張 瑤，陳麗展，歐陽海峰△

（1空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院呼吸內(nèi)科，陜西西安 710032；2西安國際醫(yī)學(xué)中心醫(yī)院呼吸內(nèi)科，陜西西安 710100）

Notch 信號通路進(jìn)化高度保守，在多種生物的發(fā)育過程中通過介導(dǎo)細(xì)胞間的相互作用而調(diào)控細(xì)胞分化方向。Notch 信號途徑由配體（Jagged1、Jagged2、Dll1、Dll3 和Dll4）、Notch1～4 受體及下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子和核內(nèi)應(yīng)答過程組成。Notch 受體和配體結(jié)合后，在早老素依賴的γ-分泌酶的作用下，釋放受體活性胞內(nèi)段（Notch intracellular domain，NIC），NIC 轉(zhuǎn)入核內(nèi)與轉(zhuǎn)錄因子RBP-J 結(jié)合，形成轉(zhuǎn)錄激活復(fù)合物，進(jìn)而啟動下游Hes和HERP等基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，其中，抑制性轉(zhuǎn)錄因子Hes1 是Notch 通路在核內(nèi)的主要效應(yīng)分子。我們的前期工作證實，Notch 信號通路通過調(diào)控免疫細(xì)胞的發(fā)育分化過程及氣道結(jié)構(gòu)細(xì)胞的功能在哮喘發(fā)病中起到重要作用［1-4］。

多項研究證實，Notch 與TLR4 兩條信號通路之間交互調(diào)節(jié)［5-8］。Notch 和TLR 可協(xié)同上調(diào)巨噬細(xì)胞中Notch配體Jagged1的表達(dá)［9］。Notch和TLR可協(xié)同上調(diào)Notch 下游分子Hes1、Hey 及TLR 下游的細(xì)胞因子腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）和IL-12 的表達(dá)［8］。巨噬細(xì)胞中過表達(dá)NICD1（有活性的Notch1 受體胞內(nèi)段）可抑制TLR4 信號通路下游分子TNF-α 和IL-6的表達(dá)［10］。因此，Notch 和TLR4 兩條信號通路之間的交互作用方式存在多樣性。事實上，染色質(zhì)水平表觀遺傳機制的差異、胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子網(wǎng)絡(luò)水平的差異及炎癥細(xì)胞因子的差異均可造成Notch 和TLR 信號通路交互作用的多樣性。因此，Notch 與TLR4 在氣道柱狀上皮細(xì)胞中的交互調(diào)控作用模式有待進(jìn)一步的研究。

Poltorak 等［11］于1998 年克隆了小鼠TLR4基因。Rehli 等［12］于2000 年克隆了人TLR4基因的啟動子序列并對其轉(zhuǎn)錄起始位點和基本的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件進(jìn)行了初步分析，發(fā)現(xiàn)單核細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子PU.1 和ICSBP可在單核細(xì)胞中正性調(diào)控TLR4基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。Roger等［13］于2005年證實小鼠TLR4基因轉(zhuǎn)錄起始位點上游350 bp 以內(nèi)存在AP-1、Oct-1 及GATA-1 的結(jié)合位點，在巨噬細(xì)胞中AP-1 和Oct-1 可上調(diào)TLR4基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，而GATA-1 可下調(diào)TLR4基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。Ganley-Leal 等［14］證實，人B 細(xì)胞和單核細(xì)胞中TLR4基因的表達(dá)調(diào)控機制存在差異。細(xì)胞特異性的轉(zhuǎn)錄因子網(wǎng)絡(luò)及表觀遺傳機制共同決定了TLR4基因表達(dá)調(diào)控模式的不同。氣道上皮細(xì)胞中TLR4基因的表達(dá)調(diào)控模式如何？目前尚無文獻(xiàn)報道。

本研究旨在觀察外源性表達(dá)NIC 能否直接調(diào)控小鼠氣道柱狀上皮細(xì)胞表達(dá)TLR4，并闡明其具體分子機制。

材料和方法

1 細(xì)胞系

小鼠氣道柱狀上皮LA-4 細(xì)胞和大腸桿菌菌株DH5α由空軍軍醫(yī)大學(xué)生物化學(xué)教研室惠贈。

2 主要試劑

pGL3-Basic 質(zhì)粒和Dual-Luciferase Reporter As?say System 購自Promega；QuickChange Kit 購自Strata?gene；Lipofectamine 2000 Reagent 購自Invitrogen；SYBR Premix EX Taq 試劑盒購自TaKaRa；Notch1、Hes1、TLR4 和β-actin 抗體均購自Santa Cruz（sc-6014、sc-13844、sc-16240和I-19）；Ⅱ抗購自中山生物公司；染色質(zhì)免疫沉淀（chromatin immunoprecipita?tion，ChIP）Assay Kit購自Upstate Biotechnology。

3 主要方法

3.1 pGL3-TLR4 報告基因質(zhì)粒的構(gòu)建 以健康雄性C57/B6小鼠的基因組為模板，克隆小鼠TLR4的啟動子序列，引物的正義鏈序列為5'-AGTGCTAGCAT?GGTGGAGCCTCTTGAGTTTCTC-3'，反義鏈序列為5'-GGCAAGCTTTGTGCTCATGCATATACACACCTG-3'，產(chǎn)物1 582 bp。插入T 載體，測序證實。再轉(zhuǎn)入pGL3-Basic 質(zhì)粒，構(gòu)建pGL3-TLR4。以pGL3-TLR4質(zhì)粒為模板，按QuickChange Kit 說明書構(gòu)建Hes 蛋白結(jié)合位點N-box 的點突變報告基因質(zhì)粒pGL3-TLR4-N-box1（-561 位）、pGL3-TLR4-N-box2（-289位）、pGL3-TLR4-N-box3（+175 位）和pGL3-TLR4-Nbox4（+295位）。

3.2 雙螢光素酶報告基因?qū)嶒?將LA-4 細(xì)胞以每孔2×104個的密度接種于96 孔板，第2 天進(jìn)行瞬時轉(zhuǎn)染，方法按Lipofectamine 2000 Reagent 試劑說明書進(jìn)行。將0.1 μg 報告基因質(zhì)粒、5 ng 內(nèi)參照（phRL）質(zhì)粒和梯度劑量（0、0.02、0.04、0.06、0.08 和0.1μg）的pEF-BOS-NIC 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，pEF-BOS-neo 質(zhì)粒將每孔的轉(zhuǎn)染總量調(diào)整至相同。轉(zhuǎn)染48 h后吸棄每孔培養(yǎng)液，PBS 洗滌1 次，按Dual-Luciferase Reporter Assay System 說明書進(jìn)行雙螢光素酶報告基因?qū)嶒灐?/p>

3.3 RT-qPCR 參照Trizol Reagent 說明書提取總RNA，按照RT-PCR 試劑盒程序以總RNA 為模板，oligo-dT 為引物合成cDNA。按SYBR Premix EX Taq試劑盒說明書建立PCR 反應(yīng)體系，應(yīng)用ABI PRISM 7300 Real-Time PCR 儀擴增小鼠TLR4 及內(nèi)參照βactin。計算目的基因表達(dá)水平并以2-ΔΔCt表示。TLR4 的上游引物序列為5'-AGGAGAAAGCG?GATACCA-3'，下游引物序列為5'-TGTGAGGAC?TACCGAGCC-3'；β-actin 上游引物序列為5'-GCCT?CAAGATCATCAGCAAT-3'，下游引物序列為5'-AG?GTCCACCACTGACACGTT-3'。

3.4 Western blot 實驗 收集轉(zhuǎn)染pEF-BOS-NIC 或pEF-BOS-neo 的LA-4 細(xì)胞，提取蛋白，分光光度計蛋白定量，用SDS-PAGE 分離，轉(zhuǎn)移至NC 膜，蛋白封閉液封閉后孵育Ⅰ抗、Ⅱ抗，增強化學(xué)發(fā)光法顯色。Notch1、Hes1、TLR4 和β-actin 均購自Snta Cuz（sc-6014、sc-13844、sc-16240、I-19）。Ⅱ抗購自中山生物公司。

3.5 ChIP 超聲切割LA-4 細(xì)胞的染色質(zhì)，按ChIP Asay Kt 說明書進(jìn)行實驗。以實驗得到的DNA 沉淀為模板，real-time PCR 擴增含有N-box 位點的小鼠TLR4啟動子序列片段，引物的正義鏈序列為5'-AG?TACGTTCTCCTTTTAAT-3'，反義鏈序列為5'-GGC?TAGAATCGATCTGCCC-3'，產(chǎn)物589 bp。β-actin 引物序列同3.3。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件對結(jié)果進(jìn)行t檢驗和單因素方差分析，評價各處理組間是否存在差異。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1 異位過表達(dá)NIC可以下調(diào)TLR4的表達(dá)

為觀察Notch 信號能否調(diào)控TLR4 的表達(dá)，我們利用pEF-BOS-NIC 轉(zhuǎn)染LA-4 細(xì)胞而上調(diào)Notch 信號后，檢測TLR4 的mRNA 和蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與空對照質(zhì)粒pEF-BOS-neo 組相比，pEF-BOSNIC 可以顯著降低TLR4 的mRNA 和蛋白表達(dá)水平（P＜0.05），見圖1。

Figure 1.Ectopic overexpression of NIC down-regulated TLR4 expression.A：TLR4 mRNA expression in LA-4 cells transfected with pEF-BOS-NIC and pEF-BOS-neo was detected by RT-qPCR；B：TLR4 protein expression in LA-4 cells transfected with pEF-BOS-NIC and pEF-BOS-neo was detected by Western blot.Mean±SD. n=5.*P＜0.05 vs pEF-BOS-NIC group.圖1 異位過表達(dá)NIC可以下調(diào)TLR4的表達(dá)

2 人和小鼠TLR4基因啟動子生物信息學(xué)分析結(jié)果

為明確Notch 信號能否直接調(diào)控TLR4啟動子活性，我們比對分析了小鼠TLR4啟動子（NC_000070.6）和人TLR4啟動子（NC_000009.12）的基因組序列。如圖2 所示，在小鼠和人TLR4啟動子5'端轉(zhuǎn)錄起始位點附近的相似位置，存在多個Hes 結(jié)合位點N-box（CACNAG）。

3 小鼠TLR4啟動子中Hes結(jié)合位點的調(diào)控作用

為了觀察這些假定的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點能否調(diào)控轉(zhuǎn)錄活性，我們克隆了小鼠TLR4啟動子序列，并構(gòu)建了報告基因質(zhì)粒pGL3-TLR4。共轉(zhuǎn)染LA-4 細(xì)胞后顯示，隨著NIC 表達(dá)質(zhì)粒pEF-BOS-NIC 劑量的增加，TLR4啟動子活性逐漸降低（P＜0.05），見圖3A。為進(jìn)一步觀察TLR4啟動子中這些N-box 位點的功能，我們定點突變了這些位點（圖3B）并觀察了點突變對TLR4啟動子活性的影響。如圖3C 所示，-289位N-box 突變導(dǎo)致TLR4啟動子活性顯著增高，而-561、+175 和+295 位N-box 突變對TLR4啟動子活性沒有顯著影響。利用ChIP 的方法在LA-4 細(xì)胞中進(jìn)一步觀察了Hes1是否結(jié)合于小鼠TLR4啟動子序列，即利用包含N-box（-289）位點的TLR4啟動子區(qū)域的引物PCR擴增Hes1抗體共沉淀的染色體DNA 片段，結(jié)果顯示含有Hes1 結(jié)合位點的片段可以被Hes1 抗體共沉淀（圖3D）。

討論

Figure 2.Sequence alignment of human and mouse TLR4 promoters.A：N-boxes in human and mouse TLR4 promoters；B：scheme of the 5′regions of the mouse and human TLR4 promoters，indicating the potential Hes recognition sites.TSS：transcrip?tion start site；TLSS：translation start site.圖2 人和小鼠TLR4啟動子序列比對分析

Figure 3.Effects of the Hes-binding sites on mouse TLR4 promoter.A：result of pGL3-TLR4 reporter assay；B：scheme of the site-di?rected mutant of mouse TLR4 in which the N-boxes were disrupted；C：result of site mutant reporter assay；D：result of chromatin immunoprecipitation（ChIP）.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs pGL3-LR4+phRL group；△P＜0.05 vs phRL+pEFBOS-NIC+pGL3-TLR4 group；##P＜0.01 vs control group.圖3 小鼠TLR4啟動子中Hes結(jié)合位點的調(diào)控作用

在本研究中，顯示異位過表達(dá)NIC 可以降低小鼠LA-4 細(xì)胞中TLR4 的mRNA 和蛋白表達(dá)水平。對人和小鼠TLR4基因5'端啟動子序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析表明，在轉(zhuǎn)錄起始位點上、下游的多個相似位置均存在Notch 下游分子Hes 的結(jié)合位點N-box，這提示這些基序可能在TLR4 的表達(dá)中有調(diào)節(jié)作用。我們進(jìn)一步的雙螢光素酶報告基因?qū)嶒炞C實小鼠LA-4 細(xì)胞中過表達(dá)NIC 可以下調(diào)TLR4啟動子活性。點突變報告基因?qū)嶒灲沂綡es 蛋白可能通過作用于-289 位的N-box 位點而抑制小鼠TLR4啟動子活性。而ChIP 實驗證實Hes1 結(jié)合于TLR4基因啟動子區(qū)域。因此，我們認(rèn)為Notch 信號可以通過Hes1 依賴的機制調(diào)節(jié)TLR4的表達(dá)。

Notch 信號相關(guān)分子條件性敲除小鼠模型的研究表明，Notch 信號在Clara 前體細(xì)胞及氣道上皮細(xì)胞的發(fā)育中有重要作用［15-16］。Notch/RBP-J/Hes1 在成年個體中也是細(xì)胞分化和功能維持的主要調(diào)節(jié)因素之一。Notch 信號調(diào)控了氣道上皮細(xì)胞的黏液化生過程［15］。我們的前期研究也證實，Notch 信號通過Hes1 依賴的機制調(diào)控氣道杯狀細(xì)胞中MUC5AC 的表達(dá)［3］。在本研究中，顯示Notch 信號可以通過Hes1依賴的機制直接調(diào)控氣道柱狀上皮細(xì)胞中TLR4 的表達(dá)。因此，Notch 信號在氣道上皮細(xì)胞的功能維持中有重要作用。

氣道上皮細(xì)胞表達(dá)TLR 和PAR1-PAR4 等多種模式識別受體［9，17-18］。近年來的一系列研究證實，氣道上皮細(xì)胞受變應(yīng)原刺激后可合成、分泌胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素（thymic stromal lymphopoietin，TSLP）［19］、IL-33［20］和IL-25［21］。上述細(xì)胞因子一方面能夠募集、活化樹突狀細(xì)胞（dendritic cells，DCs），加重變應(yīng)原特異性的Th2 免疫應(yīng)答；另一方面，TSLP、IL-33 和IL-25 可不依賴于DCs 和Th2 細(xì)胞因子的存在，直接引起嗜酸性粒細(xì)胞性氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性等哮喘表型［19-21］。此外，氣道上皮細(xì)胞產(chǎn)生的IL-33 和IL-25 可誘導(dǎo)2 型固有淋巴樣細(xì)胞（group 2 innate lymphoid cells，ILC2）的發(fā)育分化過程［22］，進(jìn)而不依賴于CD4+T 細(xì)胞通過2 型固有免疫應(yīng)答的機制直接促成哮喘表型的形成［23］。因此，氣道上皮細(xì)胞在哮喘發(fā)病中有極為重要的作用［21］，而且這也與相關(guān)臨床研究結(jié)果一致［24］。

研究報道，草花粉變應(yīng)原刺激NCI-H292 細(xì)胞后，Notch 信號相關(guān)的74 個基因中，有38 個基因的表達(dá)水平有變化，其中，Notch1 和Hes1 的表達(dá)下調(diào)最顯著，分別下調(diào)了2 倍和3.3 倍［25］。我們的研究表明，Hes1的下調(diào)可以上調(diào)TLR4的表達(dá)。而氣道上皮細(xì)胞表達(dá)TLR4在哮喘發(fā)病中有重要作用。Hammad等［26］證實氣道結(jié)構(gòu)細(xì)胞（主要是氣道上皮細(xì)胞）表達(dá)TLR4 是屋塵螨（house dust mite，HDM）抗原誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生哮喘表型的充分必要條件。Tan等［27］證實，氣道結(jié)構(gòu)細(xì)胞表達(dá)TLR4 是低劑量卵清蛋白（ovalbu?min，OVA）聯(lián)合脂多糖誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生哮喘表型的必要條件。McAlees 等［28］利用氣道上皮細(xì)胞條件性剔出TLR4 的小鼠模型證實，造血細(xì)胞表達(dá)TLR4 可誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞性哮喘表型，而氣道上皮細(xì)胞表達(dá)TLR4在HDM 和OVA 誘導(dǎo)的小鼠嗜酸性氣道炎癥中有重要作用。因此，Notch 信號通過Hes1 調(diào)控氣道上皮細(xì)胞表達(dá)TLR4 這一機制可能在哮喘發(fā)病中有一定的作用。

Notch 信號通過調(diào)控T 細(xì)胞的分化在哮喘發(fā)病中起到重要作用［29］。但是，只有很少的研究報道了Notch 信號可以通過調(diào)控氣道結(jié)構(gòu)細(xì)胞的功能參與哮喘發(fā)病過程。將來需要進(jìn)一步的研究來觀察體內(nèi)條件下氣道上皮中Notch 信號對哮喘表型的調(diào)控作用。總之，我們的研究表明，Notch 信號通路可以在小鼠LA-4 細(xì)胞中通過Hes1 依賴的機制直接調(diào)控TLR4啟動子活性；該通路有望成為哮喘防治中的靶點。