沈 鑫 王 波 蔣冬月

（浙江省林業(yè)科學(xué)研究院，浙江 杭州 310023）

早竹（Phyllostachys praecox），屬于禾本科（Gramineae）竹亞科（Bambusoideae）剛竹屬竹種，是我國特有的優(yōu)良栽培筍用竹種[1-2]。與很多筍用竹種相比，早竹具有出筍早、筍期長、產(chǎn)量高、筍味鮮、適應(yīng)性廣及營養(yǎng)成分豐富等特點(diǎn)[3-4]。除此之外，早竹的開花現(xiàn)象也十分普遍，但是由于早竹花粉敗育率較高、花朵發(fā)育不良等原因[5-6]，通過常規(guī)手段對早竹種質(zhì)進(jìn)行遺傳改良較為困難[7]。

輻射育種是無性繁殖植物選育新品種的有效途徑之一[8-9]，具有操作簡易、誘發(fā)變異頻率高等特點(diǎn)[10-11]，被廣泛地應(yīng)用于植物誘變育種中[12-16]。輻射誘變在竹子中的應(yīng)用起步較晚，且研究人員發(fā)現(xiàn)137Cs?γ輻射對毛竹（Phyllostachys heterocycla）、地被竹類及矢竹類等竹種的組織器官的生長發(fā)育產(chǎn)生了較為明顯的影響[17-22]。如毛竹種子經(jīng)過30 Gy和60 Gy劑量的輻射后，幼苗的光合色素含量和熒光參數(shù)值均明顯高于對照及其他劑量[19]；曙矢竹（P. japonicaf.Akebono）和花葉矢竹（P.japonicaf.Akebonosuji）的組培苗經(jīng)5～10 Gy的輻照后顯著促進(jìn)了側(cè)芽的增殖與伸長[22]。盡管如此，137Cs?γ輻射對早竹成竹生長發(fā)育的影響卻鮮有研究報道，而成竹的生長發(fā)育又與竹子的開發(fā)利用緊密相關(guān)，基于此，本研究通過測定不同劑量137Cs?γ射線輻射后早竹成竹的生長性狀，包括株高、節(jié)數(shù)、主莖粗、鞭長、鞭粗、整株質(zhì)量、葉質(zhì)量、鞭質(zhì)量及光合特性相關(guān)指標(biāo)，研究輻射對早竹成竹生長發(fā)育的影響，探索適宜早竹生長發(fā)育的劑量輻射，為今后早竹的輻射誘變育種及分子改良提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)是在浙江省林業(yè)科學(xué)研究院溫室大棚中進(jìn)行。該試驗(yàn)地處于浙江省杭州市西湖區(qū)留下街道，位于東經(jīng)120° 02′ 07′′，北緯30° 13′24′′，氣候?qū)賮啛釒Ъ撅L(fēng)氣候，夏季炎熱濕潤，冬季寒冷干燥。全年平均氣溫17.8 ℃，年平均降水量1 454 mm，年平均日照時數(shù)1 765 h，無霜期199～328 d。

1.2 材料來源

本研究所用到的植物材料為2年生早竹植株。該早竹植株是于2013年10月將輻射后的早竹竹鞭苗種于浙江省林業(yè)科學(xué)研究院溫室大棚中繁育而成，早竹竹鞭是從浙江省林業(yè)科學(xué)研究院竹種園內(nèi)獲得。

1.3 研究方法

1.3.1 輻射處理

2013年9月將早竹竹鞭苗從竹種園圃地內(nèi)取出，在掘取過程中應(yīng)盡量避免對鞭苗的損傷，將竹鞭苗放入塑料袋內(nèi)送往浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院作物與核技術(shù)利用研究所輻照中心進(jìn)行137Cs?γ輻照處理。共6個輻照劑量，分別為5、10、20、30、40 Gy和50 Gy[19,22]，劑量輻射率為1 Gy/min。每個處理重復(fù)3次，每次處理早竹竹鞭苗10株，平均株高0.5 m。用未進(jìn)行輻射處理的早竹竹鞭苗作為對照。

1.3.2 種植方法

在2013年3月進(jìn)行前期竹鞭種植（此時未進(jìn)行輻射處理，待長出竹鞭苗后進(jìn)行的輻射處理），截取0.5～0.6 m長的早竹竹鞭埋于浙江省林業(yè)科學(xué)研究院竹種園內(nèi)的圃地，鞭穴長0.7 m，寬0.2 m，深0.3 m。竹鞭苗培養(yǎng)期間水分供給一致，進(jìn)行正常的栽培管理。在輻射處理后，將輻射處理后的竹鞭苗和作為對照的竹鞭苗種于浙江省林業(yè)科學(xué)研究院溫室大棚的育苗槽內(nèi)，早竹竹鞭苗的每個劑量輻射種植株數(shù)為30株。整個實(shí)驗(yàn)采用完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，包括6個處理和1個對照，每個處理及對照重復(fù)3次，共21個區(qū)組。每條育苗槽長28 m，寬0.8 m，深0.6 m。每條育苗槽進(jìn)行均分后用于埋鞭，每個區(qū)組的槽長為4 m，鞭穴長0.7 m，寬0.2 m，深0.25 m，穴間距0.1 m，分2行進(jìn)行埋鞭，行間距0.3 m。育苗槽內(nèi)的基質(zhì)為普通土壤、泥炭、蛭石和珍珠巖混合而成，體積比為5∶3∶1∶1，該基質(zhì)pH為7.1，堿解氮120.2 mg/kg，速效磷12.3 mg/kg，速效鉀77.4 mg/kg，其中普通土壤來自浙江省林業(yè)科學(xué)院竹類植物園，泥炭、蛭石和珍珠巖購自杭州錦海農(nóng)業(yè)科技有限公司。種植期間水分供給充足一致，進(jìn)行正常的栽培管理。

1.3.3 測定方法

2015年9月6日，從不同劑量輻射和1個對照中任意選取5株進(jìn)行生長性狀的測定。株高的測定是從竹子的莖稈頂端生長點(diǎn)到基部，稈粗是總節(jié)數(shù)的1/2處的竹節(jié)的測量值，當(dāng)總節(jié)數(shù)為奇數(shù)時，是總節(jié)數(shù)+1的1/2處的竹節(jié)測量值。鞭長為竹鞭的長度，當(dāng)遇到鞭梢折斷現(xiàn)象時，則另對折斷附近的岔鞭進(jìn)行測定；鞭徑為竹鞭總長1/2部位的直徑。整株質(zhì)量是竹子地上部分的總質(zhì)量，葉質(zhì)量是竹子地上部分所有葉的總質(zhì)量，鞭質(zhì)量是竹鞭的質(zhì)量。

2015年9月10日至14日，天氣多云有微風(fēng)，測定時氣溫25 ℃。通過使用Li?6400XT型便攜式光合儀對早竹4個劑量輻射和1個對照的植株進(jìn)行測定，測定指標(biāo)包括凈光合速率、光飽和點(diǎn)、光補(bǔ)償點(diǎn)和暗呼吸速率。整個測定過程從早上9：00開始，12：00結(jié)束，設(shè)定光照強(qiáng)度梯 度 為2 000、1 500、1 200、1 000、800、600、400、200、100、50、20、0 μmol/(m2·s)，改變光照強(qiáng)度后，最少穩(wěn)定時間設(shè)定為120 s。測定時為保持環(huán)境的穩(wěn)定性，設(shè)定CO2濃度為當(dāng)前大氣CO2濃度，(400±20)μmol/mol；葉溫為(25±1)℃，相對濕度變化范圍為36%～52%。每個劑量輻射及對照中任意選取3株的中上部成熟葉片進(jìn)行測定。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析

生長性狀的數(shù)據(jù)分析方法為One-way ANOVA方差分析和LSD多重比較，相關(guān)性分析方法為Pearson correlation。分析軟件是R語言軟件V3.2.2，作圖軟件為ggplot2[23]。

光合特性相關(guān)指標(biāo)數(shù)值通過直角雙曲線修正模型獲得[24-25]。公式為：

式中：Pn為凈光合速率，μmol/(m2·s)；I為光合有效輻射強(qiáng)度，μmol/(m2·s)；α為植物光合作用對光響應(yīng)曲線在I= 0時的斜率，即光響應(yīng)曲線的初始量子效率（無量綱）；β和γ為系數(shù)，(m2·s)/μmol；Rd為暗呼吸速率，μmol/(m2·s)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同劑量137Cs?γ輻射對早竹生長性狀的影響

早竹的生長性狀包括竹稈生長性狀、竹鞭生長性狀和生物量累積。

1）對竹稈生長的影響：從圖1中看出輻射對早竹的株高、節(jié)數(shù)、桿粗有明顯影響，不同劑量輻射對早竹的竹稈生長產(chǎn)生了顯著抑制或是無明顯差異的作用。與對照相比，經(jīng)10 Gy處理的株高值最大，平均值分別為195.6 cm和198.6 cm，經(jīng)5 Gy輻射處理的株高值次之，之后是經(jīng)20 Gy輻射處理的植株，經(jīng)30 Gy輻射的值最小，平均值為36.8 cm，且該劑量輻射的株高變異系數(shù)最大。

2）對于節(jié)數(shù)的影響：對照和經(jīng)10 Gy輻射處理的植株的節(jié)數(shù)最多，平均值分別為38.8節(jié)和36.8節(jié)。經(jīng)5 Gy劑量的植株節(jié)數(shù)次之，之后是經(jīng)20 Gy處理的植株，最小值是經(jīng)30 Gy處理的植株，平均值為14.8節(jié)，節(jié)數(shù)變異系數(shù)最大。另外，對照植株的稈粗值最大，平均值為8.44 mm，之后依次為10、20、5、30 Gy輻射處理的植株，最小稈粗值為1.33 mm，經(jīng)30 Gy處理的變異系數(shù)最大。

3）對早竹竹鞭生長的影響：輻射對早竹竹鞭生長的影響，從圖1中可以看出，與對照植株竹鞭相比，不同劑量輻射對早竹的竹鞭生長同樣是產(chǎn)生了抑制或是無顯著差異的作用。其中對照和經(jīng)5 Gy輻射處理的植株鞭長值最大，平均值分別為230.6 cm和228 cm，經(jīng)10 Gy和20 Gy輻射的植株次之，經(jīng)30 Gy劑量輻射處理的植株鞭長值最小，平均值為31 cm。同時，對照植株的鞭徑值最大，平均值為8.27 mm，之后依次為5、10、20、30 Gy劑量輻射處理的植株，最小值為2.35 mm，30 Gy劑量的鞭長和鞭徑變異系數(shù)最大。

4）對早竹生物量累積的影響：如圖1所示，與對照植株生物量相比，不同劑量輻射處理的植株在生物量累積方面出現(xiàn)了降低和無顯著差異的結(jié)果。對照和經(jīng)5 Gy輻射處理的植株葉質(zhì)量值最大，平均值都為112 g，其余劑量處理的葉片生物量累積從高到低依次為10、20、30 Gy，且它們之間均呈顯著差異，最小平均值為6 g。對于鞭質(zhì)量，最大值為對照植株，平均值為291 g，經(jīng)5 Gy輻射處理的植株次之，之后是經(jīng)10 Gy和20 Gy輻射處理的植株，最小值為經(jīng)30 Gy處理的植株，平均值為12 g。對照和經(jīng)5 Gy輻射處理的植株整株質(zhì)量數(shù)值最大，平均值分別為170 g和165 g，之后依次是10、20、30 Gy，經(jīng)30 Gy處理的整株重平均值為14 g，且該劑量的葉質(zhì)量、鞭質(zhì)量及整株質(zhì)量的變異系數(shù)都為最大。

另外，經(jīng)過輻射處理后，40 Gy和50 Gy劑量的早竹竹鞭苗全部死亡，證實(shí)40 Gy是早竹竹鞭苗的137Cs?γ輻射的致死劑量，而在30 Gy劑量輻射下，有接近一半的早竹竹鞭苗死亡，說明30 Gy是早竹竹鞭苗的137Cs?γ輻射的半致死劑量。

圖 1 不同劑量輻射下早竹生長性狀相關(guān)性狀的差異顯著性分析Fig.1 Difference test of growth traits ofP. praecoxunder multiple radiation doses

2.2 不同劑量137Cs?γ輻射對早竹光合特性的影響

1）對光響應(yīng)曲線的影響：從圖2中可以看出，不同劑量輻射的植株在光強(qiáng)遞增的起始階段均呈現(xiàn)凈光合速率持續(xù)增強(qiáng)的趨勢，但當(dāng)光強(qiáng)達(dá)到一定數(shù)值時，凈光合速率達(dá)到最大，即達(dá)到光飽和點(diǎn)之后凈光合速率逐漸減弱。

2）對光響應(yīng)特征參數(shù)的影響：對照植株的光飽和點(diǎn)最大，其次是20、10、5 Gy，30 Gy最?。煌瑫r，不同劑量輻射的植株在達(dá)到光飽和點(diǎn)時的凈光合速率也有較大區(qū)別。根據(jù)表1列出的具體數(shù)值，對照植株最大光合速率最高，約為8.91 μmol/(m2·s)，30 Gy的最低，約為2.39 μmol/(m2·s)。另外，在光補(bǔ)償點(diǎn)中，30 Gy的植株光補(bǔ)償點(diǎn)最高，約為23.37 μmol/(m2·s)，對照植株最低，約為6.28 μmol/(m2·s)。對于暗呼吸速率，10 Gy的速 率 最 快，約 為1.43 μmol/(m2·s)，對照植株最慢，約為0.55 μmol/(m2·s)。

圖 2 不同劑量輻射下早竹光響應(yīng)曲線Fig.2 Photosynthesis-light response curve of P. praecoxunder multiple radiation doses

表 1 不同劑量輻射下早竹光合特性相關(guān)指標(biāo)Table 1 Related indicators of photosynthesis ofP. praecoxunder multiple radiation doses

2.3 早竹各性狀之間的相關(guān)性

在獲得不同劑量輻射的早竹植株生長性狀和光合特性相關(guān)指標(biāo)數(shù)值的基礎(chǔ)上，通過Pearson相關(guān)性分析，對這些性狀之間的相關(guān)性及相關(guān)程度進(jìn)行了研究。從圖3中可以看出，早竹生長性狀之間均為顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.65～0.99，表明輻射全面影響了早竹的生長，其中，葉質(zhì)量、鞭長、鞭徑和整株質(zhì)量之間的相關(guān)系數(shù)較高，均大于0.95。

光合特性相關(guān)指標(biāo)間，光飽和點(diǎn)與最大光合速率、光補(bǔ)償點(diǎn)與暗呼吸速率之間呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.93和0.8，而光飽和點(diǎn)和最大光合速率與光補(bǔ)償點(diǎn)與暗呼吸速率之間呈顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.84、-0.39、-0.72和-0.18。生長性狀與光合作用中的光飽和點(diǎn)及最大光合速率呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.59～0.97，與光補(bǔ)償點(diǎn)及暗呼吸速率之間呈顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.05～0.97，表明輻射在一定程度上影響了早竹的光合作用，且光合作用越弱，早竹的生長性狀相關(guān)性狀數(shù)值越低。

圖 3 早竹生長性狀和光合特性相關(guān)指標(biāo)Pearson相關(guān)性分析Fig.3 Pearson correlation of growth traits and related indicators of photosynthesis ofP. praecox

3 結(jié)論與討論

輻射誘變育種是利用各種射線誘發(fā)植物產(chǎn)生變異，再根據(jù)育種目標(biāo)在變異植株或其后代中篩選新材料，經(jīng)培育獲得優(yōu)良品種的技術(shù)[26]。輻射的劑量、物種、基因型及組織的選擇均會影響優(yōu)良突變體的獲得。如曾文丹等利用不同60Co-γ射線輻射劑量處理木薯組培苗，隨著輻射劑量的增加，組培苗的生根率和萌發(fā)率均顯著降低，且不同品種的變異率也存在顯著差異[27]；曹志華等對毛竹輻射誘變實(shí)生優(yōu)株的研究中發(fā)現(xiàn)，在10 Gy和50 Gy的輻射劑量下實(shí)生優(yōu)株的性狀更穩(wěn)定[28]。在輻射誘變機(jī)理方面，近年來的研究表明，輻射誘變會造成DNA序列或結(jié)構(gòu)上不同程度的改變。Li等利用二代測序技術(shù)對γ射線輻射后的水稻基因組變異情況進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)誘變后代中存在單堿基替換和小片段插入/缺失等序列變異，以及大片段插入/缺失和拷貝數(shù)變異等結(jié)構(gòu)變異[29]，這種情況同樣出現(xiàn)在擬南芥的研究中[30]。除此之外，研究還發(fā)現(xiàn)輻射誘變會導(dǎo)致表觀遺傳上的性狀突變[31]。

本研究對經(jīng)過4個劑量輻射處理的植株和未經(jīng)輻射處理的對照植株完成了包括株高、節(jié)數(shù)、稈粗等生長性狀和光合特性相關(guān)指標(biāo)的測定。通過對性狀數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)早竹竹鞭苗對不同輻射劑量的敏感程度不同，而輻射對早竹生長性狀的影響也不盡相同，主要表現(xiàn)為隨著輻射劑量的增加，早竹的生長勢越弱，生長性狀數(shù)值越低，且光合作用越弱。大多數(shù)輻射處理的植株和對照之間的性狀差異顯著，但輻射植株的生長性狀和光合作用強(qiáng)度并沒有優(yōu)于對照植株。在先前輻射對毛竹種子萌發(fā)和幼苗光合作用的研究中，研究人員發(fā)現(xiàn)一定劑量的輻射處理能夠提高毛竹種子的發(fā)芽率及幼苗光合作用相關(guān)的熒光參數(shù)值，表明一定劑量的輻射處理的確能夠在毛竹初期及早期的生長發(fā)育階段起到明顯的促進(jìn)作用[17-20]。另外，楊海蕓等對矢竹類組培苗的輻射研究中發(fā)現(xiàn)，5～10 Gy顯著促進(jìn)曙矢竹和花葉矢竹側(cè)芽的增殖與伸長，且能夠促進(jìn)辣韭矢竹（P.japonicaf.Tsutsumiana）根系生長，但20 Gy以上劑量則顯著抑制其試管苗生長[22]。然而本研究發(fā)現(xiàn)137Cs?γ輻射并未促進(jìn)早竹竹鞭苗的生長發(fā)育和光合作用，且有個別劑量在早期便遏制了其正常的生長發(fā)育，所以推測輻射對竹子生長的影響可能與接受輻射的竹種和營養(yǎng)體有較大的關(guān)系。白瑞華等在對地被竹的組培苗和竹鞭輻射后發(fā)現(xiàn)，不同竹種的輻射致死劑量差異較大，多為20～30 Gy，但有部分竹種的竹鞭耐受性較強(qiáng)，能夠超過80 Gy[21]，而本研究中30 Gy和40 Gy分別是早竹竹鞭苗的半致死劑量和致死劑量，所以竹種與輻射的耐受性關(guān)系密切。

另外，通過對早竹各劑量輻射及對照植株的生長性狀與光合特性相關(guān)指標(biāo)的相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)早竹生長性狀與最大光合速率及光飽和點(diǎn)呈顯著正相關(guān)，與光補(bǔ)償點(diǎn)及暗呼吸速率呈顯著負(fù)相關(guān)。所以推測輻射對早竹光合作用的減弱影響了其生物量的累積。