喬梁，李珠華

(1.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院徐匯醫(yī)院中醫(yī)科，上海 200030；2.福建省福清市醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科，福建福清 350300)

在我國，60～64歲之間的婦女骨質(zhì)疏松癥發(fā)生率為53.8%[1]。人口老齡化導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥的患病率不斷上升，并發(fā)骨折的概率也越來越高，嚴(yán)重威脅著人類的健康和生命[2]。臨床資料提示，Dickkopf-1(DKK1)參與骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨分化與成脂分化[3]。DKK1是Wnt信號通路的一種拮抗劑，已成為骨質(zhì)疏松和骨關(guān)節(jié)疾病的研究熱點[4]。研究顯示，對于原發(fā)性骨質(zhì)疏松性腰痛患者采取針刺治療，可明顯改善患者相關(guān)臨床癥狀[5, 6]；另有研究證實，針刺刺激對于絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松模型大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨分化有一定的促進作用[6]。因此，研究針刺如何通過調(diào)控DKK1基因抑制骨質(zhì)疏松癥、促進骨髓間充質(zhì)干細胞成骨，具有重要意義。本課題應(yīng)用去卵巢大鼠模型(ovariectomized rats,OVX)，根據(jù)“補腎生髓”、“筋骨并重”的理論基礎(chǔ)，針刺“腎腧”穴位(雙側(cè))，運用實驗手段驗證針刺對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松模型大鼠的治療作用。本研究通過觀察針刺治療不同階段的DKK1蛋白表達以及生物力學(xué)指標(biāo)的影響，以期從信號和分子水平探討針刺改善絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的機制。有助于為該治療方法的進一步臨床應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)，為針刺治療骨質(zhì)疏松癥的中醫(yī)臨床應(yīng)用提供實驗室證據(jù)，為中醫(yī)針刺現(xiàn)代化研究探索合適的方法和模型。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

6周齡SD雌性大鼠96只，SPF級，體重(180±20)g，由上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司提供，生產(chǎn)許可SCXK(滬)2017-0005。

1.2 實驗儀器以及試劑與藥品

蘇木素染液配置原料：蘇木素、無水乙醇、硫酸鋁鉀、雙蒸水、氧化汞、冰醋酸；鹽酸-乙醇分化液：濃鹽酸1 mL、70%乙醇99 mL；伊紅液：伊紅0.25～0.5 g、蒸餾水100 mL、冰醋酸1滴；抗體:DKK1、β-catenin、Wnt3a兔抗鼠多克隆抗體及即用型SABC免疫組化染色試劑盒 (南京博之約生物科技有限公司)。

1.3 實驗儀器

無菌針灸針(材質(zhì)：0Cr19Ni9奧氏體不銹鋼)，規(guī)格：0.25 mm×13 mm，生產(chǎn)批號：津食藥監(jiān)械(準(zhǔn))字2005第2270003號 ；雙能X線骨密度儀(Discovery Wi，美國HOLOGIC)；Instron生物材料實驗機Electroplus E 1000 Test System；DPX-9052B電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海福瑪實驗設(shè)備有限公司)；RM2135超薄切片機(德國LEICA)；DHG-9140A電熱恒溫干燥箱(上海市躍進醫(yī)療器械廠)，BH-20光學(xué)顯微鏡(日本Olympus)；HI1210型攤片機(Leica，德國)；TP1020型全自動脫水機(Leica，德國)。

1.4 動物造模與分組

雌性SD大鼠共96只，其中80只采用經(jīng)典的雙側(cè)卵巢切除進行原發(fā)性骨質(zhì)疏松大鼠造模，造模術(shù)后隨機分為5組：模型組16只，第一期針刺治療組16只、第二期針刺治療組16只、第三期針刺治療組16只、阿倫磷酸鹽陽性藥物對照組16只。另16只行卵巢附近脂肪組織切除后，為空白對照組。各組大鼠均按每籠4只分籠飼養(yǎng)。

雙側(cè)卵巢切除術(shù)采用氯胺酮(0.1 g/kg)腹腔麻醉，取俯臥位，肋弓下第3-4腰椎處，剔凈鼠毛，碘伏消毒，本手術(shù)要求無菌操作。手術(shù)首先經(jīng)腰背側(cè)路進入，切開皮膚后，將腰部筋膜和肌肉鈍性分離，在充分暴露卵巢的情況下，結(jié)扎輸卵管和周圍血管，用眼科剪將卵巢切除。按相同的方法將對側(cè)卵巢切除。確保卵巢切除干凈，防止卵巢切除不干凈及術(shù)后體重增加造成骨密度增加的不良結(jié)果。逐層縫合腹膜至皮膚，慶大霉素注射傷口。

1.5 干預(yù)方法

空白組和模型組術(shù)后不進行干預(yù)；各針刺治療組采取針刺治療，針刺雙側(cè)“腎腧”穴，定位嚴(yán)格按照《實驗針灸學(xué)》第9版常用實驗動物針灸穴位附圖中的取穴方法，深度4～5 mm。第一期針刺治療組在術(shù)后8周行針刺治療，每日針刺一次；第二期針刺治療組在術(shù)后10周針刺；第三期針刺治療組在術(shù)后12周針刺；阿倫磷酸鹽陽性藥物對照組在術(shù)后8周開始服用阿倫磷酸鹽，每周灌胃一次。

1.6 檢測指標(biāo)及方法

1.6.1 應(yīng)用雙能X線(DXA)檢測骨密度

在進行去卵巢手術(shù)后28周，對大鼠的全身及腰部骨密度值進行全面測量。測定時，將麻醉后的大鼠置于測定儀平臺上，采用DISCOVERY雙能X線骨密度儀及其所附帶的骨密度測試配套采集與分析軟件，對各大鼠的全身骨密度以及腰椎部分骨密度進行分析。

1.6.2 運用三點彎曲力學(xué)測試大鼠股骨生物力學(xué)參數(shù)

大鼠處死后，盡快將左側(cè)股骨完整剝離，用眼科剪將肌肉等軟組織剔除，剔除軟組織的過程中注意保護骨膜，以0.9%氯化鈉溶液浸泡，即刻完成三點彎曲力學(xué)測試。實驗過程中，使用0.9%氯化鈉溶液保持骨骼濕潤，以降低干燥環(huán)境對骨力學(xué)性能的影響。檢測指標(biāo)包括股骨最大載荷力(F-max N)、股骨彈性模量(Stiffness N/mm)。

1.6.3 腰椎椎體的病理形態(tài)學(xué)H-E染色

大鼠處死后，將腰椎剝離，用眼科剪將肌肉等軟組織剔除，注意保護骨膜，將樣本以4%的多聚甲醛進行固定。固定后，繼續(xù)進行EDTA脫鈣處理。脫鈣液每周更換2次，脫鈣,1個月后進行修剪、組織切片。切片后，進行H-E染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.6.4 觀察腰椎椎體Wnt3a、β-catenin、Dkk1的含量

取材、固定及脫鈣同1.6.3，脫鈣液每周更換2次，脫鈣,1個月后進行修剪，修剪后進行組織切片。組織切片后，進行免疫組織化學(xué)染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 針刺對OVX大鼠骨質(zhì)疏松癥狀及骨量影響

各組大鼠在手術(shù)后28周時的骨密度情況見圖1。與假手術(shù)組相比，OVX模型組、藥物干預(yù)組、一期針刺治療組、二期針刺治療組、三期針刺治療組的大鼠腰椎骨密度均出現(xiàn)顯著下降(P<0.01)；藥物干預(yù)組、一期針刺治療組、二期針刺治療組、三期針刺治療組腰椎骨密度均高于OVX模型組(P<0.05)。

2.2 針刺干預(yù)對OVX大鼠生物力學(xué)功能的影響

各組大鼠在手術(shù)后28周時，脛骨的最大載荷力見圖2(a)。與假手術(shù)組相比，其它各組大鼠脛骨最大載荷力均出現(xiàn)顯著下降(P<0.01)；藥物干預(yù)組、一期針刺治療組、二期針刺治療組、三期針刺治療組的脛骨最大載荷力均高于OVX模型組(P<0.01)。各組大鼠在手術(shù)后28周時的脛骨彈性模量結(jié)果見圖2(b)。與假手術(shù)組相比，各組大鼠脛骨彈性模量均出現(xiàn)顯著下降(P<0.01)；藥物干預(yù)組、一期針刺治療組、二期針刺治療組、三期針刺治療組的脛骨彈性模量均高于OVX模型組(P<0.01)。

圖1 大鼠全身骨密度

2.4 Wnt3a、β-catenin、Dkk1表達結(jié)果

利用免疫組織化學(xué)染色觀察Wnt3a表達情況，見圖4，OVX模型組的Wnt3a表達少于假手術(shù)組，藥物干預(yù)組、一期針刺治療組、二期針刺治療、三期針刺治療組的Wnt3a表達相較于OVX模型組有所增加。利用免疫組織化學(xué)染色觀察β-catenin表達情況，見圖5，OVX模型組相比假手術(shù)組的β-catenin表達減少，藥物干預(yù)組、一期針刺治療組、二期針刺治療、三期針刺治療組相比OVX模型組的β-catenin表達增加。利用免疫組織化學(xué)染色觀察DKK1表達情況，見圖6，OVX模型組相比假手術(shù)組的DKK1表達增加，藥物干預(yù)組、一期針刺治療組、二期針刺治療、三期針刺治療組相比OVX模型組的β-catenin表達減少。

圖2

2.3 各組大鼠的H-E染色

假手術(shù)組骨細胞外形結(jié)構(gòu)完整、呈扁橢圓形、多突起，胞質(zhì)充滿細顆粒狀嗜堿性物質(zhì)，核扁圓、染色深；骨小梁結(jié)構(gòu)完整，厚度正常，密度正常。模型組：細胞外形出現(xiàn)明顯的腫脹，細胞界限變得不甚清晰，胞漿呈現(xiàn)空泡樣改變，核仁變淡或消失，同時骨小梁結(jié)構(gòu)出現(xiàn)嚴(yán)重破壞，骨小梁厚度、密度明顯降低。相較于OVX模型組而言，藥物干預(yù)組、一期針刺治療組、二期針刺治療組、三期針刺治療組的細胞腫脹和胞漿空泡樣改變明顯減輕，骨小梁結(jié)構(gòu)的破壞情況明顯改善(見圖3)。

圖3 H-E染色后的腰椎骨形態(tài)學(xué)改變情況(a.假手術(shù)組；b.模型組；c.藥物干預(yù)組；d.一期針刺治療組；e.二期針刺治療組；f.三期針刺治療組)

圖4 腰椎骨Wnt3a表達情況 (a.假手術(shù)組；b.模型組；c.藥物干預(yù)組；d.一期針刺治療組；e.二期針刺治療組；f.三期針刺治療組)

圖5 腰椎骨β-catenin表達情況(a.假手術(shù)組；b.模型組；c.藥物干預(yù)組；d.一期針刺治療組；e.二期針刺治療組；f.三期針刺治療組)

圖6 腰椎骨Dkk1表達情況(a.假手術(shù)組；b.模型組；c.藥物干預(yù)組；d.一期針刺治療組；e.二期針刺治療組；f.三期針刺治療組)

3 討論

研究顯示，針刺刺激可以改善機體調(diào)節(jié)功能,升高內(nèi)源性激素水平,幫助脾胃功能改善,加快患者機體對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收,改善骨密度,幫助患者骨質(zhì)疏松癥狀得到有效改善[7, 8]。針刺治療原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥，可有效改善患者髖部和第2～4腰椎骨密度[9]。在生物力學(xué)角度，有研究結(jié)果顯示針刺與推拿手法結(jié)合可以通過良性的應(yīng)力刺激對腰椎生物力學(xué)結(jié)構(gòu)進行有效調(diào)整，重建腰椎力學(xué)平衡，在防治骨質(zhì)疏松癥方面有重要的意義[10]。雖然有眾多的前期研究結(jié)果對于針刺治療的療效給予了充分肯定，但療效觀測指標(biāo)多為主觀癥狀，不夠客觀、規(guī)范、統(tǒng)一，有關(guān)作用機理的研究報道較少。因此，學(xué)術(shù)界仍需探索一些客觀的實驗觀察指標(biāo)，以便于統(tǒng)一療效判斷標(biāo)準(zhǔn)。

Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是一組由配體蛋白Wnt和膜蛋白受體結(jié)合刺激的多下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。其中Wnt/β-catenin信號通路在骨代謝中起重要作用，信號通路中各種因子的表達水平變化會直接影響成骨細胞的生成和分化，促進骨祖細胞增殖，降低其成脂分化，同時減少成骨細胞凋亡，促進破骨細胞凋亡，從而導(dǎo)致骨形成增加[11, 12]。Wnt/β-catenin信號通路主要包括：配體(Wnt2，Wnt3等)，跨膜受體(LRP5/ 6和Frizzled家族分子)，細胞質(zhì)調(diào)節(jié)蛋白(3-catenin，APC，Axin，GSK3B，Dsh等)。和核轉(zhuǎn)錄因子(TCF/ LEF1)等[11]。當(dāng)Wnt信號通路被下調(diào)時，β-catenin與Axin、APC和GSK3B形成的復(fù)合物相互作用，進而導(dǎo)致β-catenin磷酸化。當(dāng)Wnt信號通路上調(diào)時，Wnt蛋白與Frizzled和LRP5/6結(jié)合以促進細胞中分散蛋白(Dsh)的磷酸化。Dsh通過對GSK36的抑制延緩了β-catenin的磷酸化，從而導(dǎo)致β-catenin在細胞中逐漸積累。當(dāng)細胞質(zhì)中的β-catenin達到一定水平時，β-catenin從細胞質(zhì)進入細胞核，并與T細胞因子/淋巴增強因子(TCF/LEF)結(jié)合，調(diào)節(jié)骨靶基因Runx2、OPG等的表達，繼而促進成骨細胞增殖并分化[13, 14]。

Dickkopf相關(guān)蛋白1(Dickkopf-related protein 1, DKK1)是由DKK1基因編碼的蛋白質(zhì)，該基因編碼的蛋白質(zhì)是Dickkopf家族的成員。Dkkl作為Wnt信號通路的抑制因子，抑制以上生物過程，調(diào)控下游通路，使間充質(zhì)干細胞成脂分化、成骨細胞凋亡增加，影響骨形成[4]。DKK1主要參與Wnt/β-catenin 經(jīng)典途徑的機制，在于以下兩個方面：一方面，DKK1能夠在細胞外與Wnt蛋白輔助受體LRP5/6結(jié)合，此功能缺失突變表現(xiàn)為由骨形成降低所造成的骨量下降[15]；另一方面，DKK1可通過與含有Kringle結(jié)構(gòu)域的Kremen受體(包括Kremen-1和Kremen-2) 結(jié)合，并與LRP5/6形成DKK1-LRP-Kremen三聚體，誘導(dǎo)細胞發(fā)生快速內(nèi)吞，形成內(nèi)吞小體，從細胞膜上除去LRP5/6，最終β-catenin被磷酸化而不能與核內(nèi)LEF/TCF結(jié)合，從而抑制Wnt經(jīng)典信號傳導(dǎo)通路[16]。為揭示DKK1在骨骼發(fā)育方面的作用，有研究在小鼠體內(nèi)構(gòu)建了DKK1敲除模型，掲示了該基因的作用。由于顱骨缺損以及不完全發(fā)育，所有DKK1敲除純合子的小鼠均在出生時死亡，該研究證實，DKK1對Wnt信號通路的抑制對于正確的骨骼發(fā)育至關(guān)重要[17]。與此同時，臨床研究也提示，DKK1參與骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨分化與成脂分化[18]，DKK1作為Wnt信號通路的一種拮抗劑，如今已成為骨質(zhì)疏松和骨關(guān)節(jié)疾病的研究熱點[19]。

本實驗研究結(jié)果表明，針刺干預(yù)后OVX大鼠的腰椎骨密度以及生物力學(xué)指標(biāo)得到了明顯改善。同時病理形態(tài)學(xué)顯示，針刺干預(yù)后細胞腫脹和胞漿空泡樣改變明顯減輕，骨小梁結(jié)構(gòu)的破壞情況明顯改善。由此可以證明，針刺干預(yù)明顯緩解了骨小梁的結(jié)構(gòu)破壞，同時改善了骨骼的生物力學(xué)性能。骨強度是由骨質(zhì)量和骨密度共同決定的，骨質(zhì)量包含骨骼的組合構(gòu)成及形態(tài)結(jié)構(gòu)，當(dāng)骨質(zhì)疏松造成骨小梁機構(gòu)破壞后，骨質(zhì)量會相應(yīng)出現(xiàn)下降。因此，在骨密度確定的情況下，骨骼的承重能力根據(jù)骨小梁結(jié)構(gòu)的不同而變得不同。本研究結(jié)果顯示，針刺治療不僅改善了OVX大鼠的骨密度，同時改變了骨骼的生物力學(xué)性能，以及通過良性的應(yīng)力刺激緩解了腰椎骨小梁結(jié)構(gòu)的破壞，重建了腰椎力學(xué)的平衡，對于骨強度有明顯改善作用，在防治骨質(zhì)疏松癥方面有重要意義。免疫組織化學(xué)染色顯示，針刺干預(yù)后DKK1表達明顯下降，β-catenin、Wnt3a表達明顯增加 (P<0.01)。由此可見，針刺刺激“腎腧”穴后可能通過下調(diào)細胞因子DKK1，繼而影響Wnt3/β-catenin信號通路，起到調(diào)節(jié)骨代謝的作用，從而有效地干預(yù)骨質(zhì)疏松造成的骨質(zhì)下降。