彭偉康，梁嘉樂(lè)，盧銘珊，陳曉佳，丁 航，馬衛(wèi)列，張志珍* （.廣東醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院；.廣東醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣東東莞 53808）

糖尿病是一組以高血糖為特征的代謝性疾病。隨著人們生活水平的提高、生活方式及飲食結(jié)構(gòu)的改變，糖尿病的發(fā)病率和死亡率逐年上升[1]。2013 年全球有3.82 億人患糖尿病，預(yù)計(jì)到2035 年糖尿病患病人數(shù)將增至5.92 億[2]。中國(guó)是全球糖尿病發(fā)病率增長(zhǎng)最快的國(guó)家之一，隨著患病率的上升，糖尿病所帶來(lái)的疾病負(fù)擔(dān)越來(lái)越重[3]。糖尿病會(huì)伴有心血管疾病、糖尿病腎病、糖尿病白內(nèi)障、糖尿病神經(jīng)病等并發(fā)癥，其發(fā)病率和死亡率高于無(wú)并發(fā)癥的人群[4-5]。糖尿病主要通過(guò)其大血管和微血管并發(fā)癥影響患者健康，其中糖尿病性白內(nèi)障是其重要的并發(fā)癥之一[6-7]。因此，建立穩(wěn)定性好的糖尿病性白內(nèi)障模型對(duì)研究糖尿病白內(nèi)障的發(fā)病機(jī)制、預(yù)防和治療有著重要意義。目前建立糖尿病性白內(nèi)障模型常用的方法有注射鏈脲佐菌素(STZ)、注射或者口服D-半乳糖、注射四氧嘧啶等[8]。但利用一次性注射STZ 建立糖尿病性白內(nèi)障模型的報(bào)道甚少，且注射大劑量STZ 伴有較高的死亡率，為此本文旨在摸索利用尾靜脈注射STZ 建立一種死亡率低、成模率高、穩(wěn)定性好的大鼠糖尿病性白內(nèi)障模型的實(shí)驗(yàn)方法。

1 材料和方法

1.1.1 儀器 臺(tái)式低溫離心機(jī)(Beckman 公司)；血糖檢測(cè)儀(ONE TOUCH 公司)；7180 型全自動(dòng)生化分析儀(HITACHI 公司)。

1.1.2 材料 50 只雄性SPF(specific pathogen free)級(jí)Wistar 大鼠，日齡為42 d，體質(zhì)量為160～180 g，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。STZ 和戊巴比妥鈉購(gòu)自Sigma 公司；其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。0.22 μm 過(guò)濾器購(gòu)自Millipore 公司；10 號(hào)灌胃針購(gòu)自上海金鐘醫(yī)療器械有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物飼養(yǎng) 雄性Wistar 大鼠單獨(dú)房間飼養(yǎng)，室溫24～26 ℃，濕度50%，晝夜交替時(shí)長(zhǎng)12 h，自由進(jìn)食飲水。水為高壓滅菌水，飼料為SPF 級(jí)普通維持飼料(購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，每3 d 更換1 次墊料。

1.2.2 糖尿病性白內(nèi)障動(dòng)物模型建立 50 只雄性Wistar 大鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，隨機(jī)分為模型組(30只)、枸櫞酸鈉緩沖溶液組(10 只，簡(jiǎn)稱(chēng)緩沖溶液組)和正常對(duì)照組(10 只)。造模前1 d 大鼠禁食12 h，模型組腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉(50 mg/kg)后，以60 mg/kg 劑量一次性尾靜脈注射10% STZ 溶液(STZ 溶于0.1 mol/L pH 4.5 枸櫞酸鈉緩沖液中，0.22 μm 濾器過(guò)濾，避光保存，現(xiàn)配現(xiàn)用)；緩沖溶液組用2%戊巴比妥鈉麻醉后，尾靜脈注射等量0.1 mol/L pH 4.5 枸櫞酸鈉緩沖液。正常對(duì)照組不做任何處理，自由進(jìn)食飲水，每日觀(guān)察大鼠生長(zhǎng)情況，并于1、4、8 和16 周末稱(chēng)量大鼠的體質(zhì)量。

1.2.3 血糖測(cè)定 注射10% STZ 后，于1、4、8 和16周末分別測(cè)定不同組的空腹血糖水平。測(cè)定前1 d晚上禁食，95%乙醇消毒鼠尾后取靜脈血，用血糖儀測(cè)量血糖水平。大鼠空腹血糖＞11.6 mmol/L 視為糖尿病模型建立成功。繼續(xù)觀(guān)察，直至晶狀體皮質(zhì)渾濁白內(nèi)障出現(xiàn)。

1.2.4 血脂測(cè)定 注射10% STZ 后，于16 周測(cè)定不同組大鼠的血脂4 項(xiàng)。測(cè)定前1 d 晚上禁食，后頸椎脫臼法處理大鼠，右心室取靜脈血于5 mL 離心管，室溫放置15 min，4 ℃4 000 r/min 離心10 min，分離血清，-80 ℃保存。采用全自動(dòng)生化分析儀通過(guò)質(zhì)控，按標(biāo)準(zhǔn)化值標(biāo)定后開(kāi)始測(cè)定血清甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平。

1.2.5 晶狀體渾濁觀(guān)察 每日觀(guān)察大鼠眼睛變化，拍照并記錄渾濁出現(xiàn)的時(shí)間。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中根據(jù)晶狀體出現(xiàn)渾濁的程度分為:晶狀體完全透明/未出現(xiàn)渾濁(-)、渾濁出現(xiàn)(+)、渾濁嚴(yán)重(++)、完全渾濁(+++)4 個(gè)等級(jí)[8-10]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad Prism 7.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以±s表示，采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 注射STZ 前后大鼠體質(zhì)量的變化

造模前(0 周)3 個(gè)組的大鼠體質(zhì)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；造模3 d 后，模型組大鼠的精神狀態(tài)變差，進(jìn)食量、飲水量、尿量增多，尿液呈爛蘋(píng)果味道。正常對(duì)照組和緩沖溶液組的大鼠體質(zhì)量在0～16 周內(nèi)持續(xù)上升，至16 周分別達(dá)487.0 和478.2 g；模型組體質(zhì)量增長(zhǎng)緩慢，從4 周開(kāi)始糖尿病“三多一少”的癥狀逐步明顯，與正常對(duì)照組和緩沖溶液組相比，4～16周各階段的體質(zhì)量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。整個(gè)造模期間，模型組有2 只大鼠于第1 周時(shí)死亡，死亡率為6.7%。造模4 周時(shí)，有6 只大鼠空腹血糖＜11.6 mmol/L，從模型組剔除。見(jiàn)表1。

表1 注射STZ 后不同時(shí)間Wistar 大鼠體質(zhì)量的比較 (g)

2.2 不同組大鼠血糖水平

正常對(duì)照組和緩沖溶液組大鼠空腹血糖均處于正常范圍(＜11.6 mmol/L)，各階段組間血糖差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。造模1 周后，模型組大鼠空腹血糖逐漸升高，與造模前相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。造模16周時(shí)，模型組空腹血糖升高至25.3 mmol/L，各階段空腹血糖與正常對(duì)照組和緩沖溶液組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。見(jiàn)表2。

2.3 不同組大鼠血脂水平

造模16 周后，與正常對(duì)照組和緩沖溶液組相比，模型組大鼠的血清HDL-C 水平升高(P＜0.05)，而血清TG、TC 和LDL-C 水平則差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)表3。

2.4 大鼠晶狀體渾濁的變化

正常對(duì)照組和緩沖溶液組大鼠晶狀體，整個(gè)造模期間一直保持澄清透明。模型組大鼠從第5 周開(kāi)始晶狀體逐漸出現(xiàn)渾濁，且晶狀體渾濁非雙眼同時(shí)出現(xiàn)。晶狀體開(kāi)始出現(xiàn)病變1 周內(nèi)，渾濁情況加重，1～2 周后出現(xiàn)乳白色渾濁。模型組大鼠晶狀體完全渾濁主要集中在實(shí)驗(yàn)6～9 周，晶狀體渾濁變化見(jiàn)圖1。16 周后共有15 只大鼠出現(xiàn)晶狀體渾濁，成模率達(dá)68.2%，見(jiàn)表4。

表2 Wistar 大鼠不同時(shí)間的血糖水平 (mmol/L)

表3 Wistar 大鼠16 周后血脂水平 (mmol/L)

表4 Wistar 大鼠不同階段晶狀體混濁程度的發(fā)生情況

圖1 Wistar 大鼠晶狀體渾濁變化

3 討論

糖尿病性白內(nèi)障是糖尿病最常見(jiàn)的眼部并發(fā)癥之一，建立糖尿病性白內(nèi)障動(dòng)物模型首先要建立糖尿病動(dòng)物模型，使用STZ 誘導(dǎo)建立糖尿病動(dòng)物模型被廣泛應(yīng)用于糖尿病和并發(fā)癥的研究，該方法成模率高[8,11]。STZ 的作用機(jī)制是通過(guò)破壞胰島β 細(xì)胞，使胰島素分泌不足導(dǎo)致糖尿病，模型動(dòng)物在高血糖的基礎(chǔ)上進(jìn)一步并發(fā)白內(nèi)障，但是該動(dòng)物模型的誘導(dǎo)成功率受STZ 濃度、給藥途徑、動(dòng)物年齡、性別及體質(zhì)量多方面因素的影響，尤其是高劑量的STZ 會(huì)引起動(dòng)物死亡[12]。目前，全世界糖尿病發(fā)病以Ⅱ型糖尿病為主。腹腔注射STZ 操作簡(jiǎn)單、快速，是建立糖尿病模型的常用方法。已有文獻(xiàn)報(bào)道，小劑量連續(xù)多次注射STZ 與人類(lèi)Ⅰ型糖尿病相似，大劑量一次性注射與人類(lèi)Ⅱ型糖尿病相似，而且一次性尾靜脈注射較一次性腹腔注射成模率更高[13]，但是大劑量注射STZ 一直沒(méi)有一個(gè)確切規(guī)定的范圍。

利用一次性注射STZ 建立糖尿病性白內(nèi)障動(dòng)物模型的常用方法是腹腔注射1% STZ，劑量為50 mg/kg[9-10]，但注射1% STZ 建立模型，仍出現(xiàn)較高死亡率，可能與輸液量過(guò)多、體循環(huán)血容量增加有關(guān)，此時(shí)大鼠處于麻醉狀態(tài)，心率減慢，心容量負(fù)荷增加，出現(xiàn)心力衰竭而導(dǎo)致死亡[9,12]。除常用50 mg/kg STZ劑量外，還有使用腹腔注射50～65 mg/kg STZ 劑量，也有使用腹腔注射70 mg/kg STZ 及35 mg/kg STZ 劑量建立模型。綜合考慮實(shí)際病情和成模率，本實(shí)驗(yàn)采用以60 mg/kg 劑量一次性尾靜脈注射10% STZ 的方法建立糖尿病性大鼠模型。尾靜脈注射10% STZ 1 周后，大鼠空腹血糖明顯升高，達(dá)到17.3 mmol/L，與造模前相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。造模4 周時(shí)，有6 只大鼠空腹血糖低于11.6 mmol/L，糖尿病模型成功率達(dá)80%。觀(guān)察發(fā)現(xiàn)，大鼠血糖穩(wěn)定升高4 周后，白內(nèi)障病程進(jìn)展較快，晶狀體出現(xiàn)病變后1～2周，出現(xiàn)乳白色渾濁，晶狀體完全渾濁主要集中在實(shí)驗(yàn)6～9 周。白內(nèi)障的發(fā)病率也與實(shí)驗(yàn)大鼠的性別、年齡等相關(guān)，由于雌鼠的胰島素水平比雄鼠高，有更大的胰島素抵抗效應(yīng)，為此我們選用體重160～180 g的雄性Wistar 大鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，在糖尿病及白內(nèi)障模型的建立方面耗時(shí)更短，本實(shí)驗(yàn)中糖尿病性白內(nèi)障大鼠成模率達(dá)68.2%。

另外，模型組血脂測(cè)定發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組和緩沖溶液組相比，模型組大鼠的血清HDL-C 水平升高(P＜0.05)，而血清TG、TC 和LDL-C 水平則差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，這可能是機(jī)體存在適應(yīng)性代償機(jī)制，使得HDL-C 出現(xiàn)暫時(shí)性代償性升高。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)采用60 mg/kg 劑量一次性尾靜脈注射10% STZ 的方法成功建立大鼠糖尿病性白內(nèi)障模型。該模型具有糖尿病發(fā)病率高、死亡率低、穩(wěn)定性好，且白內(nèi)障發(fā)病時(shí)間較早、成模速度快等優(yōu)點(diǎn)。后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，需進(jìn)一步優(yōu)化STZ 的劑量，以提高糖尿病性白內(nèi)障模型的成模率。