劉勃興 趙安奇 王利麗 張雪佳 郭 蕊 丁家麟 史秋梅* 張志強*

(1.河北科技師范學(xué)院，河北省預(yù)防重點實驗室，秦皇島，066600；2.昌黎縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，秦皇島，066600；3.秦皇島市海港區(qū)西港動物防疫監(jiān)督站，秦皇島，066000)

沙門氏菌(Salmonella)病又稱副傷寒，是一種在毛皮動物養(yǎng)殖過程常見的急性傳染病，常發(fā)于6—8月，呈地方性流行，主要表現(xiàn)癥狀為發(fā)熱，下痢腹瀉，體重減輕，出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，流產(chǎn)等[1-3]。英國、丹麥、加拿大等國均有北美水貂(Mustelavison)感染沙門氏菌患病的報道，國內(nèi)，在我國河北、東北三省、山東等地區(qū)也有相關(guān)病例報道[4-8]。目前，沙門氏菌的預(yù)防與治療以抗生素藥物為主。近年來對沙門氏菌的耐藥性研究結(jié)果顯示，人源、動物源沙門氏菌的多重耐藥情況和耐藥程度逐年遞增，并通過飲水和食物等方式在人和動物之間不斷傳遞[9-11]?？股仡愃幬餅E用，給細菌造成選擇壓力是造成多重耐藥情況日益嚴(yán)重的主要原因之一，因此，在養(yǎng)殖中合理應(yīng)用治療動物疾病尤為重要[12]。

本文對2019年秦皇島地區(qū)送檢北美水貂的沙門氏菌攜帶情況進行調(diào)查，并對分離菌株的致病性和耐藥性進行研究，旨在為該地區(qū)北美水貂沙門氏菌病的防治提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 樣品

2019年3—9月收集秦皇島地區(qū)病死北美水貂病料65份，30—180日齡不等。

1.2 主要試劑

H.E.瓊脂培養(yǎng)基購自青島海博生物公司；革蘭氏染色液購自京博奧拓達科技有限公司；ID32E腸桿菌科和其他非苛養(yǎng)革蘭氏陰性桿菌鑒定試劑條購自法國梅里埃公司；D2000 plus DNA ladder，購自中科瑞泰科技有限公司；2×TaqMaster Mix，細菌DNA基因組提取試劑盒，膠回收試劑盒購自康為世紀(jì)生物科技有限公司；pMD19-T載體，購自寶日醫(yī)(TaKaRa)生物技術(shù)有限公司；藥敏紙片購自杭州天和微生物科技股份有限公司；序列測定服務(wù)由上海生工生物工程公司提供。昆明小鼠(體重20±5 g)購自北京維通利華試驗動物有限公司。

1.3 引物

細菌16S rDNA鑒定通用引物由上海生工生物工程公司合成。引物序列為27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，1492R：TAC GGY TACCTTGTTACGACTT。

1.4 細菌的分離純化

無菌采取病死水貂肝臟、脾臟、心臟，于超凈臺中接種于H.E.瓊脂培養(yǎng)基，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18—24 h，挑取黑綠色且中心有黑點的菌落重新于H.E.培養(yǎng)基中劃線純化培養(yǎng)18—24 h，挑取符合上述特征的單菌落接種于LB培養(yǎng)基中，置于37℃恒溫搖床培養(yǎng)18—24 h。

1.5 分離菌的革蘭氏染色

挑取純化后的單菌落進行革蘭氏染色，染色操作按照試劑說明書進行，染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察細菌的染色特征和形態(tài)。

1.6 分離菌的生化鑒定

生化鑒定試驗參照ID32E腸桿菌科和其他非苛養(yǎng)革蘭氏陰性桿菌鑒定試劑條進行，用ATB自動生化鑒定系統(tǒng)對結(jié)果判定。

1.7 分離菌的16S rDNA鑒定

按照細菌DNA基因組提取試劑盒說明書提取分離菌的DNA作為PCR模板。PCR體系為：上、下游引物和模板各1 μL，ddH2O 22 μL，2×TaqMaster Mix 25 μL，總體積為50 μL。PCR擴增反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸60 s，共30個循環(huán)；72℃延伸10 min。用膠回收試劑盒回收1 500 bp左右條帶，回收產(chǎn)物連接pMD19-T載體并轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細胞，涂布于含有氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)，挑取陽性菌落置于含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中增殖培養(yǎng)，送上海生工生物工程公司測序。測序結(jié)果在NCBI的BLAST分區(qū)檢索并比對分析。

1.8 分離菌的致病性試驗

參考文獻[13]中的劑量與方法，每株分離菌分別感染5只小鼠，每只小鼠腹腔注射0.2 mL用高壓滅菌后的PBS調(diào)整濃度后的菌液(濃度1×108cfu/mL)，設(shè)置對照組一組，每只小鼠注射0.2 mL的無菌PBS，其余條件與分離菌感染組相同。觀察并記錄小鼠死亡發(fā)病情況。

1.9 分離菌的藥物敏感性試驗

按照美國臨床和試驗室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)標(biāo)準(zhǔn)的操作和判準(zhǔn)，采用KB紙片法檢測分離菌對β-內(nèi)酰胺類(氨芐西林、頭孢曲松、阿莫西林)，氨基糖苷類(阿米卡星、新霉素、卡那霉素)，四環(huán)素類(多西環(huán)素、土霉素)，氟喹諾酮類(環(huán)丙沙星、恩諾沙星)，氯霉素類(氟苯尼考)，大環(huán)內(nèi)酯類(替米考星)，磺胺類(磺胺間甲氧、磺胺二甲氧、復(fù)方新諾明)，共計15種抗生素的敏感性。

2 結(jié)果

2.1 細菌的分離純化

從65份樣品中共計分離出9株疑似沙門氏菌的菌株。疑似菌株在H.E.瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)菌落呈圓形，邊緣整齊，微凸，藍綠色，菌落中間有黑點(圖1A)。

2.2 分離菌的革蘭氏染色

經(jīng)革蘭氏染色，9株分離菌均為革蘭氏陰性短桿菌，兩端鈍圓(圖1B)。

2.3 分離菌的生化鑒定

生化鑒定結(jié)果顯示，分離菌枸櫞酸鹽，d-葡萄糖，賴氨酸脫羧酶和鳥氨酸脫羧酶試驗均為陽性。個別菌株可發(fā)酵麥芽糖、甘露醇。吲哚、尿素酶、丙二酸鹽等試驗均為陰性。ATB自動生化鑒定系統(tǒng)判定結(jié)果均為沙門氏菌，評定符合率均在99%以上。

2.4 分離菌的16S rDNA鑒定

將測序結(jié)果用NCBI的BLAST分區(qū)檢索，發(fā)現(xiàn)分離菌株與沙門氏菌屬的參考菌株同源性達97%—100%。結(jié)合上述鑒定結(jié)果，綜合判定9株分離菌為沙門氏菌，命名為SDS1-9。

2.5 分離菌的致病性試驗

分離菌感染小鼠后，小鼠出現(xiàn)明顯的神經(jīng)癥狀，表現(xiàn)為站立不穩(wěn)，瞇眼，抱爪蜷縮，個別小鼠出現(xiàn)糞便稀軟，呼吸急促癥狀。感染組小鼠出現(xiàn)死亡，死亡個數(shù)1—5個，死亡率20%—100%(圖2)。對照組小鼠無發(fā)病癥狀，無死亡。分離感染組小鼠肝臟、脾臟、心臟細菌，經(jīng)鑒定分離出沙門氏菌。

2.6 分離菌的藥物敏感性試驗

藥物敏感性試驗結(jié)果顯示，分離菌株分別對5—11種抗生素耐藥，對2—5種抗生素表現(xiàn)中介，對2—8種抗生素敏感(圖3)。15種抗生素中無對頭孢曲松和阿米卡星表現(xiàn)耐藥的菌株，其余13種抗生素的耐藥率11.11%—100%，其中氟苯尼考、替米考星、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶和復(fù)方新諾明的耐藥率高達100%。土霉素敏感率最高，為88.89%(8/9)(圖4)。對5種抗生素耐藥菌株1株，對6種抗生素耐藥菌株2株，對7種抗生素耐藥菌株1株，對8種抗生素耐藥菌株3株，對9種抗生素耐藥菌株1株，對11種抗生素耐藥菌株1株，分離菌株均具有多重耐藥性。

3 討論

Williams等[8]報道英國的12個養(yǎng)殖場316只病死貂中沙門氏菌患病率0.6%，Dietz等[7]報道由于飼料污染導(dǎo)致丹麥25個水貂養(yǎng)殖場水貂出現(xiàn)流產(chǎn)死胎，上述報道均表明在水貂養(yǎng)殖中沙門氏菌是重要的細菌性致病原。我國毛皮動物養(yǎng)殖起步較晚，但發(fā)展迅速，養(yǎng)殖數(shù)量和密度較大，存在養(yǎng)殖技術(shù)相對落后，管理粗放等問題，致使動物發(fā)病率較高，尤其是細菌性疾病，給養(yǎng)殖場造成嚴(yán)重的經(jīng)濟損失[14-15]。本文對65份病死水貂病料中的沙門氏菌進行分離鑒定，分離率為13.85%，并通過小鼠致病性試驗發(fā)現(xiàn)分離菌株均具有一定的毒力。李鵬[16]用多重PCR方法檢測268份水貂胴體及內(nèi)臟組織，沙門氏菌檢出率0.75%(2/268)；劉亭亭[4]從2009—2017收集的水貂病料中檢測出5株沙門氏菌。在李鵬[16]和劉亭亭[4]報道均有沙門氏菌檢出，但檢出率均比本文低，這可能與檢測方法和病料來源、時間等條件不同有關(guān)。

沙門氏菌有多種耐藥性產(chǎn)生機制，并可通過多種方法從環(huán)境中獲得耐藥性，給沙門氏菌病的防治造成困難[17]。本文對9株水貂源沙門氏菌的耐藥性進行研究，發(fā)現(xiàn)多重耐藥菌株高達100%，而試驗的15種抗生素中有5種抗生素耐藥性高達100%，表明分離菌株耐藥情況較為嚴(yán)重，且部分抗生素對分離菌株未表現(xiàn)出抗菌效果。據(jù)孫娜等[18]報道，其分離的7株水貂源沙門氏菌具有多重耐藥現(xiàn)象，對頭孢曲松、左氧氟沙星、氟苯尼考和多黏菌素較敏感，對氨基糖苷類藥物、四環(huán)素和氨芐西林表現(xiàn)為耐藥。據(jù)王海龍等[6]報道，其分離的水貂源沙門氏菌對環(huán)丙沙星、左旋氧氟沙星、克林霉素、頭孢曲松鈉高敏，對萬古霉素、硫酸黏菌素中敏，對丁胺卡那霉素、氨芐西林、慶大霉素低敏。在本文與孫娜等[18]、王海龍等[6]的報道中，水貂源沙門氏菌均存在多重耐藥現(xiàn)象，且耐藥情況不同，這可能是由于時間、飼養(yǎng)與治療方式不同造成的。在臨床治療水貂沙門氏菌病時，建議可先通過藥物敏感性試驗篩選出最佳的抗菌藥物，制定合理的給藥方案，避免長期大劑量使用抗生素，減少養(yǎng)殖戶的經(jīng)濟損失。

本文對秦皇島地區(qū)水貂源沙門氏菌進行分離鑒定，分離率13.85%(9/65)；對分離菌株的致病性及耐藥性進行研究，發(fā)現(xiàn)分離菌均具可致小鼠出現(xiàn)不同程度死亡，并分別對5—11種抗生素藥物耐藥，氟苯尼考、替米考星、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶和復(fù)方新諾明的耐藥率高達100%，耐藥情況較為嚴(yán)重，為該地區(qū)水貂沙門氏菌病的預(yù)防和治療提供參考。