譚大聰 肖坤敏 孔德仙 馬佳鈺 郭 磊 王軍民 華 燕

（西南林業(yè)大學林學院，云南森林資源培育與利用協(xié)同創(chuàng)新中心，云南 昆明 650233）

西南遠志（Polygala crotalarioides），遠志科（Polygalaceae）遠志屬（Polygala）多年生草本植物，主要分布于我國云南、四川、西藏等地區(qū)[1]。西南遠志以根入藥，用于活血止痛、補心安神、心悸、失眠多夢、虛癆氣弱等[2]。西南遠志在云南佤族民間用藥中被稱作“娘母良”，主要用于治療食欲不振、心悸以及增強體質(zhì)、強健筋骨等[3]，現(xiàn)代藥理學研究也表明，西南遠志具有抗疲勞、抗低溫、抗缺氧、提高機體應激能力，提高機體對不良環(huán)境的適應能力的功效[4]。黃嘌呤氧化酶是人體內(nèi)產(chǎn)生尿酸過程中的關鍵酶，同時也是治療痛風時藥物的作用靶點，徐華松等[5]，Hua等[6]，蘆毅等[7]從西南遠志分離得到了1,2,3,7?四甲氧基酮等化合物，Zhu等[8]的研究表明，1,3,6,7?四羥基酮和格里菲帕維酮2個化合物對黃嘌呤氧化酶抑制活性的半抑制濃度（IC50）分 別 為1.2 μmol/L和6.3 μmol/L，和 別 嘌 呤 醇（IC50=5.3 μmol/L）的活性相當，表明西南遠志中的酮類化合物對黃嘌呤氧化酶具有較強抑制活性的能力，對治療痛風具有較好的療效。目前臨床上治療痛風的藥物只有別嘌呤醇[9]和非布司他[10]。但它們有各自不同的副作用，如別嘌呤醇會引起皮疹、過敏反應和腎病等[11]；非布司他最常見的副作用為肝功能異常、惡心、皮疹、關節(jié)痛等[12-13]。中藥治療痛風已有幾千年的歷史，從中藥中尋找高效低毒的黃嘌呤氧化酶抑制劑具有很大優(yōu)勢及良好前景[14]。西南遠志為偶見種，已經(jīng)瀕臨滅絕，目前對其酮類化合物的相關研究鮮有研究。本研究通過紫外分光光度法原理測試西南遠志中總酮的體外黃嘌呤氧化酶抑制活性和抗氧化活性，采用96孔板法測定其對金黃色葡萄球菌等5種細菌的抑制活性，利用生長速率法測定其對采絨革蓋菌等5種真菌的抑制活性，以期闡明酮類化合物抑制黃嘌呤氧化酶活性、抗氧化和抑菌活性的物質(zhì)基礎，為抗痛風藥物研制和西南遠志的綜合利用開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑和材料

Evolution 300紫外分光光度計（Thermo Fisher，美國）；DHG?9030A型不銹鋼高溫干燥箱（河南馬弗爐技術開發(fā)有限公司，中國）；Heidolph Digital旋 轉(zhuǎn) 蒸 發(fā) 儀（Heidolph Group，德 國）；BK?300GDE超聲波清洗器（陜西凱德力環(huán)?？萍加邢薰?，中國）；恒溫培養(yǎng)箱（鄭州安晟科學儀器有限公司，中國）；LDZX?50KBS立式高壓蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠，中國）；食品級AB?8大孔吸附樹脂、無水乙醇（上海源葉生物科技有限公司，中國）等；西南遠志采自云南省云縣，由西南林業(yè)大學林學院杜凡教授鑒定為遠志科植物西南遠志，標本保存在西南林業(yè)大學林學院植物資源利用系藥用植物教研室。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品的制備

稱取干燥后的西南遠志粉末10.0 g，在60 ℃條件下，用65%乙醇，按料液比1g∶30mL，回流提取2次，每次1 h，合并提取液，減壓濃縮得浸膏。以蘆丁為對照品，采用紫外分光光度法[15]測定浸膏中的總酮含量，浸膏中總酮的含量為4.45%。將浸膏用水溶解置于AB?8型大孔吸附樹脂上，用蒸餾水洗脫完全；再用30%乙醇去除皂苷類化合物；最后用90%乙醇洗脫，收集洗脫液并減壓濃縮得浸膏，即為純化后的酮類化合物。純化后酮類化合物的含量為30.22%（其余成分主要為皂苷和糖脂等化合物），純化后酮類化合物的含量提高了6.79倍?？偼?/p>

量為其質(zhì)量與浸膏質(zhì)量之比。

1.2.2 黃嘌呤氧化酶抑制活性測定

參考Masuda等[16]、李英等[17]測定方法，精密稱取1.083 8 g KH2PO4，7.315 5 g K2HPO4，加入超純水定容至250 mL，即得pH=7.5的磷酸緩沖溶液（PBS）；精密稱取18.25 mg的黃嘌呤，加入25 mL 0.05 mol/L的NaOH溶液，充分溶解后，然后加入PBS溶液定容至250 mL；取一定量的黃嘌呤氧化酶溶液，用PBS溶液配制得0.08 U/mL的黃嘌呤氧化酶工作溶液；精密稱取適量樣品，然后加PBS溶液配制成1.5、1.25、1、0.75、0.5、0.25 mg/mL等不同濃度，低溫避光保存，待用。將樣品及空白溶液（空白為PBS）4 mL，酶溶液2 mL（終濃度0.02 U/mL）于試管中，在37 ℃的水浴鍋上孵育3 min，再加入2 mL底物（終濃度0.12 mmol/L）啟動反應，在紫外分光光度計動力學模式下291 nm波長處每隔30 s讀數(shù)1次，共計5 min，每組平行測定3次。取3次的平均值，按公式（1）計算抑制率，經(jīng)非線性回歸方法計算得乙醇粗提物和純化后總酮對黃嘌呤氧化酶的IC50。

式中：(dA/dt)空白為空白組的反應速率，(dA/dt)樣品為樣品組的反應速率，dA/dt的時間段選擇在30～270 s。

1.2.3 抗氧化活性測定

DPPH自由基清除能力的測定參照孫惠芳等[18]、Kaur 等[19]的方法；ABTS自由基清除能力的測定參照韓銳等[20]、Sun等[21]的方法測定；超氧陰離子自由基（O2·?）清除能力的測定參照譚曉虹等[22]的方法；羥自由基（·OH?）清除能力的測定參照韋玉蘭等[23]的方法。

1.2.4 細菌抑制活性的測定

采用96孔板法測定其最低抑菌濃度（MIC）[24]。在96孔板中，第1～10孔加供試樣品，第11孔加空白對照，第12孔加陽性對照，在1～12孔中都加入100 μL液體培養(yǎng)基，實驗組利用二倍稀釋法加入50 μL濃度梯度為20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.312 5、0.156 3、0.078 1、0.039 1 mg/mL的樣品，第1～10孔的最終濃度分別為5、2.5、1.25、0.625、0.312 5、0.156 3、0.078 1、0.039 1、0.019 5、0.009 8 mg/mL，每個濃度均設3個復孔做平行對照，空白對照加入50 μL無菌水，陽性對照組加入0.1 g /L的鏈霉素溶液50 μL。每孔中加入50 μL菌液，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 d，加入0.2 g /L的碘硝基四唑紫40 μL，以是否出現(xiàn)紫色來檢查有無細菌生長，以不出現(xiàn)紫色的微孔濃度為最低抑菌濃度[25-26]，所有操作均在無菌條件下操作。

1.2.5 真菌抑制活性的測定

生長速率法[27]：采用二倍稀釋法配制成濃度分別為1、0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25 mg /mL的樣品溶液，121 ℃滅菌22 min后轉(zhuǎn)移至超凈工作臺中分裝至無菌培養(yǎng)皿（9 cm直徑）中。溶劑對照采用不加樣品的無菌水，空白對照為不加任何樣品和溶液的PDA培養(yǎng)基。用滅菌后的5 mm打孔器在已活化好的病原真菌菌落上打取菌餅，在每個培養(yǎng)皿中心位置放1個菌餅，然后標記后放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)10 d，觀測記錄，所有病原真菌應在同一天內(nèi)接種完畢。按公式（2）[28]計算抑菌率（IR），經(jīng)非線性回歸方法計算得各菌的半抑制濃度（EC50）。

式中：D0為空白對照凈直徑，Ds為處理組凈直徑，Dn為溶劑對照凈直徑。

2 結(jié)果與分析

2.1 西南遠志乙醇粗提物和純化后總酮對黃嘌呤氧化酶的抑制活性

圖 1 西南遠志乙醇粗提物和純化后總酮對黃嘌呤氧化酶的抑制活性Fig.1 Inhibitory activity of the crude ethanol extract and the xanthone compounds after purification from P. crotalarioidesagainst xanthine oxidase

2.2 西南遠志乙醇粗提物和純化后總酮對4種自由基的抑制活性

7.33 μg/mL。

圖 2 西南遠志乙醇粗提物和純化后總酮對4種自由基的抗氧化活性Fig.2 Antioxidant activity of the crude ethanol extract and the xanthone compounds after purification fromP. crotalarioidesagainst 4 radicals

2.3 西南遠志純化后的總酮對5種細菌的抑制活性

5 mg/mL。

表 1 純化后酮類化合物對不同食源性致病菌的MICTable 1 The MIC of purified xanthone compounds against different food-borne pathogens mg/mL

表 1 純化后酮類化合物對不同食源性致病菌的MICTable 1 The MIC of purified xanthone compounds against different food-borne pathogens mg/mL

注：“-”表示無菌生長；“+”表示菌生長較弱；“++”表示菌生長較強；“+++”表示菌生長強。

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2.4 西南遠志純化后的總酮對5種真菌的抑制活性

由表2可知，在5種真菌中，對采絨革蓋菌（Coriolus versicolor）具有最強的抑菌效果，其EC50值 為0.237 9 mg/mL，其 次 為 蕓 苔 鏈 格 孢（Alternaria brassicicola）、腐皮鐮孢（Fusariumsolani）、尖孢鐮孢（Fusarium oxysporum），其EC50值分別為0.368 7、0.507 4、0.899 1 mg/mL，對禾谷鐮孢（Fusarium graminearum）的抑菌能力最弱，其EC50值為1.184 4 mg/mL。由圖3可知，在低濃度時對腐皮鐮孢的抑制活性最好，高濃度時對蕓苔鏈格孢的抑制活性最好。

表 2 純化后酮類化合物對五種真菌的抑菌活性Table 2 Antibacterial activity of purified xanthone compounds against 5 fungi

表 2 純化后酮類化合物對五種真菌的抑菌活性Table 2 Antibacterial activity of purified xanthone compounds against 5 fungi

菌種 毒力回歸方程R2EC50/(mg·mL?1)腐皮鐮孢y=0.2104x+0.394 5 0.968 6 0.507 4禾谷鐮孢y=0.246 7x+0.207 8 0.960 3 1.184 4尖孢鐮孢y=0.404 3x+0.136 5 0.985 1 0.899 1蕓苔鏈格孢y=0.772 8x+0.215 1 0.957 9 0.368 7采絨革蓋菌y=0.442 6x+0.394 7 0.989 9 0.237 9

圖 3 純化后酮類化合物對5種真菌的抑制活性Fig.3 Antibacterial activity of purified xanthone compounds against 5 fungi

3 結(jié)論與討論

黃嘌呤氧化酶是體內(nèi)核酸代謝中重要的酶，能催化黃嘌呤和次黃嘌呤的氧化生成尿酸，同時產(chǎn)生過氧化物自由基，尿酸濃度過高將導致高尿酸血癥，可引起痛風發(fā)作，自由基涉及到炎癥等一系列病理過程，抑制黃嘌呤氧化酶的活性，既可以減少體內(nèi)尿酸的形成，有效地阻止或延緩痛風及其并發(fā)癥，又可以減少自由基造成的組織傷害[29]；試驗研究表明，西南遠志中的酮類化合物具有良好的黃嘌呤氧化酶抑制活性，作為黃嘌呤氧化酶抑制劑，通過阻斷次黃嘌呤到黃嘌呤，從黃嘌呤到尿酸的轉(zhuǎn)化來降低血尿酸水平，達到預防和治療痛風的效果，為云南豐富的遠志屬植物資源的進一步高效合理利用提供科學依據(jù)。