楚元奎，路玉祥，方丹丹，楊 麗，李 元，郭 樂，楊 華

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，研究顯示，2018年全球乳腺癌的年患病人數(shù)超過208萬，死亡數(shù)超過62萬[1]。2019年國(guó)家癌癥中心發(fā)布的最新統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，2015年我國(guó)乳腺癌的新發(fā)病例約為30.4萬，位列女性惡性腫瘤的首位。尋找有效的分子診斷和治療靶點(diǎn)對(duì)于提高乳腺癌的早治早診率和乳腺癌患者的生存率具有重要意義。微小RNA(miRNAs)在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著重要的角色[2]。研究證實(shí)抑癌miRNAs的沉默與其啟動(dòng)子區(qū)的高甲基化狀態(tài)有關(guān)[3]；地西他濱(5-雜氮-2′脫氧胞苷酸，DAC)是一種去甲基化藥物，可有效逆轉(zhuǎn)抑癌miRNAs啟動(dòng)子的高甲基化狀態(tài)，促進(jìn)抑癌miRNAs的表達(dá)，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[4-5]。本研究擬通過qRT-PCR和甲基化特異性PCR(Methylation specific PCR，MSP)檢測(cè)明確乳腺癌細(xì)胞中miR-5047的表達(dá)水平及其啟動(dòng)子的甲基化狀態(tài)，以及地西他濱處理對(duì)miR-5047啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)和miR-5047表達(dá)的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 細(xì)胞株：MCF-10A、MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)。

1.1.2 主要試劑：DMEM培養(yǎng)基(Gibico公司)，胎牛血清(BI公司)，Trizol試劑、DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)，EpiTect Bisulfie kit(Qiagen公司)，HiScript II Q RT SuperMix for qPCR和 ChamQ SYBR qPCR Master Mix(Vazyme 公司)，miR-5047啟動(dòng)子MSP、miR-5047和U6檢測(cè)引物(上海生工生物工程有限公司)，地西他濱和二甲基亞砜(DMSO，Sigma公司)

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及藥物處理： MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞培養(yǎng)于含10% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，MCF-10A細(xì)胞培養(yǎng)于人乳腺上皮細(xì)胞完全培養(yǎng)液(中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù))。上述細(xì)胞均置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-231細(xì)胞，以2×105個(gè)/孔的密度接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h后實(shí)驗(yàn)組分別加入終濃度為5 μmol/L和10 μmol/L的地西他濱；繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后，以0.25%胰酶消化收集細(xì)胞，PBS洗滌后用于相關(guān)檢測(cè)。

1.2.2 q-RT-PCR檢測(cè)miR-5047的表達(dá)：Trizol法提取MCF-10A、MDA-MB-231和MCF-7以及不同濃度地西他濱處理后MDA-MB-231細(xì)胞的總RNA，以NanoDrop One超微量分光光度計(jì)(Gene公司)測(cè)定濃度。按照Vazyme公司HiScript Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR和 ChamQ SYBR qPCR Master Mix試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和PCR檢測(cè)。miR-5047反轉(zhuǎn)錄引物5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACCTTAC-3’；miR-5047上游檢測(cè)引物5’-TTGCAGCTGCGGTTGTAA G-3’，下游檢測(cè)引物5’-CAGTGCAGGGTCCGAGGTAT-3’；U6上游引物5’-CTCGCTTCGGC AGCACA-3’，下游引物5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。使用StepOne 熒光定量PCR儀(ABI公司)進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系20 μl，反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 20 s，58 ℃ 20 s，70 ℃ 20 s，40個(gè)循環(huán)。2-ΔΔCt法計(jì)算miR-5047的相對(duì)表達(dá)量，U6作為內(nèi)參。

1.2.3 甲基化特異性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(MSP)檢測(cè)miR-5047啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)： 使用UCSC網(wǎng)站(http://genome.ucsc.edu)提取人miR-5047上游啟動(dòng)子區(qū)2 000 bp的基因序列，Methprimer在線軟件(http://www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi)設(shè)計(jì)甲基化和非甲基化特異性檢測(cè)引物，引物由上海生工生物工程有限公司合成。甲基化上游引物：5’-GTAAGGTTTAGGTATGATAATCGGA-3’，下游引物：5’-CTACCTTTTAAAAAT TACTAACACACG-3’，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度124 bp；非甲基化上游引物5’-AAGGTTTAGGTATGATAATTGGAG-3’，下游引物：5’-ACCTTTTAAAAATTACTAACACACAT-3’，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度120 bp。按照試劑盒說明書提取各組細(xì)胞基因組DNA，各取1 μg進(jìn)行亞硫酸鹽修飾。MSP反應(yīng)體系20 μl，反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，58 ℃(甲基化引物)或55 ℃(非甲基化引物)15 s，72 ℃ 15 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。取各組擴(kuò)增產(chǎn)物6 μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像儀(Bio-Rad公司)拍照分析。

2 結(jié)果

2.1 miR-5047在正常乳腺上皮和乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá):以人乳腺正常上皮MCF-10A細(xì)胞作為對(duì)照，qRT-PCR檢測(cè)人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞和MCF-7細(xì)胞中miR-5047的表達(dá)。與MCF-10A細(xì)胞相比，MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞中miR-5047的表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05),見圖1(目錄后)。

2.2 miR-5047啟動(dòng)子甲基化的分析：從UCSC網(wǎng)站提取人miR-5047上游啟動(dòng)子區(qū)2 000 bp的基因序列，Gen Script在線軟件(https://www.genscript.com)分析顯示在1 435～1 640區(qū)間存在一個(gè)CpG島。使用Methprimer在線軟件在該區(qū)域內(nèi)設(shè)計(jì)甲基化和非甲基化檢測(cè)引物，MSP檢測(cè)結(jié)果顯示，與MCF-10A細(xì)胞相比，MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞中miR-5047啟動(dòng)子呈高甲基化狀態(tài)，見圖2(目錄后)。

2.3 地西他濱對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞中miR-5047啟動(dòng)子甲基化水平的影響： 為明確去甲基化藥物地西他濱是否能夠逆轉(zhuǎn)MDA-MB-231細(xì)胞中miR-5047啟動(dòng)子的高甲基化狀態(tài)，使用5 μmol/L和10 μmol/L的地西他濱分別處理MDA-MB-231細(xì)胞，48 h 后收集細(xì)胞提取DNA，重亞硫酸鹽處理后進(jìn)行MSP檢測(cè)。結(jié)果顯示，5 μmol/L 和10 μmol/L地西他濱處理后，甲基化產(chǎn)物明顯減少，非甲基化產(chǎn)物明顯增多，見圖3(目錄后)。

2.4 地西他濱對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞中miR-5047表達(dá)的影響：為進(jìn)一步明確地西他濱是否能夠通過調(diào)節(jié)miR-5047啟動(dòng)子區(qū)的甲基化狀態(tài)從而影響miR-5047基因的表達(dá)，使用qRT-PCR法檢測(cè)不同濃度地西他濱處理后MDA-MB-231細(xì)胞中miR-5047的表達(dá)。結(jié)果顯示，5 μmol/L 和10 μmol/L地西他濱處理后，MDA-MB-231細(xì)胞中miR-5047的表達(dá)均顯著增強(qiáng)，見圖4(目錄后)。

3 討論

眾多研究表明，miRNAs作為一類可調(diào)控促癌基因或抑癌基因表達(dá)的非編碼基因參與了乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程。miR-193a可通過下調(diào)WT1的表達(dá)抑制乳腺癌的增殖和癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移[6]。miR-135-5p通過靶向作用于Smad3抑制TGF-β誘導(dǎo)的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移[7]，而miR-21則可通過直接靶向作用于LZTFL1促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[8]。miR-5047定位于人17號(hào)染色體64501214至64501313區(qū)間，研究表明miR-5047在前列腺癌[9]和宮頸癌[10]中均發(fā)揮抑癌作用，然而miR5047在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)和作用目前仍不明確。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)circERBB2在乳腺癌細(xì)胞中高表達(dá)，并可抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和遷移，生物信息學(xué)分析顯示miR5047是circERBB2的一個(gè)潛在靶標(biāo)miRNA，提示其在乳腺癌細(xì)胞中可能呈低表達(dá)，且發(fā)揮抑癌作用。本研究通過qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與正常乳腺上皮MCF-10A細(xì)胞相比，miR-5047在乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231細(xì)胞和MCF-7細(xì)胞中均呈低表達(dá)，初步證明miR-5047在乳腺癌中可能發(fā)揮抑癌作用。

地西他濱是一種去甲基化藥物，可通過逆轉(zhuǎn)抑癌基因啟動(dòng)子的高甲基化狀態(tài)，促進(jìn)其表達(dá)，進(jìn)而抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[11-13]。盡管早期研究表明地西他濱可以誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞視磺酸受體β2去甲基化，細(xì)胞周期捕獲和生長(zhǎng)抑制[14]，然而其作用機(jī)制在很大程度上仍未闡明。近年來研究顯示，地西他濱還可通過調(diào)節(jié)miRNAs啟動(dòng)子的甲基化水平參與腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)調(diào)控[15-16]，目前在乳腺癌研究中還鮮有關(guān)于地西他濱調(diào)控miRNA甲基化水平的報(bào)道。本研究通過MSP檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌細(xì)胞中，miR-5047啟動(dòng)子區(qū)的甲基化水平顯著高于正常乳腺上皮MCF-10A細(xì)胞，提示其表達(dá)下調(diào)可能與其啟動(dòng)子區(qū)的高甲基化狀態(tài)有關(guān)，課題組進(jìn)而使用5 μmol/L和10 μmol/L濃度的地西他濱分別處理乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞，MSP和qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，地西他濱處理后，miR-5047啟動(dòng)子區(qū)的甲基化水平明顯降低，與此同時(shí)，miR-5047的表達(dá)則顯著增強(qiáng)。上述結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，miR-5047在乳腺癌細(xì)胞中的低表達(dá)與其啟動(dòng)子區(qū)呈高甲基化狀態(tài)有關(guān)，去甲基化藥物地西他濱可通過降低miR-5047基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化水平促進(jìn)miR-5047的表達(dá)。以上結(jié)果為進(jìn)一步研究miR-5047在乳腺癌細(xì)胞中的作用及機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。