黃奕芝，楊紫青，溫煒杰，唐 勤，方樂堃，李孟鴻

（中山大學附屬第六醫(yī)院胃腸病學研究所，廣東廣州 510655）

肝癌是全球常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，中國是占全球肝癌發(fā)病率和死亡率最高的國家，分別為46.6%和47.1%，發(fā)病率和死亡率占我國惡性腫瘤前5 位［1］。我國肝癌5 年生存率僅為12.1%［2］。RNA 甲基化修飾是目前的研究熱點，大量研究證明RNA m6A 甲基化與肝癌發(fā)生發(fā)展密切相關，而關于RNA m5C 甲基化與肝癌的關系研究較少［3］。NOP2/Sun RNA 甲基轉(zhuǎn)移酶家族成員2（NOP2/Sun RNA methyltransferase 2，NSUN2）編碼的蛋白是一種m5C RNA甲基轉(zhuǎn)移酶，與食管癌、頭頸癌、乳腺癌、胃癌和膀胱癌等腫瘤［4］的發(fā)生發(fā)展密切相關，而其在肝癌中功能及作用機制研究鮮少報道。本研究通過分析TCGA 數(shù)據(jù)庫結果并結合在肝癌細胞系中進行的實驗，探討NSUN2 在肝癌增殖中的作用，并探索其機制。明確NSUN2 在肝癌中的功能及作用機制將豐富肝癌發(fā)生發(fā)展的機制，為肝癌治療提供新的治療靶點。

材料和方法

1 臨床樣品

肝癌患者腫瘤樣本來源于中山大學附屬腫瘤醫(yī)院。所有樣本采集均獲得患者的知情同意并獲得研究中心機構審查委員會的同意。

2 細胞

人來源的肝癌細胞系Huh7 和SNU182 來源于ATCC。Huh7 細胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，SNU182 細胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基中，放置于37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中。

3 主要試劑

DMEM 培養(yǎng)基、RPMI-1640 培養(yǎng)基和胰酶（Corn?ing）；胎牛血清（GIBCO）；Trizol（Ambion）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TOYOBO）；2×SYBR Green 和蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑混合物（Bimake）；細胞裂解液（碧云天生物技術有限公司）；BCA 蛋白定量試劑盒（貝博）；5×SDS 上樣緩沖液（鼎國昌盛）；抗NSUN2 抗體（Pro?teintech）；抗PRPS2 抗體（Santa Cruz）；抗actin 抗體（Sigma）；抗β-vinculin 抗體（Cell Signaling Technolo?gy）。

4 主要方法

4.1 TCGA 數(shù)據(jù)分析 從TCGA 中收集到374 例肝癌患者肝癌組織及50 例癌旁肝組織的基因表達測序數(shù)據(jù)集，該數(shù)據(jù)集使用轉(zhuǎn)錄組測序技術（Illumina HiSeq）進行RNA 水平測定。從數(shù)據(jù)集中提取374 例肝癌患者肝癌組織及50 例癌旁組織NSUN2基因的相對表達量FPKM（fragments per kilobase per million）值，用t檢驗方法比較正常組織與肝癌組織的NSUN2表達水平。

4.2 穩(wěn)定敲低NSUN2肝癌細胞系的構建及細胞增殖實驗 使用HEK293T 細胞包裝shNSUN2 的慢病毒及對照組shRNA scramble 慢病毒，并用其感染Huh7 和SNU182 肝癌細胞，感染48 h 后傳代，并用嘌呤霉素篩選細胞，產(chǎn)生穩(wěn)定敲低NSUN2的肝癌細胞系。用Western blot 實驗檢測敲低效率后，將對照組細胞和穩(wěn)定敲低NSUN2組細胞計數(shù)并鋪板，放置在IncuCyte 系統(tǒng)中實時檢測細胞生長，96 h 后用Graph?Pad Prism 軟件統(tǒng)計并作圖。集落形成實驗中，計數(shù)后的細胞以每孔1 000 個鋪在6 孔板中，集落形成后用結晶紫染色并統(tǒng)計集落形成數(shù)。

4.3 RT-qPCR 實驗 用Trizol 法提取細胞總RNA，測量RNA 濃度并調(diào)齊濃度后再逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA 用于進行實時熒光定量實驗，每個樣品設置3個復孔，實驗結果用β-actin作為內(nèi)參照，采用2-ΔΔCT進行結果分析。引物序列見表1。

4.4 Western blot 實驗 吸去細胞培養(yǎng)基并用PBS洗一次細胞后，加入含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑混合物的細胞裂解液，并用超聲破碎儀裂解細胞，并將細胞置于冰上裂解30 min 后離心10 min，取上清進行蛋白定量，調(diào)齊蛋白量后加入上樣緩沖液，煮沸5 min 使蛋白變性。用SDS-PAGE 分離蛋白，并將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，用含5%脫脂牛奶的封閉液封閉1 h 后用Ⅰ抗4℃孵育過夜，回收Ⅰ抗，TBST 洗3次后用Ⅱ抗常溫孵育1 h，TBST 洗3 次后進行ECL顯色。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1.Sequences of the primers for RT-qPCR

5 統(tǒng)計學處理

采用IBM SPSS Statistics 25.0 進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（mean±SD）表示。采用Graph?Pad Prism 軟件作圖。兩獨立樣本均值比較采用t檢驗；細胞增殖曲線間的比較采用雙因素方差分析；NSUN2 與PRPS2 間的相關性采用Pearson 相關性分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

1 NSUN2在肝癌組織中高表達

為了研究NSUN2 在肝癌中的表達情況，我們首先比較了腫瘤基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)庫肝癌mRNA 測序數(shù)據(jù)集中NSUN2 的表達，發(fā)現(xiàn)NSUN2 在374 例肝癌患者肝癌組織中的mRNA 表達水平顯著高于50例正常肝組織（P＜0.05），見圖1A，除此之外，Western blot 實驗結果顯示，在9 例肝癌患者肝癌及癌旁組織樣品中，有6 例肝癌患者肝癌組織的NSUN2 蛋白表達水平高于癌旁組織，見圖1B。從GEPIA（Gene Expression Profiling Interactive Analy?sis）官網(wǎng)獲得TCGA 肝癌數(shù)據(jù)集生存分析結果，NSUN2 高表達具有較差的生存預后，差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.023），見圖1C。

Figure 1.NSUN2 was over-expressed in liver cancer.A：NSUN2 mRNA was over-expressed in liver cancer tumor tissues as com?pared with normal tissues from TCGA database；B：NSUN2 was over-expressed in liver cancer tumor tissues compared to adjacent normal tissues at protein level from a liver cancer patient cohort；C：Kaplan-Meier analysis indicated that high mRNA expression of NSUN2 was correlated with poor overall survival in liver cancer patients from TCGA database.The P value was determined by log-rank test.Mean±SD.*P＜0.05 vs normal group.圖1 NSUN2在肝癌中高表達

2 敲低NSUN2抑制肝癌細胞生長

使用Incucyte 活細胞動態(tài)成像與分析系統(tǒng)記錄Huh7細胞和SNU182細胞穩(wěn)定敲低NSUN2肝癌細胞系的生長，結果顯示敲低NSUN2顯著抑制Huh7細胞和SNU182 細胞的生長（P＜0.05），見圖2B。集落形成實驗結果顯示，在Huh7 細胞和SNU182 細胞中敲低NSUN2后，細胞的集落形成能力與對照組相比受到顯著抑制（P＜0.05），見圖2C。

Figure 2.Knock-down of NSUN2 inhibited proliferation in Huh7 cells and SNU182 cells.A：after infection of Huh7 cells and SNU182 cells with shRNA scramble，shNSUN2 #5，shNSUN2 #1，Western blot was used to detect knock-down efficiency of NSUN2；B：the proliferation of Huh7 cells and SNU182 cells were determined by Incucyte System（n=16）；C：colony formation assay in Huh7 cells and SNU182 cells（n=3）.Mean±SD.*P＜0.05 vs shRNA scramble group.圖2 敲低NSUN2抑制Huh7和SNU182細胞的增殖

3 GESA分析結果

為了研究NSUN2 通過影響何種信號通路影響肝癌發(fā)生發(fā)展，我們對TCGA 肝癌數(shù)據(jù)集進行基因富集分析（GSEA）。在NSUN2 高表達組富集的信號通路中，嘌呤代謝和嘧啶代謝的NES（歸一化后的富集分數(shù)）排名位于前6，可見NSUN2 可能通過影響嘌呤和嘧啶代謝通路影響肝癌發(fā)生發(fā)展。見圖3。

Figure 3.NSUN2 may coordinate nucleotide metabolism.A：top 10 KEGG pathways enriched in the tissues with high expression of NSUN2；B：GSEA of KEGG pathway showed that the genes up regulated in the tissues with high expression of NSUN2 were enriched in the purine and pyrimidine metabolism pathways.圖3 NSUN2可能調(diào)節(jié)核苷酸代謝

4 NSUN2通過PRPS2調(diào)節(jié)嘌呤代謝

由于NSUN2已被證實可通過m5C甲基化mRNA的方式穩(wěn)定mRNA，因此NSUN2 可能通過甲基化嘌呤和嘧啶代謝中某些基因的mRNA，從而參與嘌呤和嘧啶代謝的過程。為了找出NSUN2可能甲基化并且參與核苷酸代謝的基因，我們通過交叉Sun［5］研究中的重亞硫酸鹽測序（Bisulfite-Seq）結果和基因富集分析中嘌呤和嘧啶代謝通路的差異表達基因，篩選出PRPS2、ADSL、POLR2D、CANT1、ENTPD4、TXNRD1和CAD這7 個候選基因。TCGA 數(shù)據(jù)集中NSUN2 與PRPS2 的mRNA 表達呈正相關（r=0.3283，P＜0.05）。在SNU182細胞中敲低NSUN2后，RT-qPCR結果顯示PRPS2 的mRNA 表達量顯著下降，Western blot 結果顯示PRPS2 的蛋白表達量下降。同時，RT-qPCR 結果顯示shNSUN2 組與對照組相比，嘌呤從頭合成的其它關鍵酶的mRNA表達量也下降了。見圖4。

Figure 4.NSUN2 regulated PRPS2 to get involved in de novo purine synthesis process.A：overlay of RNA bisulfite sequencing（RNA-BisSeq）data and GSEA data（RNA-BisSeq data：m5C modified mRNA in WT HEK293 cells but not in NSUN2-/-HEK293 cells；GSEA data：differentially expressed genes in purine and pyrimidine metabolism pathways）；B：scatter plot showed the correlation of NSUN2 and PRPS2 mRNA expression in 424 tissue samples from TCGA database（the blue line means the regression line；Spearman correlation coefficient was 0.328 3）；C：relative mRNA levels of NSUN2，PRPS2（normalized to actin）determined by RT-qPCR；D：the protein levels of NSUN2 and PRPS2（normalized to vinculin）deter?mined by Western blot；E：relative mRNA levels of de novo purine synthesis related genes（normalized to actin）deter?mined by RT-qPCR；F：schematic diagram of de novo purine synthesis process.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs shRNA scramble group圖4 NSUN2通過調(diào)控PRPS2參與嘌呤從頭合成過程

討論

NSUN2 編碼的蛋白是一種RNA 甲基轉(zhuǎn)移酶。Xu 等［6］發(fā)現(xiàn)，NSUN2 通過甲基化ATX 的mRNA 促進膠質(zhì)瘤細胞轉(zhuǎn)移。NSUN2 與RPL6 蛋白相結合促進膽囊癌的腫瘤進展［7］。NSUN2 通過穩(wěn)定mRNA 促進膀胱癌的發(fā)?。?］。Sun 等［9］研究表明NSUN2 介導的H19 lncRNA 的m5C 修飾異常與肝細胞癌的不良分化有關。綜上，NSUN2參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展，在肝癌細胞中也可能扮演重要角色。而本研究根據(jù)TCGA 數(shù)據(jù)分析、臨床肝癌患者組織的Western blot實驗均表明了NSUN2 在肝癌中高表達，并且生存分析結果證明NSUN2 與肝癌不良預后相關，同時，肝癌細胞實驗結果顯示敲低NSUN2抑制肝癌細胞的增殖，這些結果均提示NSUN2 在肝癌發(fā)生發(fā)展中的重要作用。

最早的研究認為NSUN2 是tRNA 甲基轉(zhuǎn)移酶，近年來的研究證實NSUN2還能甲基化rRNA、一些小分子RNA 和長鏈非編碼RNA［4］。而越來越多的研究認為NSUN2 是能在mRNA 上進行m5C 甲基化的非常重要的甲基轉(zhuǎn)移酶，Huang 等［10］開發(fā)了新穎的生物信息學計算方法，提供了NSUN2 對mRNA 的m5C修飾令人信服的證據(jù)。并且，NSUN2 在mRNA 上的甲基化能調(diào)控基因的表達，在癌癥發(fā)生發(fā)展中具有關鍵作用。Chen 等［8］采用目前最準確可靠的重亞硫酸鹽測序（Bisulfite-Seq）技術繪制了膀胱癌組織mRNA 上的m5C 單位點圖譜，發(fā)現(xiàn)了癌癥通路相關基因的mRNA 趨向于高甲基化修飾，同時在膀胱癌中高表達。并且，該團隊結合Bisulfite-Seq 和RNASeq，證明了NSUN2 以m5C 依賴的方式促進HDGF mRNA 的穩(wěn)定性并促進膀胱癌的增殖和轉(zhuǎn)移。本研究通過對肝癌TCGA 數(shù)據(jù)集的基因富集分析，在高表達NSUN2 的肝癌組織中富集出嘌呤和嘧啶代謝通路，因此我們推測在肝癌中，NSUN2可能通過甲基化嘌呤和嘧啶代謝通路中某些基因的mRNA，促進mRNA 穩(wěn)定性從而增強蛋白表達，促進核苷酸代謝，進而促進肝癌發(fā)生發(fā)展。為了找出NSUN2 甲基化嘌呤和嘧啶代謝中的哪些基因，本研究將GSEA結果中嘌呤和嘧啶代謝通路在高表達NSUN2 組織中富集的基因與Sun 等［5］等的研究中的重亞硫酸鹽測序結果進行了交叉，得出了PRPS2、ADSL、POLR2D、CANT1、ENTPD4、TXNRD1和CAD這7 個候選基因，其中PRPS2、ADSL、POLR2D、CANT1和ENTPD4參與嘌呤代謝信號通路，POLR2D、CANT1、ENTPD4、TXNRD1和CAD參與嘧啶代謝信號通路。

這7 個候選基因中，磷酸核糖焦磷酸合成酶2（phosphoribosyl pyrophosphate synthetase 2，PRPS2）是核苷酸生物代謝途徑中的一種關鍵限速酶［11］，它催化核苷酸合成的第一個限速反應，通過將ATP 上的β，γ-二磷酸基團轉(zhuǎn)移到（磷酸戊糖途徑中產(chǎn)生的核糖-5’-磷酸（R5P）的C1-羥基上，把R5P 活化生成磷酸核糖焦磷酸（PRPP），PRPP 再用于合成嘌呤和嘧啶核苷酸［12］。已有文獻報道PRPS2 在促進乳腺癌干性與轉(zhuǎn)移［13］，前列腺癌細胞周期［14］，結直腸癌轉(zhuǎn)移［15］等腫瘤進展過程具有重要作用。本研究在SNU182 細胞中敲低NSUN2 后，發(fā)現(xiàn)PRPS2 基因的mRNA 和蛋白表達均降低，說明NSUN2 可能通過甲基化PRPS2 的mRNA，穩(wěn)定mRNA，從而穩(wěn)定PRPS2的表達，參與到核苷酸代謝通路中。Lv 等［13］發(fā)現(xiàn)敲低PRPS2后，會導致其它嘌呤和嘧啶從頭合成途徑中的其他關鍵酶的表達下降，該研究提出PRPS2 可能與這些酶協(xié)同調(diào)節(jié)整個從頭合成的過程。為了進一步確認NSUN2 調(diào)控PRPS2 進而調(diào)控核苷酸代謝通路，我們同時檢測了敲低NSUN2 后，SNU182 細胞中其它幾個與嘌呤從頭合成關鍵酶［16］的表達，發(fā)現(xiàn)ADSL、PFAS、PAICS、IMPDH1/2 和GMPS 的表達均降低，其中腺苷琥珀酸裂合酶（adenylosuccinate lyase，ADSL）也是我們篩選出的7個候選基因中的一個，它催化嘌呤從頭合成途徑中SAICAR 到AICAR 及SAMP到AMP兩個步驟。

綜上所述，NSUN2通過甲基化PRPS2和ADSL等基因的mRNA，穩(wěn)定其表達，參與調(diào)控核苷酸代謝通路，促進肝癌增殖的發(fā)生發(fā)展。然而，本研究中NSUN2對PRPS2 mRNA 的甲基化，是通過Sun等［5］等在HEK293 中進行重亞硫酸鹽測序的結果猜測的，要確認肝癌細胞中NSUN2 甲基化PRPS2，還需要對肝癌細胞進行重亞硫酸鹽測序或進行m5C IP 實驗，給出更直接可靠的證據(jù)。除此以外，NSUN2 調(diào)控核苷酸代謝通路還可以采用同位素示蹤實驗更進一步確認。NSUN2對肝癌發(fā)生發(fā)展的調(diào)節(jié)還有待深入研究，完善其機制將對臨床上肝癌治療有重要意義。