閆思遠(yuǎn)，任苗苗，杜 娟，李 金，楊富龍，李嘉泓，顧沛雯

(寧夏大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750021)

內(nèi)生真菌是指在其生活史中某一階段或全部階段生活于健康植物的各種組織和器官內(nèi)部，且被感染的宿主植物不表現(xiàn)出明顯病害癥狀(至少是暫時(shí))的一類真菌[1]。研究發(fā)現(xiàn),內(nèi)生真菌可促進(jìn)植物生長(zhǎng)，增強(qiáng)植物對(duì)生物脅迫和非生物脅迫的抗性，并且能給植物提供氮源、碳源等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及一些激素[2]。目前，由于宿主植物生活環(huán)境的多樣性以及內(nèi)生真菌與宿主植物關(guān)系的復(fù)雜性，有關(guān)內(nèi)生真菌在植物體內(nèi)生命活動(dòng)的研究仍處于探索階段，對(duì)內(nèi)生真菌與宿主植物間的營(yíng)養(yǎng)代謝關(guān)系尚無(wú)定論[3]。解決以上問(wèn)題的關(guān)鍵在于建立內(nèi)生真菌遺傳標(biāo)記體系，并用于其在宿主植物中侵染定殖規(guī)律和內(nèi)生機(jī)制研究。

綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)作為一種新型報(bào)告蛋白，因熒光性能穩(wěn)定，表達(dá)與受體細(xì)胞種屬無(wú)關(guān)且檢測(cè)方便，目前在研究真菌與宿主相互作用中應(yīng)用廣泛[4]。Yao等[5]利用GFP標(biāo)記揭示了交枝頂孢(Acremoniumimplicatum)在番茄根部的內(nèi)生性。趙興麗等[6]借助GFP標(biāo)記探究了鉤狀木霉(Trichodermahamatum)ACCC31649在辣椒植株中的定殖能力。隋麗等[7]用GFP標(biāo)記研究了球孢白僵菌(Beauveriabassiana)在玉米中的定殖規(guī)律和促生長(zhǎng)特性。

表達(dá)載體形式的基因轉(zhuǎn)移是常用的外源基因轉(zhuǎn)化方式[8]。外源基因在宿主細(xì)胞中的表達(dá)取決于兩個(gè)因素，第一，啟動(dòng)子與目的菌株的匹配程度；第二，參與基因轉(zhuǎn)錄全過(guò)程的DNA順式作用元件和反式作用元件的影響[9]。因此，篩選與宿主細(xì)胞相互匹配的表達(dá)載體，是促使外源基因表達(dá)的重要前提[10]。2008年，郭麗瓊等[10]分別使用表達(dá)載體pAN7-1和pLE-hph轉(zhuǎn)化銀耳(Tremellafuciformis)，發(fā)現(xiàn)pLE-hph轉(zhuǎn)化子具有較好的遺傳穩(wěn)定性。2015年，Sun等[11]使用表達(dá)載體pTFCM和Pgpd-hph-TtrpC 3300對(duì)茯苓(Wolfiporiacocos)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，結(jié)果顯示只有使用表達(dá)載體Pgpd-hph-TtrpC 3300才能成功獲得轉(zhuǎn)化子。2020年，李棟等[12]分別將GFP標(biāo)簽蛋白表達(dá)載體pKD5-GFP、pKD8-GFP、pEC-Gpd、pEC-H3和pEC-Tef轉(zhuǎn)入蟬棒束孢菌(Isariacicadae)中，通過(guò)熒光顯微觀察發(fā)現(xiàn)，pKD5-GFP轉(zhuǎn)化子的熒光明顯強(qiáng)于其他轉(zhuǎn)化子。

枸杞內(nèi)生真菌(Fusariumnematophilum)NQ8GⅡ4是寧夏大學(xué)植物病理實(shí)驗(yàn)室從健康寧杞8號(hào)枸杞根部分離到的一株高活性功能菌株[13]。該菌株對(duì)枸杞膠孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)、葡萄灰霉病菌(Botrytiscinerea)和玉米大斑病菌(Exserohilumturcicum)等多種植物病原真菌具有較強(qiáng)的拮抗作用，同時(shí)還能產(chǎn)生具有抑菌活性的揮發(fā)性物質(zhì)[14]。本研究采用PEG介導(dǎo)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法分別將pFL2、pDL2、r-KNT和KNTG 4種攜帶GFP基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入NQ8GⅡ4菌株中，通過(guò)對(duì)比4種GFP轉(zhuǎn)化子的熒光強(qiáng)度、遺傳穩(wěn)定性、拮抗活性和致病性，篩選出適宜NQ8GⅡ4菌株GFP標(biāo)記的表達(dá)載體，以期為研究該菌株在宿主植物中的侵染行為和定殖規(guī)律奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株和表達(dá)載體 枸杞內(nèi)生真菌NQ8GⅡ4(CGMCC No.19271)、枸杞膠孢炭疽菌由寧夏大學(xué)植物病理實(shí)驗(yàn)室分離鑒定并保存。表達(dá)載體pFL2(含NEO和GFP基因)、pDL2(含HPH和GFP基因)由西北農(nóng)林科技大學(xué)胡小平教授惠贈(zèng)，表達(dá)載體r-KNT(含NEO和GFP基因)由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)彭有良教授惠贈(zèng)，表達(dá)載體KNTG(含NEO和GFP基因)由西北農(nóng)林科技大學(xué)趙磊副教授惠贈(zèng)。

1.1.2 試 劑 潮霉素B(Hygromycin B，HmB)購(gòu)于德國(guó)Roche公司，Miracloth購(gòu)于美國(guó)Calbiochem公司，崩潰酶(Driselase)、溶壁酶(Lyticase)購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，LB固體/液體培養(yǎng)基、氨芐青霉素(Ampicillin，Amp)、遺傳霉素(Genetinic，G418)購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司，AxyPrep表達(dá)載體DNA小量試劑盒購(gòu)自美國(guó)康寧生命科學(xué)有限公司，DH10B大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京博邁德生物技術(shù)有限公司，EcoTaq?PCR SuperMix(+dye)購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

根據(jù)張世杰[15]的方法，配制馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)、馬鈴薯葡萄糖肉湯培養(yǎng)基(PDB)、酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基(YPD)、TB3培養(yǎng)基、Bottom Agar培養(yǎng)基、Top Agar培養(yǎng)基、山梨醇-Tris-氯化鈣溶液(STC)和聚乙二醇-Tris-氯化鈣溶液(PTC)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 NQ8GⅡ4菌株對(duì)抗生素的耐受性 融化PDA培養(yǎng)基，待溫度降至45 ℃，加入HmB或G418，使其在培養(yǎng)基中的終質(zhì)量濃度均分別為0，10，20，30，40，50，60，70，80 mg/L，待培養(yǎng)基冷卻后分別接種直徑為0.5 cm的NQ8GⅡ4菌餅，25 ℃培養(yǎng)7 d，觀察菌落生長(zhǎng)情況，確定HmB或G418對(duì)NQ8GⅡ4菌株的最佳篩選質(zhì)量濃度。

1.2.2 原生質(zhì)體的制備 參照徐齊君等[16]的方法并略作調(diào)整，制備原生質(zhì)體。NQ8GⅡ4菌株原生質(zhì)體的制備條件為：將16 h菌齡的菌絲0.05 g置于1 mL酶解液(30.30 g/L崩潰酶+10 g/L溶壁酶)中反應(yīng)2.5 h；以0.713 mol/L NaCl為穩(wěn)滲劑，所獲得的原生質(zhì)體使用STC溶液調(diào)節(jié)密度為2×107～5×107mL-1，每管200 μL分裝。

1.2.3 原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化 參照侯甲男等[17]的方法，略作調(diào)整,將NQ8GⅡ4原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化表達(dá)載體。分別吸取20 μg表達(dá)載體pFL2、pDL2、r-KNT、KNTG裝入有200 μL NQ8GⅡ4菌株原生質(zhì)體的離心管中，輕輕混勻，冰上靜置20 min，加入1.25 mL PTC輕微翻轉(zhuǎn)混勻，冰上再靜置20 min，轉(zhuǎn)至50 mL離心管中，加入10 mL TB3培養(yǎng)基(含50 mg/L Amp)，25 ℃、175 r/min培養(yǎng)過(guò)夜。將培養(yǎng)過(guò)夜的原生質(zhì)體加入融化降溫至45 ℃的Bottom Agar培養(yǎng)基(含50 mg/L Amp+20 mg/L HmB(或80 mg/L G418))中混勻倒平板。將平板于25 ℃倒置培養(yǎng)2 d后，再鋪10 mL Top Agar培養(yǎng)基(含50 mg/L Amp+30 mg/L HmB(或100 mg/L G418))，25 ℃倒置培養(yǎng)7 d后挑取單菌落，轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基(含50 mg/L Amp+30 mg/L HmB(或100 mg/L G418))上復(fù)篩2次，能再生的視為轉(zhuǎn)化子。轉(zhuǎn)化效率(株/μg)=再生轉(zhuǎn)化子數(shù)量/表達(dá)載體的質(zhì)量。

1.2.4 轉(zhuǎn)化子的PCR檢測(cè) 使用Biospin真菌基因組DNA提取試劑盒提取轉(zhuǎn)化子菌落DNA。PCR反應(yīng)體系(25 μL)：2×EcoTaq?PCR SuperMix(+dye)12.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)(表1)各0.5 μL，DNA模板1 μL，ddH2O補(bǔ)足。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，55～61.4 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃ 保存。試驗(yàn)同時(shí)設(shè)表達(dá)載體和野生型菌株對(duì)照。PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)(Azure c200，美國(guó))分析結(jié)果。

表1 本研究所用的引物Table 1 Primers used in this study

1.2.5 轉(zhuǎn)化子的熒光觀察 使用埋片法[18]或壓片法[19]獲得NQ8GⅡ4野生型菌株和轉(zhuǎn)化子菌株的菌絲，熒光顯微鏡(Olympus BX51，日本)400倍下觀察，記錄菌絲發(fā)熒光和不發(fā)熒光的轉(zhuǎn)化子。

1.2.6 轉(zhuǎn)化子的遺傳穩(wěn)定性檢測(cè) 根據(jù)研究人員Bernardi-Wenzel等[20]的方法，略作調(diào)整，檢測(cè)轉(zhuǎn)化子的遺傳穩(wěn)定性。將野生型及再生的NQ8GⅡ4轉(zhuǎn)化子接種在含有50 mg/L Amp+30 mg/L HmB(或100 mg/L G418)的PDA平板上，25 ℃培養(yǎng)7 d，從邊緣挑取菌絲接種于不含抗生素的PDA平板上，重復(fù)5次，然后再接種于含有50 mg/L Amp+30 mg/L HmB(或100 mg/L G418)的PDA平板上，對(duì)比繼代后轉(zhuǎn)化子的生長(zhǎng)情況和熒光強(qiáng)度。遺傳穩(wěn)定率=第5代轉(zhuǎn)化子數(shù)目/第1代轉(zhuǎn)化子數(shù)目×100%。

1.2.7 熒光轉(zhuǎn)化子的拮抗活性測(cè)定 根據(jù)胡麗杰[21]的方法，采用平板對(duì)峙法測(cè)定NQ8GⅡ4野生型菌株和轉(zhuǎn)化子對(duì)枸杞膠孢炭疽菌的拮抗活性。

抑菌率=[(對(duì)照菌落直徑-各處理菌落直徑)/(對(duì)照菌落直徑-原菌餅直徑)]×100%。

1.2.8 熒光轉(zhuǎn)化子的致病性檢測(cè) 根據(jù)崔偉業(yè)等[22]的方法，略作調(diào)整，檢測(cè)熒光轉(zhuǎn)化子的致病性。采集健康枸杞葉片，用體積分?jǐn)?shù)75%酒精消毒30 s，再用體積分?jǐn)?shù)7%次氯酸鈉處理8 min，無(wú)菌水沖洗5次，吸取5 μL濃度為107個(gè)/mL的NQ8GⅡ4野生型菌株或轉(zhuǎn)化子孢子懸浮液滴加于枸杞葉片上，培養(yǎng)48 h，觀察病斑情況。以滴加無(wú)菌水處理的葉片為陰性對(duì)照，以滴加枸杞膠孢炭疽菌孢子懸浮液處理的葉片為陽(yáng)性對(duì)照。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 23軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)(Duncan’s，α=0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗生素對(duì)NQ8GⅡ4菌株生長(zhǎng)的抑制作用

采用生長(zhǎng)速率法測(cè)定NQ8GⅡ4菌株對(duì)抗生素HmB和G418的敏感性。結(jié)果(圖1)表明，當(dāng)PDA平板中含有20 mg/L HmB 或80 mg/L G418時(shí)，NQ8GⅡ4菌株生長(zhǎng)完全停止。因此，后續(xù)試驗(yàn)選擇20 mg/L HmB用于pDL2陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的初篩，80 mg/L G418用于pFL2、r-KNT和KNTG陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的初篩。

圖中數(shù)字表示抗生素質(zhì)量濃度(mg/L)The numbers in the figure indicate concentrations of antibiotic (mg/L)圖1 抗生素對(duì)NQ8GⅡ4菌株生長(zhǎng)的影響Fig.1 Effect of antibiotic on growth of NQ8GⅡ4 strain

2.2 不同表達(dá)載體對(duì)NQ8GⅡ4菌株原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化效率

不同表達(dá)載體對(duì)NQ8GⅡ4菌株原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化效率見(jiàn)表2。

表2 不同表達(dá)載體對(duì)NQ8GⅡ4菌株原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化效率Table 2 Transformation efficiency of different expression vector transformed into protoplasts of NQ8GⅡ4 strain

由表2可知，將表達(dá)載體pFL2、pDL2、r-KNT和KNTG分別轉(zhuǎn)入NQ8GⅡ4菌株原生質(zhì)體后，獲得pFL2轉(zhuǎn)化子272株、pDL2轉(zhuǎn)化子57株、r-KNT轉(zhuǎn)化子73株和KNTG轉(zhuǎn)化子226株。其中表達(dá)載體pFL2和KNTG的轉(zhuǎn)化效率比較高，分別為13.60和11.30株/μg；表達(dá)載體pDL2和r-KNT的轉(zhuǎn)化效率較低，分別為2.85和3.65株/μg。

2.3 NQ8GⅡ4菌株轉(zhuǎn)化子的PCR檢測(cè)

隨機(jī)挑取在50 mg/L Amp+30 mg/L HmB(或100 mg/L G418)上生長(zhǎng)良好的菌落，分別提取菌絲體DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果發(fā)現(xiàn)pFL2和pDL2轉(zhuǎn)化子均可以擴(kuò)增出500 bp左右的目的條帶，r-KNT和KNTG轉(zhuǎn)化子均可以擴(kuò)增出700 bp左右的目的條帶，與表達(dá)載體擴(kuò)增出的條帶相同，而野生型NQ8GⅡ4菌株均未擴(kuò)增出目的條帶(圖2)。說(shuō)明GFP基因被成功整合到了NQ8GⅡ4菌株基因組中。

M.DNA Marker；1～15.轉(zhuǎn)化子；P.表達(dá)載體；WT.野生型菌株M.DNA Marker;1-15.Transformants;P.Expression vector;WT.Wild type strain圖2 NQ8GⅡ4菌株轉(zhuǎn)化子GFP基因的PCR檢測(cè)Fig.2 PCR detection of NQ8GⅡ4 transformants with specific GFP primer

2.4 不同表達(dá)載體NQ8GⅡ4菌株轉(zhuǎn)化子的熒光強(qiáng)度

由圖3可知，pDL2轉(zhuǎn)化子和KNTG轉(zhuǎn)化子產(chǎn)生的綠色熒光明顯強(qiáng)于r-KNT轉(zhuǎn)化子，而pFL2轉(zhuǎn)化子和野生型NQ8GⅡ4菌株均不產(chǎn)生綠色熒光。

圖3 不同表達(dá)載體NQ8GⅡ4菌株轉(zhuǎn)化子的熒光強(qiáng)度Fig.3 Fluorescence intensity of NQ8GⅡ4 transformants with different expression vectors

2.5 4種NQ8GⅡ4菌株轉(zhuǎn)化子的遺傳穩(wěn)定性

4種NQ8GⅡ4菌株轉(zhuǎn)化子的遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖4、圖5和表3。

圖4 4種NQ8GⅡ4菌株轉(zhuǎn)化子的遺傳穩(wěn)定性觀察Fig.4 Observation of mitotic stability of 4 types of NQ8GⅡ4 transformants

圖5 4種NQ8GⅡ4菌株轉(zhuǎn)化子在熒光下的遺傳穩(wěn)定性Fig.5 Fluorescence stability of 4 types of NQ8GⅡ4 transformants

表3 4種NQ8GⅡ4菌株轉(zhuǎn)化子的遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)Table 3 Detection of mitotic stability of 4 types of NQ8GⅡ4 transformants

對(duì)獲得的272株pFL2轉(zhuǎn)化子、57株pDL2轉(zhuǎn)化子、73株r-KNT轉(zhuǎn)化子和226株KNTG轉(zhuǎn)化子進(jìn)行繼代培養(yǎng)，其中183株pFL2轉(zhuǎn)化子、51株pDL2轉(zhuǎn)化子、50株r-KNT轉(zhuǎn)化子和133株KNTG轉(zhuǎn)化子均能正常生長(zhǎng)，且熒光強(qiáng)度未發(fā)生變化(圖4，圖5和表3)。說(shuō)明67.28%的pFL2轉(zhuǎn)化子、89.47%的pDL2轉(zhuǎn)化子、68.49%的r-KNT轉(zhuǎn)化子和58.85%的KNTG轉(zhuǎn)化子具有良好的遺傳穩(wěn)定性(表3)。

2.6 4種NQ8GⅡ4菌株轉(zhuǎn)化子對(duì)枸杞膠孢炭疽菌的拮抗活性

4種NQ8GⅡ4菌株轉(zhuǎn)化子對(duì)枸杞膠孢炭疽菌的拮抗活性見(jiàn)圖6和表4。

圖6 4種NQ8GⅡ4轉(zhuǎn)化子對(duì)枸杞膠孢炭疽菌的拮抗表現(xiàn)Fig.6 Antagonistic of 4 types of NQ8GⅡ4 transformants against C. gloeosporioides

表4 4種NQ8GⅡ4轉(zhuǎn)化子對(duì)枸杞膠孢炭疽菌的拮抗作用Table 4 Antagonistic role of 4 types of NQ8GⅡ4 transformants against C. gloeosporioides

皿內(nèi)對(duì)峙試驗(yàn)結(jié)果(圖6)表明，NQ8GⅡ4野生型菌株和4種轉(zhuǎn)化子與枸杞膠孢炭疽菌之間均能夠產(chǎn)生明顯的抑菌帶，病原菌的菌絲體分布不均，邊緣明顯變薄，顏色變黃褐色，菌絲的生長(zhǎng)受到明顯抑制。其中pDL2轉(zhuǎn)化子對(duì)枸杞膠孢炭疽菌抑制率為58.98%，相對(duì)于野生型NQ8GⅡ4菌株(55.29%)略有提升。pFL2轉(zhuǎn)化子、r-KNT轉(zhuǎn)化子和KNTG轉(zhuǎn)化子對(duì)枸杞膠孢炭疽菌抑菌率分別為53.29%,54.27%和52.88%，相對(duì)于野生型NQ8GⅡ4菌株略有下降,但抑菌率間差異均不顯著(表4)。

2.7 4種NQ8GⅡ4菌株轉(zhuǎn)化子對(duì)枸杞離體葉片的致病性

枸杞離體葉片致病性檢測(cè)結(jié)果(圖7)表明，4種NQ8GⅡ4菌株轉(zhuǎn)化子均不能使枸杞葉片發(fā)病，與野生型NQ8GⅡ4菌株無(wú)異。

圖7 NQ8GⅡ4菌株轉(zhuǎn)化子對(duì)枸杞離體葉片的致病性Fig.7 Pathogenicity analysis of NQ8GⅡ4 transformants on Lycium barbarum leaves

3 討 論

抗生素敏感性篩選是菌株轉(zhuǎn)化的必要前提，是影響轉(zhuǎn)化效率的重要原因之一[23]。但以抗生素作為抗性篩選標(biāo)記，通常假陽(yáng)性背景高，為克服篩選假陽(yáng)性，通常會(huì)使用高于其致死濃度的抗生素來(lái)篩選轉(zhuǎn)化子[24]。高靜等[25]在將含50 mg/L HmB Top培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的菌落挑到含有100 mg/L HmB Top培養(yǎng)基上復(fù)篩，獲得了蘋(píng)果腐爛病菌(Valsamali)轉(zhuǎn)化子。徐齊君等[16]在含250 mg/L HmB的Bottom Agar培養(yǎng)基上覆蓋一層含400 mg/L HmB的Top Agar培養(yǎng)基，獲得了GFP標(biāo)記的尖孢鐮刀菌(F.oxysporumf.sp.vasinfectum)轉(zhuǎn)化子。本研究使用含有20 mg/L HmB或者80 mg/L G418的Bottom Agar培養(yǎng)基初篩，再使用含有30 mg/L HmB或者100 mg/L G418的Top Agar/PDA培養(yǎng)基復(fù)篩，獲得pFL2轉(zhuǎn)化子272株、pDL2轉(zhuǎn)化子57株、r-KNT轉(zhuǎn)化子73株和KNTG轉(zhuǎn)化子226株，經(jīng)過(guò)熒光觀察和PCR檢測(cè)，均為陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)化效率為2.85～13.60株/μg。

由于抗生素抗性基因的差異和表達(dá)載體插入位點(diǎn)的不同，在真菌轉(zhuǎn)化中常常會(huì)出現(xiàn)夭折的轉(zhuǎn)化子。劉海青[26]建立了以潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(HPH)基因作為選擇標(biāo)記的禾谷鐮刀菌(F.graminearum)遺傳轉(zhuǎn)化體系，結(jié)果表明100%的轉(zhuǎn)化子可以穩(wěn)定遺傳。S?rensen等[27]以新霉素抗性(NEO)基因建立了禾谷鐮刀菌(F.graminearum)的遺傳轉(zhuǎn)化體系，結(jié)果顯示只有85%的轉(zhuǎn)化子可以穩(wěn)定遺傳。本研究在轉(zhuǎn)化NQ8GⅡ4菌株時(shí)出現(xiàn)了類似的結(jié)果。pDL2轉(zhuǎn)化子是以HPH基因作為抗性標(biāo)記的，其轉(zhuǎn)化子有89.47%可以穩(wěn)定遺傳，而pFL2、r-KNT和KNTG轉(zhuǎn)化子是以NEO基因作為選擇標(biāo)記的，遺傳穩(wěn)定率分別為67.28%，68.49%和58.85%，遠(yuǎn)低于pDL2轉(zhuǎn)化子的遺傳穩(wěn)定率。初步分析產(chǎn)生差異的原因可能是，NQ8GⅡ4菌株對(duì)潮霉素和遺傳霉素耐藥性存在差異。說(shuō)明在繼代培養(yǎng)過(guò)程中，有10.53%的pDL2轉(zhuǎn)化子、32.72%的pFL2轉(zhuǎn)化子、31.51%的r-KNT轉(zhuǎn)化子和41.15%的KNTG轉(zhuǎn)化子喪失了對(duì)潮霉素或遺傳霉素的抗性，可能是表達(dá)載體DNA整合到真菌基因組中一個(gè)不穩(wěn)定的區(qū)域；也可能是表達(dá)載體DNA插入后被真菌細(xì)胞內(nèi)的酶降解了；還可能是原生質(zhì)體凝聚融合形成多核體導(dǎo)致繼代培養(yǎng)中丟失了外源DNA[25]。

外源基因在微生物體內(nèi)進(jìn)行特異性表達(dá)的同時(shí)，也會(huì)改變轉(zhuǎn)化菌株的代謝途徑，增強(qiáng)轉(zhuǎn)化菌株的代謝負(fù)荷。在和其他微生物共同生長(zhǎng)的情況下，轉(zhuǎn)化菌株會(huì)處于不利地位，反映在生理特性上，即為轉(zhuǎn)化子拮抗活性和致病性的變化[28]。黃貴修等[29]發(fā)現(xiàn)，外源基因插入使橡膠多主棒孢(Corynesporacassiicola)的拮抗性發(fā)生變化。張曉斐等[30]對(duì)構(gòu)建的蕓薹生鏈格孢(Alternariabrassicicola)轉(zhuǎn)化子庫(kù)進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)有部分轉(zhuǎn)化子致病力與野生型菌株相比產(chǎn)生了差異。本研究對(duì)所獲得的pFL2、pDL2、r-KNT和KNTG等4種轉(zhuǎn)化子進(jìn)行拮抗活性和致病性比較，發(fā)現(xiàn)4種轉(zhuǎn)化子的拮抗性和致病性與野生型NQ8GⅡ4菌株無(wú)明顯差異。

綜上所述，pDL2轉(zhuǎn)化子具有良好的遺傳穩(wěn)定性，能夠產(chǎn)生較強(qiáng)的綠色熒光，拮抗活性和致病性與野生型菌株無(wú)差異，可用于研究NQ8GⅡ4菌株與宿主植物的共生機(jī)制。

4 結(jié) 論

本研究通過(guò)PEG介導(dǎo)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法，獲得272株pFL2轉(zhuǎn)化子、57株pDL2轉(zhuǎn)化子、73株r-KNT轉(zhuǎn)化子和226株KNTG轉(zhuǎn)化子。通過(guò)對(duì)比4種轉(zhuǎn)化子的熒光強(qiáng)度、遺傳穩(wěn)定性、拮抗活性和致病性發(fā)現(xiàn)，pDL2轉(zhuǎn)化子具有良好的遺傳穩(wěn)定性，產(chǎn)生的綠色熒光較強(qiáng)，拮抗性和致病性與野生型菌株無(wú)差異，可用于后續(xù)NQ8GⅡ4菌株在宿主植物中的侵染行為和定殖規(guī)律研究。