曹相玫，徐 輝，武艷瑋，游南林，于佳翔，馬 杰

（寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系，寧夏銀川 750004）

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是由神經(jīng)干細(xì)胞或祖細(xì)胞引起的神經(jīng)系統(tǒng)常見(jiàn)的原發(fā)腫瘤，呈侵襲性生長(zhǎng)，對(duì)放化療不敏感，治療效果有限［1］。細(xì)胞自噬是一種亞細(xì)胞水平的自我吞噬，自噬基因的異常表達(dá)能夠啟動(dòng)或抑制某些腫瘤的形成［2］。研發(fā)新的自噬誘導(dǎo)劑或抑制劑促使神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)生自噬性死亡，已經(jīng)成為神經(jīng)膠質(zhì)瘤治療的新方向。雷帕霉素（rapamycin，Rapa）是一種抗真菌的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，與細(xì)胞毒性藥物或酪氨酸激酶抑制劑聯(lián)合應(yīng)用能夠抑制腫瘤［3］，其機(jī)制主要是通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞自噬而不是凋亡發(fā)揮作用［4］。本項(xiàng)工作通過(guò)在細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)中觀察Rapa 神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87-MG 細(xì)胞的抑制作用和對(duì)自噬相關(guān)蛋白的影響，進(jìn)一步探討Rapa 促進(jìn)U87-MG 細(xì)胞自噬的作用和可能機(jī)制。

材料和方法

1 細(xì)胞和主要試劑

人膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87-MG 由本實(shí)驗(yàn)室儲(chǔ)存。Rapa 批號(hào)CAS 53123-88-9；0.25%胰蛋白酶消化液（含EDTA）和SDS-PAGE 凝膠制備試劑盒（北京索萊寶科技公司）；DMEM 高糖培養(yǎng)液（HyClone）；Ⅰ抗兔抗［哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）、p-mTOR、LC3-II、beclin-1、70 kD核糖體蛋白S6 激酶（70 kD ribosomal protein S6 ki?nase，p70S6K）、p-S6、p-MAPK 和膠質(zhì)細(xì)胞原纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic pretein，GFAP）］、鼠抗β-actin 抗體和Ⅱ抗（HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG 和山羊抗鼠IgG）均購(gòu)自Cell Signaling Technology；二甲基亞砜（DMSO）和噻唑藍(lán)（MTT）購(gòu)自Sigma。

2 實(shí)驗(yàn)儀器

二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱（ESCO）；低溫冷凍離心機(jī)（Sigma）；超凈工作臺(tái)（Thermo）；連續(xù)光波酶標(biāo)儀和凝膠化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（上海勤翔儀器廠）。

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1 細(xì)胞培養(yǎng)與藥物分組 將U87-MG細(xì)胞以1×105個(gè)接種于25T 透氣培養(yǎng)瓶中，用含10%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)中，隔日換液，3～4 d 傳代。培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，棄去原培養(yǎng)液，更換含Rapa的培養(yǎng)液，正常對(duì)照（normal control，NC）組用等量DSMO 配制，按濃度梯度分組，即NC組（0 μmol/L Rapa）和實(shí)驗(yàn)組（1、2.5、5、10、20和40 μmol/L Rapa［5］），經(jīng)過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)各梯度濃度的設(shè)置，觀察蛋白水平的表達(dá)情況，后續(xù)實(shí)驗(yàn)按此分組進(jìn)行。

3.2 平板集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞集落形成能力平板集落形成實(shí)驗(yàn)用于貼壁細(xì)胞，神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞呈貼壁生長(zhǎng)。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U87-MG 細(xì)胞以每孔2 000 個(gè)接種在6 孔板上，待8 h 貼壁后更換含20 μmol/L Rapa 培養(yǎng)液，于倒置顯微鏡下觀察（40 μmol/L Rapa 干預(yù)使細(xì)胞出現(xiàn)明顯的形態(tài)改變及活力下降，而20 μmol/L Rapa 干預(yù)后細(xì)胞的形態(tài)變化不明顯，因此平板集落形成實(shí)驗(yàn)采用濃度為20 μmol/L），干預(yù)48 h 后更換常規(guī)培養(yǎng)液，14 d 后，棄掉培養(yǎng)液，用4%多聚甲醛常溫固定30 min，0.05%的結(jié)晶紫染色15 min，清水沖洗皿底，晾干拍照。ImageJ 軟件計(jì)數(shù)集落形成數(shù)量。計(jì)算集落形成率（%）=集落數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%。

3.3 軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證細(xì)胞集落形成能力 軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)用于懸浮細(xì)胞，呈貼壁生長(zhǎng)的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中會(huì)有少數(shù)細(xì)胞懸浮在細(xì)胞表面。配制0.05% 的結(jié)晶紫和100 mL 的1.2% 和0.7%瓊脂糖，高壓滅菌后置于55℃水浴中，保持融化狀態(tài)。配制500 mL 的2×培養(yǎng)液（20%FBS+2×DMEM+2×抗生素），37℃預(yù)熱。鋪下膠：按1∶1 比例使1.2%瓊脂糖下膠和2×培養(yǎng)液混合，6 孔盤(pán)每孔迅速加入1.5 mL混合液，輕輕混勻，室溫靜置待下膠凝固（加混合液時(shí)不能產(chǎn)生氣泡），待下層膠凝固過(guò)程中處理細(xì)胞。Rapa組細(xì)胞用20 μmol/L Rapa處理，于倒置顯微鏡下觀察（40 μmol/L Rapa 干預(yù)使細(xì)胞出現(xiàn)明顯的形態(tài)改變及活力下降，而20 μmol/L Rapa干預(yù)后細(xì)胞的形態(tài)變化不明顯，因此軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)采用濃度為20 μmol/L），對(duì)照組細(xì)胞為等量DSMO 處理，干預(yù)48 h后（基本過(guò)程為，用吸管反復(fù)吸取培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液輕微沖洗細(xì)胞表面30 s，即可獲得U87-MG 的懸浮細(xì)胞），進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，該過(guò)程不用胰蛋白酶消化液。離心培養(yǎng)液后調(diào)整細(xì)胞濃度至5×107/L。待下層膠凝固后，鋪上膠：按1∶1比例混合0.7%瓊脂糖和2×培養(yǎng)液，加100 μL 細(xì)胞懸液，即5 000 細(xì)胞，37℃、5%CO2培養(yǎng)2～3周。結(jié)晶紫染色。

3.4 MTT 比色法檢測(cè)細(xì)胞活力 細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整密度為1×1013/L，取10 μL 細(xì)胞懸液種于96 孔板中（96孔板中預(yù)先加入含梯度濃度Rapa 的培養(yǎng)液140 μL），每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，于37℃、5%CO2、100%濕度的孵箱中孵育48 h，每孔分別加入20 μL MTT（5 g/L），繼續(xù)培養(yǎng)4 h，若藥物與MTT 能夠反應(yīng)，可先離心后棄去培養(yǎng)液，小心用PBS 沖2～3 遍后，再加入含MTT的培養(yǎng)液，終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)的培養(yǎng)液，結(jié)束前5 min 每孔加入DMSO 100 μL，緩慢振蕩10 min，結(jié)晶物充分溶解，均勻分布后，用連續(xù)光波酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（A）。

3.5 Western blot 法檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá) 細(xì)胞經(jīng)各濃度Rapa 干預(yù)48 h 后，分別收集1×106個(gè)細(xì)胞離心提取蛋白，用BCA 法進(jìn)行蛋白定量。配制8% SDSPAGE 凝膠，上樣蛋白濃度為4 g/L，80/120 V 恒壓電泳后，300A 恒流濕轉(zhuǎn)PVDF 膜，TBST 洗膜后，10%牛奶封閉1 小時(shí)，再次洗膜，孵育1∶500 兔抗人Ⅰ抗（mTOR、p-mTOR、LC3-II、beclin-1、p70S6K、p-S6、p-MAPK 和β-actin），4℃過(guò)夜。次日，室溫下復(fù)蘇1 h后，用TBST 洗膜3 次，1∶3 000 山羊抗兔或山羊抗鼠IgG Ⅱ抗于室溫下孵育1 h，洗膜后，ECL 發(fā)光液與條帶反應(yīng)1 min后，上機(jī)曝光并記錄蛋白表達(dá)灰度值。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

各實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 23.0 軟件分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用LSD 法。各實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 Rapa 促進(jìn)膠質(zhì)瘤U87-MG 細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)

Western blot 結(jié)果顯示，經(jīng)梯度Rapa 處理后，U87-MG 細(xì)胞中自噬標(biāo)志蛋白LC3-II 水平升高，在20 μmol/L 組達(dá)到峰值，40 μmol/L 組略低于20 μmol/L 組；自噬相關(guān)蛋白beclin-1 在各實(shí)驗(yàn)組（1、2.5、5 和10 μmol/L Rapa）中的表達(dá)量呈梯度升高，于10 μmol/L 達(dá)到峰值，20 μmol/L 和40 μmol/L 呈梯度下調(diào)趨勢(shì)（P＜0.05），見(jiàn)圖1。

Figure 1.The protein levels of beclin-1 and LC3-II in U87-MG cells treated with gradient concentrations of rapamycin（Rapa）were detected by Western blot.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs normal control（NC）group.圖1 Rapa對(duì)U87-MG膠質(zhì)瘤細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2 Rapa對(duì)U87-MG細(xì)胞的抑制作用

軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)顯示，結(jié)晶紫染色后，與NC 組相比，Rapa 干預(yù)組無(wú)顯著集落形成（P＜0.05），見(jiàn)圖2A。

平板集落形成實(shí)驗(yàn)顯示，NC 組細(xì)胞集落呈深藍(lán)色，針尖至針冒大小不等；Rapa處理組形成的新集落染色淺，呈淡藍(lán)色，面積小，且數(shù)量顯著減少（P＜0.05），見(jiàn)圖2B。

MTT 實(shí)驗(yàn)顯示，梯度濃度的Rapa 干預(yù)能夠顯著抑制U87-MG 細(xì)胞活力，并呈現(xiàn)劑量依賴性（P＜0.05），見(jiàn)圖2C。

3 Rapa對(duì)U87-MG 細(xì)胞mTOR 及相關(guān)通路信號(hào)分子的影響

Western blot 結(jié)果表明，U87-MG 細(xì)胞給予Rapa處理后，mTOR 及磷酸化mTOR（p-mTOR）蛋白水平降低，與NC 組相比，5、10、20 和40 μmol/L Rapa 均使mTOR 下調(diào)，且p-mTOR 水平呈劑量依賴性降低，40 μmol/L 組下調(diào)最顯著（P＜0.05）；p70S6K 先輕度增高而后降低，表達(dá)趨勢(shì)呈拋物線軌跡，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；p-S6 表達(dá)趨勢(shì)相反，Rapa 干預(yù)后p-S6 水平顯著降低，在40 μmol/L 上升至NC 組的水平（P＜0.05），見(jiàn)圖3。

Figure 2.The colony-forming and proliferation abilities of U87-MG cells treated with rapamycin（Rapa）.A and B：the U87-MG cells were treated with 20 μmol/L Rapa，and the numbers of new colonies were observed by plate colony formation assay and soft agar colony formation assay，respectively；C：the viability of U87-MG cells treated with gradient concentrations of Rapa for 48 h was determined by MTT assay.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs normal control（NC）group.圖2 Rapa處理膠質(zhì)瘤U87-MG細(xì)胞后集落形成和增殖能力的變化

Figure 3.The protein levels of mTOR，p-mTOR，p70S6K and p-S6 in U87-MG cells treated with gradient concentrations of rapamy?cin（Rapa）were detected by Western blot.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs normal control（NC）group.圖3 Rapa對(duì)U87-MG細(xì)胞mTOR及其信號(hào)分子p70S6K和p-S6表達(dá)的影響

4 Rapa促進(jìn)U87-MG細(xì)胞自噬的相關(guān)機(jī)制

Western blot 結(jié)果表明，梯度濃度的Rapa 處理后p-MAPK 蛋白水平呈梯度增加，具有劑量依賴性，與NC組相比，40 μmol/L Rapa組上調(diào)最顯著（P＜0.05）；GFAP 的表達(dá)水平在Rapa 濃度為1、2.5、5 和10 μmol/L 時(shí)上調(diào)不明顯，在20 和40 μmol/L 時(shí)顯著上調(diào)（P＜0.05），見(jiàn)圖4。

Figure 4.The protein levels of p-MAPK and GFAP in U87-MG cells treated with gradient concentrations of rapamycin（Rapa）were detected by Western blot.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs normal control（NC）group.圖4 Rapa對(duì)U87-MG細(xì)胞p-MAPK和GFAP蛋白水平的影響

討論

神經(jīng)膠質(zhì)瘤約占腦和中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的30%，占惡性腦腫瘤的80%，其侵襲性強(qiáng)，手術(shù)后常輔以放化療治療。通過(guò)放療和化療影響腫瘤細(xì)胞自噬是目前腫瘤輔助治療的新理論［6］。自噬是一種亞細(xì)胞水平的自我吞噬，細(xì)胞通過(guò)自噬可以實(shí)現(xiàn)自身代謝和細(xì)胞器更新，以適應(yīng)環(huán)境、維持穩(wěn)態(tài)。自噬活性的改變、自噬信號(hào)通路的異常調(diào)控與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、密切相關(guān)，自噬基因的異常表達(dá)能夠啟動(dòng)或抑制某些腫瘤的形成［2］。

Rapa 是mTOR 的抑制劑，其衍生物與其他藥物聯(lián)合作用，有效的抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)與增殖。mTOR 是自噬誘導(dǎo)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，Rapa 可以與mTOR 發(fā)生靶向組合，阻滯信號(hào)向下傳遞。在酵母細(xì)胞中，mTOR 是自噬途徑中的必須激酶，通過(guò)調(diào)節(jié)自噬相關(guān)基因1（autophagy-related gene 1，Atg1）在自噬中起重要作用［7］。除了mTOR 途徑，腺苷酸活化蛋白酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）途徑和磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）途徑也是自噬過(guò)程的重要信號(hào)通路。當(dāng)細(xì)胞自噬刺激信號(hào)加強(qiáng)時(shí)，AMPK 途徑活化，間接抑制mTOR，誘導(dǎo)自噬的發(fā)生；I 型PI3K 在自噬進(jìn)程中起相反作用。本研究進(jìn)行細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)中，給予Rapa處理后mTOR 和p-mTOR 的蛋白水平均呈劑量依賴性降低。

為了進(jìn)一步明確Rapa 干預(yù)下神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的自噬情況，檢測(cè)了自噬標(biāo)志蛋白和beclin-1的表達(dá)水平。beclin-1 是一個(gè)能抑制腫瘤發(fā)生的哺乳動(dòng)物自噬蛋白［8］，LC3被認(rèn)為是自噬性細(xì)胞死亡的特異性標(biāo)志物［9］。內(nèi)源性beclin-1 蛋白在人乳腺上皮癌細(xì)胞系和組織中表達(dá)較低，但在正常乳腺上皮細(xì)胞中廣泛高表達(dá)，因此自噬蛋白表達(dá)的減少可能導(dǎo)致乳腺和其他人類惡性腫瘤的發(fā)展或進(jìn)展［10］。在哺乳動(dòng)物中，LC3 是Atg 8 的同源物［8］，大鼠LC3 的C 端被半胱氨酸蛋白酶Atg4 裂解，產(chǎn)生LC3-I，它位于胞質(zhì)部分；Atg7 和Atg3 可以將LC3-I 轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)C3-II，LC3-II在C 端被磷脂酰乙醇胺修飾，并與自噬體膜緊密結(jié)合。另有研究顯示，高級(jí)別神經(jīng)膠質(zhì)瘤中自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)水平比低級(jí)別者高，LC3-II/Beclin 高表達(dá)與神經(jīng)膠質(zhì)瘤的低生存率相關(guān)，支持了自噬在神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)生過(guò)程中的重要作用［11］。因此，腫瘤自噬呈現(xiàn)“雙刃劍”的功能，過(guò)度上調(diào)的自噬作用也可以引起細(xì)胞死亡，即“自噬性細(xì)胞死亡”，也稱為II 型程序性細(xì)胞死亡，從而起到抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用［12］。本研究顯示，梯度濃度的Rapa 處理后，U87-MG 細(xì)胞中自噬標(biāo)志蛋白LC3-II 呈持續(xù)增高的趨勢(shì)，在20 μmol/L 組和40 μmol/L 組，其表達(dá)量顯著增加，提示Rapa 作用下U87-MG 細(xì)胞出現(xiàn)了“自噬性細(xì)胞死亡”，從而細(xì)胞增殖被抑制。beclin-1 蛋白的表達(dá)量呈現(xiàn)了拋物線樣的趨勢(shì)，即表達(dá)先梯度升高，在10 μmol/L 組達(dá)到峰值，在20 μmol/L 和40 μmol/L 組呈梯度下調(diào)趨勢(shì)，推測(cè)這是U87-MG細(xì)胞對(duì)過(guò)度自噬發(fā)生的保護(hù)性反應(yīng)。總之，Rapa 能夠促進(jìn)U87-MG 細(xì)胞自噬。

Rapa 通過(guò)促進(jìn)U87-MG 細(xì)胞自噬從而產(chǎn)生的增殖抑制作用，MTT 實(shí)驗(yàn)顯示Rapa 能夠抑制U87-MG細(xì)胞活力，平板集落形成實(shí)驗(yàn)顯示Rapa 能夠抑制膠質(zhì)瘤U87-MG細(xì)胞的集落形成能力。進(jìn)一步，將狀態(tài)好的U87-MG 細(xì)胞的表層懸浮細(xì)胞收集起來(lái)進(jìn)行軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)，此前已證實(shí)了這些懸浮細(xì)胞具有干細(xì)胞特性［13］，Rapa 處理后這些懸浮細(xì)胞集落形成能力幾乎喪失。這些結(jié)果說(shuō)明Rapa 通過(guò)抑制mTOR，促進(jìn)細(xì)胞自噬，從而抑制U87-MG 細(xì)胞增殖。類似的報(bào)道可見(jiàn)，白藜蘆醇處理能夠促進(jìn)U87-MG細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白LC3-II 和beclin-1 的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞自噬從而抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖［13］。由此可見(jiàn)，自噬與神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，誘導(dǎo)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞自噬從而起到抑制腫瘤生長(zhǎng)的手段是重要的。

MAPK/ERK1/2 是mTOR 的上游調(diào)節(jié)因子，既往研究中已經(jīng)證明MAPK/ERK1/2 信號(hào)通路的激活是自噬性細(xì)胞死亡誘導(dǎo)的經(jīng)典機(jī)制［14］，p70S6K 和p-S6是自噬相關(guān)的mTOR 通路關(guān)鍵信號(hào)分子。S6K 受mTOR 和PI3K 的控制，從絲裂原刺激的小鼠3T3 細(xì)胞中分離出的磷酸化S6 被稱為p70S6K［15］。S6K 的物種為果蠅。Rapa 及其胞內(nèi)受體形成復(fù)合物RAFT1/FRAP/mTOR，RAFT1 可以直接磷酸化p70S6K，從而促進(jìn)S6 激酶活性［16］。檢測(cè)p70S6K 和p-S6 的表達(dá)情況顯示，梯度濃度的Rapa 干預(yù)后，p70S6K 先輕度增高而后降低，表達(dá)趨勢(shì)呈拋物線軌跡，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；p-S6 表達(dá)趨勢(shì)相反，Rapa干預(yù)后p-S6 表達(dá)明顯降低，在40 μmol/L 驟然上升至NC組的水平。因此，這些結(jié)果并未明顯提示Rapa促進(jìn)U87-MG 細(xì)胞自噬的過(guò)程是通過(guò)復(fù)合物RAFT1/FRAP/mTOR發(fā)揮作用的。

為了進(jìn)一步觀察Rapa 抑制U87-MG 細(xì)胞的作用，我們檢測(cè)了GFAP 的表達(dá)。GFAP 是神經(jīng)膠質(zhì)瘤診斷中的重要腫瘤標(biāo)志物，是神經(jīng)膠質(zhì)瘤的標(biāo)志蛋白［17］。在神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞分化的過(guò)程中，GFAP 表達(dá)增加，mTOR 信號(hào)通路活化，所以，mTOR 增高同時(shí)GFAP 增加，這是合理的解釋。然而在本研究中觀察到，在Rapa 促進(jìn)U87-MG 細(xì)胞自噬的過(guò)程中，mTOR降低，GFAP 增加。因此我們推測(cè)，Rapa 抑制mTOR，促進(jìn)自噬；同時(shí)促進(jìn)U87-MG 細(xì)胞分化，GFAP 表達(dá)升高，后者不是通過(guò)抑制mTOR 信號(hào)通路影響的。為了解釋這些現(xiàn)象，我們查閱文獻(xiàn)：GFAP 的增加可以促使巨噬細(xì)胞發(fā)生自噬，這種自噬反應(yīng)受p38 MAPK 的調(diào)控［18］。MAPK 是一種連接細(xì)胞表面受體和細(xì)胞內(nèi)關(guān)鍵調(diào)控靶點(diǎn)的進(jìn)化保守酶，ERK 是MAPK 的一個(gè)主要級(jí)聯(lián)［19］。MAPK（ERK）/mTOR 通路在神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)生中發(fā)揮著重要作用，MAPK/ERK1/2 是mTOR 的上游調(diào)節(jié)分子［20］。MAPK/ERK1/2 信號(hào)通路的激活是自噬性細(xì)胞死亡誘導(dǎo)的經(jīng)典機(jī)制［14］。相關(guān)研究顯示，anisomycin 是MAPK 的激活劑，大鼠脊髓損傷后，用anisomycin 上調(diào)MAPK，且GFAP 的表達(dá)顯著升高［21］，說(shuō)明MAPK 活化，GFAP 升高。我們因此檢測(cè)了p-MAPK 的水平，梯度濃度Ra?pa處理后，p-MAPK蛋白水平呈劑量依賴性增加。這表明自噬激活MAPK/ERK1/2 信號(hào)通路，促進(jìn)MAPK活化，相應(yīng)的促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤GFAP表達(dá)增加。

綜上所述，本研究證實(shí)了Rapa 能使MAPK/ERK1/2 通路磷酸化激活，導(dǎo)致神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87-MG細(xì)胞自噬增加，從而抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87-MG細(xì)胞增殖。這從體外的角度表明Rapa 具有一定的抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87-MG細(xì)胞生長(zhǎng)的潛能。