與髓核組織中髓核細胞占比呈顯著正相關(guān)，P53 mRNA與NDRG2 mRNA呈顯著正相關(guān)。結(jié)果提示，隨著椎間盤退變程度加重，NDRG2表達不斷增高，說明NDRG2參與腰椎間盤退變的病理過程，或可介導(dǎo)髓核細胞衰老以促使椎間盤退變發(fā)生。

綜上所述，TrkB、NDRG2可參與腰椎間盤退變的病理過程，或經(jīng)介導(dǎo)腰椎間盤髓核細胞衰老，促使椎間盤退變。本研究不足在于：樣本量較小，并且，椎間盤髓核組織選擇較為單一局限，還有待進一步作大樣本、多中心的深入研究。