蔣智文，謝汶蓉，王 悅，劉新光，4，孫雪榮* （1.廣東醫(yī)科大學(xué)衰老研究所，廣東東莞 523808；2.廣東省醫(yī)學(xué)分子診斷重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東東莞 523808；3.廣東醫(yī)科大學(xué)東莞科研中心，廣東東莞 523808;4.廣東醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究所，廣東湛江 524023）

AHA1(activator of heat shock 90kDa protein ATPase homolog 1) 為Hsp90 的協(xié)調(diào)分子伴侶，對(duì)激活Hsp90的ATPase 的活性至關(guān)重要[1]。研究發(fā)現(xiàn)，Hsp90 在惡性黑色素瘤患者的血清及惡性黑色素瘤組織中的表達(dá)明顯上調(diào)[2-3]，并且高表達(dá)的Hsp90 已經(jīng)成為黑色素瘤一種重要的分子標(biāo)記[4]。使用Hsp90 蛋白的抑制劑抑制腫瘤細(xì)胞的增殖時(shí)，AHA1 的表達(dá)量卻持續(xù)上調(diào)[5]，表明AHA1 的表達(dá)可能也與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，AHA1 在骨肉瘤細(xì)胞中呈高表達(dá)[6]，并且Aha1基因的表達(dá)可以調(diào)節(jié)骨肉瘤細(xì)胞的增殖和細(xì)胞周期[7]。我們前期的研究結(jié)果表明，Aha1基因的表達(dá)參與調(diào)節(jié)惡性黑色素瘤細(xì)胞的增殖與細(xì)胞周期[8]，但是Aha1基因在黑色素瘤的形成過程中的作用尚未明了。本研究旨在研究Aha1基因是否參與黑色素瘤的形成以及對(duì)黑色瘤細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

B16F10 細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，無特定病原體(SPF)級(jí)C57BL/6 小鼠購自中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心。細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM 和血清FBS 購自Gibco 公司。pCMV-HA 與pCMV-HA-AHA1 真核表達(dá)載體為本實(shí)驗(yàn)室前期自行構(gòu)建的質(zhì)粒。TRIzol 和LipofectamineTM3000 購 自Invitrogen 公司，PrimeScript Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis Kit 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa 公司，熒光定量PCR 試劑TransStart Green qPCR SuperMix購自北京全式金生物。RIPA 裂解液購自北京索萊寶公司，蛋白酶抑制劑Cocktail 購自Thermo Scientific 公司，BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒購自碧云天公司，甲叉雙丙烯酰胺購自Bio-Rad 公司，TEMED、過硫酸銨、SDS購自Sigma 公司，聚偏二氟乙烯(PVDF)膜購自Millipore 公司，ECL 試劑盒購自Pierce 公司。AHA1抗體(sc-166065) 購自Santa-Cruz 公司，a-Tubulin 抗體(T5168)購自Sigma-Aldrich 公司。CCK8 試劑購自Dojindo 公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 使用含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，在體積分?jǐn)?shù)為5%CO2、37 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中對(duì)B16F10 細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.2 建立小鼠黑色素瘤B16F10 細(xì)胞移植瘤模型

以胰酶消化培養(yǎng)B16F10 小鼠黑色素瘤細(xì)胞后，使用PBS 重懸B16F10 細(xì)胞并進(jìn)行計(jì)數(shù)，制備5×107個(gè)細(xì)胞的懸液。然后在SPF 級(jí)C57BL/6 小鼠的皮下注射0.1 mL 的B16F10 細(xì)胞懸液(即5×106個(gè)細(xì)胞)。每次接種5 只小鼠。觀察并記錄接種B16F10 細(xì)胞后的C57BL/6 小鼠身體質(zhì)量、成瘤時(shí)間和腫瘤大小等信息。

1.2.3 小鼠黑色素瘤和瘤旁組織的收集 C57BL/6小鼠成瘤14 d 后，脫頸處死小鼠后，解剖取出小鼠黑色素瘤和瘤旁組織，然后立即浸入液氮罐進(jìn)行速凍。速凍后立即分別提取組織的mRNA 和總蛋白質(zhì)，或?qū)⑺賰龊蟮暮谏亓龊土雠越M織凍存于-80 ℃冰箱中備用。

1.2.4 小鼠黑色素瘤和瘤旁組織中總mRNA 和總蛋白質(zhì)的提取 取液氮速凍的小鼠黑色素瘤和瘤旁組織，以研磨機(jī)進(jìn)行研磨后，用TRIzol 試劑提取組織中的總RNA，然后以PrimeScript Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis Kit 逆轉(zhuǎn)錄試劑將mRNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?；使用RIPA(添加蛋白酶抑制Cocktail) 裂解研磨后的小鼠黑色素瘤和瘤旁組織，再采用BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定提取組織中的總蛋白，立即進(jìn)行SDS-PAGE，或-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 定量PCR 使用Aha1的引物(上游5′-CAG AGGGACACTTTGCCACCA-3′，下 游5′-CTCGACCTT CCATGCACAGCT-3′)，內(nèi)參β-Actin 基因的引物(上游5′-TGCGTGACATTAAGGAGAAGC，下 游5′-AGGAAG GAAGGCTGGAAGAG-3′)，進(jìn)行定量PCR，測(cè)定Aha1基因在小鼠黑色素瘤和瘤旁組織中的mRNA 水平。

1.2.6 免疫印跡檢測(cè) 配制12%分離膠后，將測(cè)定濃度后并蛋白變性后的蛋白質(zhì)加入濃縮膠中，行SDS-PAGE 凝膠電泳，電泳結(jié)束后進(jìn)行濕法轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜后的PVDF 膜使用5%脫脂奶粉在室溫條件下進(jìn)行封閉，然后加入一抗于4 ℃條件下孵育過夜，TBS+1‰ 吐溫洗3 次，加入二抗并于室溫條件下孵育1 h，再用TBS+1‰ 吐溫洗3 次，最后ECL 化學(xué)發(fā)光液，于Azure Biosystems C400 凝膠成像系統(tǒng)曝光拍照。結(jié)果使用mage J 進(jìn)行灰度值分析，實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3 次。

1.2.7 細(xì)胞增殖檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長期的B16 細(xì)胞接種至96 孔板，每組設(shè)4 個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后，使用LipofectamineTM 3000 試劑，遵照操作說明分別轉(zhuǎn)染空載體pCMV-HA(對(duì)照組)和AHA1的過表達(dá)載體pCMV-HA-AHA1(實(shí)驗(yàn)組)。繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后，每孔分別加入10 μL 的CCK8 試劑，然后轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)1 h 后，使用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定細(xì)胞在450 nm 處的吸光度。

1.2.8 AnnexinV-FITC/PI 雙染檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取對(duì)數(shù)生長期的B16 細(xì)胞制成5×105個(gè)/mL 單細(xì)胞懸液，取2 mL 接種于6 孔板中。繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后，使用LipofectamineTM 3000 試劑分別轉(zhuǎn)染空載體pCMVHA(對(duì)照組)和AHA1 的過表達(dá)載體pCMV-HAAHA1(實(shí)驗(yàn)組)。轉(zhuǎn)染48 h，使用胰酶消化細(xì)胞，2 000 r/min離心10 min 后，經(jīng)PBS 漂洗，再用1×Binding Buffer，重懸細(xì)胞至1×106個(gè)/mL。取細(xì)胞懸液100 μL 至流式管中，按AnnexinV-FITC/PI 試劑盒操作說明，依次加入FITC-Annexin V 和PI 溶液，室溫避光孵育30 min 后，使用BD FACS CantoⅡ流式細(xì)胞儀(BD，USA)進(jìn)行檢測(cè)。最后使用FlowJo 7.6 軟件對(duì)細(xì)胞凋亡的結(jié)果進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 Aha1 基因在黑色素瘤及瘤旁組織中的表達(dá)

提取小鼠黑色素瘤及瘤旁的組織后，分別提取RNA 后，采用qRT-PCR 的方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，小鼠黑色素瘤旁的組織中Aha1基因的mRNA 水平約為黑色素瘤中的2 倍(圖1a);提取小鼠黑色素瘤及瘤旁組織，然后分別提取組織中的蛋白，采用免疫印跡的方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，黑色素瘤旁中的AHA1 蛋白顯著高于黑色素瘤組織(圖1b)。上述結(jié)果表明，黑色素瘤中Aha1基因的表達(dá)顯著低于黑色素瘤旁的組織中的表達(dá)。

圖1 Aha1 基因在黑色素瘤及瘤旁組織中的表達(dá)

2.2 AHA1 過表達(dá)對(duì)黑色素瘤B16F10 細(xì)胞增殖的影響

在B16F10 細(xì)胞中，AHA1 過表達(dá)48 h 后，B16F10細(xì)胞在450 nm 處的吸光度為0.44±0.08，而轉(zhuǎn)染pCMVHA 空載體的B16F10 細(xì)胞(對(duì)照組)在450 nm 處的吸光度為0.26±0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05)。

2.3 AHA1 過表達(dá)對(duì)B16F10 細(xì)胞凋亡的影響

在B16 細(xì)胞中過表達(dá)AHA1 蛋白后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)得到AnnexinV-FITC/PI 雙染雙變量散點(diǎn)圖。與對(duì)照組相比，AHA1 蛋白過表達(dá)導(dǎo)致早期凋亡率(Q3)和晚期凋亡率(Q2)明顯上升(如圖2 所示)。AHA1 的過表達(dá)導(dǎo)致B16F10 細(xì)胞的總凋亡率(Q2+Q3) 顯著增加(P＜0.05)，見表1。

表1 AHA1 過表達(dá)對(duì)B16F10 細(xì)胞凋亡的影響 (±s，n=3)

表1 AHA1 過表達(dá)對(duì)B16F10 細(xì)胞凋亡的影響 (±s，n=3)

與對(duì)照組比較:aP＜0.05

圖2 AnnexinV-FITC/PI 雙染法檢測(cè)AHA1 蛋白對(duì)黑色素瘤B16F10 細(xì)胞凋亡的影響

3 討論

惡性黑色素瘤是一種源于黑色素細(xì)胞的發(fā)病隱匿、侵襲性強(qiáng)、致死率高的高度惡性腫瘤[9]。Hsp90 為黑色素瘤一個(gè)重要的分子標(biāo)記物，在惡性黑色素瘤及普通黑色素瘤細(xì)胞高表達(dá)[10]，并且Hsp90 蛋白在轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的表達(dá)量高于原發(fā)性黑色素瘤的表達(dá)量[2-4]。AHA1 作為Hsp90 的協(xié)同伴侶分子，與Hsp90相互作用后促進(jìn)Hsp90 蛋白構(gòu)象的變化進(jìn)而激活Hsp90 蛋白的ATPase 活性[11]。Aha1表達(dá)是否與惡性黑色素瘤的發(fā)生相關(guān)，目前尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。但基于AHA1 對(duì)黑色素瘤其中一個(gè)標(biāo)記物Hsp90 蛋白的ATPase 活性的激活作用，推測(cè)Aha1可能也與黑色素的形成相關(guān)。通過比較小鼠黑色素瘤與瘤旁組織中Aha1基因的表達(dá)，我們發(fā)現(xiàn)Aha1基因在黑色素瘤中的表達(dá)顯著低于相應(yīng)瘤旁組織。Aha1基因在膀胱癌、結(jié)腸癌、肝癌和肺癌等腫瘤中的表達(dá)顯著高于相應(yīng)的正常組織；然而Aha1基因在皮膚癌、卵巢癌和子宮癌中的表達(dá)明顯低于相應(yīng)的正常組織[12]。另據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，抑癌基因TP53 在惡性黑色素瘤中只有10%～20% 存在突變，而在肺癌和結(jié)腸癌等腫瘤中存在高達(dá)80%～90%的突變[13]。這些研究結(jié)果表明，Aha1基因在不同腫瘤細(xì)胞中的作用可能不盡相同，并且Aha1基因在黑色素瘤中的作用可能與在皮膚癌、卵巢癌和子宮癌中的作用更相似，即低表達(dá)的Aha1基因更有利于惡性黑色素瘤的形成。

在黑色素瘤細(xì)胞中過表達(dá)Aha1基因，我們發(fā)現(xiàn)黑色素瘤細(xì)胞的生長受到抑制，細(xì)胞周期被組織在G1 期[8]，并且促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞的凋亡。我們注意到，Aha1基因在骨肉瘤細(xì)胞中高表達(dá)，抑制骨肉瘤細(xì)胞中Aha1基因的表達(dá)，導(dǎo)致更多的骨肉瘤細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞凋亡程序[7]。表明Aha1在惡性黑色素瘤與骨肉瘤中的作用迥異。高表達(dá)的Aha1可能有利于骨肉瘤的形成；而在惡性黑色素瘤中，高表達(dá)的Aha1通過促進(jìn)黑色素瘤的凋亡，抑制黑色素瘤細(xì)胞的增殖，進(jìn)而抑制黑色素瘤的形成?？傊?，本研究發(fā)現(xiàn)高表達(dá)的Aha1能夠通過抑制黑色素瘤的生長，促進(jìn)黑色素細(xì)胞的凋亡，進(jìn)而抑制黑色素瘤的形成。然而Aha1在惡性黑色素瘤中的分子機(jī)理還有待更進(jìn)一步的研究。