程 梅，董曉筠，朱 彬

（杭州市婦產(chǎn)科醫(yī)院麻醉科，浙江杭州 310000）

膿毒癥可引起腎、肺、心和肝等多種組織器官損傷及嚴(yán)重并發(fā)癥，死亡率較高［1-3］。膿毒癥早期即可出現(xiàn)心肌損傷，發(fā)生率高達(dá)50%，而心源性膿毒癥休克患者病死率可高達(dá)70%［4］，目前膿毒癥心肌損傷主要有抗感染、體液復(fù)蘇及使用兒茶酚胺強(qiáng)心類藥物治療等方法，但這些對心源性休克患者長期預(yù)后效果不佳，尚需尋找新的治療方案［5-6］。利多卡因是一種臨床常用的局部麻醉藥及抗心律失常藥，近來研究顯示，利多卡因還具有抗炎效果，成為了膿毒癥治療研究中的一大熱點(diǎn)［7］，但其作用機(jī)制尚不完全明確。核因子E2 相關(guān)因子2/血紅素加氧酶1（nuclear factor E2-related factor 2/heme oxygenase-1，Nrf2/HO-1）是重要的內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激通路，與膿毒癥急性肺損傷、心肌損傷等發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［8-10］，但關(guān)于利多卡因?qū)δ摱景Y大鼠心肌損傷及Nrf2/HO-1 通路的影響尚鮮有研究。本項(xiàng)工作擬探究利多卡因?qū)δ摱景Y大鼠心肌損傷及Nrf2/HO-1 通路的影響，以期揭示其作用機(jī)制，為膿毒癥心肌損傷的治療提供參考資料。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

7～8 周齡健康雄性SPF 級SD 大鼠45 只，體質(zhì)量250～300 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號為SCXK（京）2017-0005。本研究經(jīng)過本院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過，符合中國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物制度倫理審查委員會(huì)關(guān)于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的指導(dǎo)方針。

2 藥品、主要試劑和儀器

碳酸利多卡因注射液（規(guī)格：5 mL∶86.5 mg）購自濟(jì)川藥業(yè)集團(tuán)有限公司。丙二醛（malonaldehyde，MDA）檢測試劑盒購自北京索萊寶萊科技有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性檢測試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司；大鼠腫瘤壞死因子α（tumor necrosis fac?tor-α，TNF-α）ELISA 試劑盒、肌紅蛋白（myoglobin，Myo）ELISA 試劑盒、心肌肌鈣蛋白Ⅰ（cardiac tropo?nin Ⅰ，cTnI）ELISA 試劑盒、高遷移率族蛋白B1（high mobility group box 1，HMGB1）ELISA 試劑盒，Nrf2、HO-1、β-actinⅠ抗和Ⅱ抗羊抗兔IgG均購自Ab?cam。IX75 奧林巴斯光學(xué)顯微鏡購自O(shè)LYMPUS；MODEL 550型酶標(biāo)儀購自Bio-Rad。

3 方法

3.1 膿毒癥大鼠模型制備及分組 45只SD 大鼠隨機(jī)分為3組：假手術(shù)（sham）組、模型（model）組和利多卡因（lidocaine）組，每組15 只。模型組和利多卡因組參考文獻(xiàn)［11］采用盲腸結(jié)扎穿孔法制備膿毒癥大鼠模型。腹腔注射2%戊巴比妥鈉（60 mg/kg）進(jìn)行麻醉，切口處常規(guī)消毒后，于下腹正中做約2 cm 縱切口，打開腹膜，遷出盲腸，結(jié)扎回盲瓣至盲腸游離端外2/3，并用針頭穿透至少量腸內(nèi)容物擠出，將盲腸還納腹腔，關(guān)腹，并逐層縫合。術(shù)中監(jiān)測大鼠呼吸、心電圖及血氧飽和度。以大鼠出現(xiàn)豎毛、少尿、腹瀉腹脹、肛溫降低等癥狀并結(jié)合組織病理變化提示膿毒癥大鼠模型制備成功。假手術(shù)組大鼠只打開腹腔后縫合，不進(jìn)行盲腸結(jié)扎穿孔。造模后利多卡因組大鼠立即給予利多卡因10 mg/kg 負(fù)荷劑量注射，然后以10 mg·kg-1·h-1的劑量尾靜脈輸注3 h，假手術(shù)組和模型組用等量生理鹽水代替。24 h 后進(jìn)行血清及組織標(biāo)本采集，檢測相關(guān)指標(biāo)變化。

3.2 ELISA 檢測血清TNF-α、HMGB1、Myo 和cTnI水平 造模24 h 后采集大鼠尾靜脈血，常規(guī)離心后分離血清，采用ELISA檢測血清TNF-α、HMGB1、Myo及cTnI水平，具體操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

3.3 TTC 染色法檢測心肌組織梗死區(qū)面積 每組隨機(jī)選5 只大鼠尾靜脈注射1%伊文思藍(lán)染料2 mL，待全身藍(lán)染后，處死大鼠，取心臟組織快速置于液氮中，從心尖沿心臟短軸均勻切成1.5 mm 厚度的切片，置于1% TTC 溶液中37℃孵育10 min，10%甲醛中固定，拍照，采用ImageJ 軟件測量梗死區(qū)、危險(xiǎn)區(qū)面積，心肌梗死率（%）=梗死區(qū)面積/危險(xiǎn)區(qū)面積×100%。

3.4 HE 染色檢測心肌組織病理損傷變化 處死各組剩余10 只大鼠，取部分心肌組織置于4%多聚甲醛中固定，另取部分心肌組織置于液氮中保存?zhèn)溆?。取固?4 h 后的心肌組織進(jìn)行石蠟包埋、切片（5 μm），進(jìn)行HE 染色，經(jīng)顯微鏡觀察心肌組織損傷病理變化。

3.5 生物化學(xué)法檢測心肌組織MDA和SOD水平取部分心肌組織制備勻漿液（體積比1∶10），采用生物化學(xué)法檢測MDA 和SOD 水平，具體步驟嚴(yán)格參照試劑盒說明書進(jìn)行。

3.6 RT-qPCR 法檢測心肌組織Nrf2 和HO-1 mRNA的表達(dá)水平 采用RNA 提取試劑盒提取各組心肌組織中RNA，紫外分光光度計(jì)檢測其濃度及純度。反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，置于-20℃保存?zhèn)溆?。RT-qPCR擴(kuò)增Nrf2 和HO-1 mRNA。20 μL 反應(yīng)體系：2×TB Green Premix Ex Taq Ⅱ（TliRNaseH Plus）10.0 μL，ROX Dye Ⅱ（50×）0.4 μL，cDNA（50 mg/L）2.0 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.8 μL，ddH2O 6.0 μL。反應(yīng)條件：95℃30 s；95℃5 s，60℃34 s，40 個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法定量分析心肌組織中Nrf2 和HO-1 mRNA的相對表達(dá)水平。

3.7 Western blot法檢測心肌組織Nrf2和HO-1蛋白的表達(dá)量 提取各組大鼠心肌組織總蛋白，BCA 法測定蛋白濃度，置于-80℃保存?zhèn)溆?。?0 μg 蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE，PVDF 膜轉(zhuǎn)膜，室溫封閉，添加Nrf2（1∶1 000）、HO-1抗體（1∶2 000）、β-actin抗體（1∶5 000），4℃孵育過夜，TBST 緩沖液洗膜，添加Ⅱ抗羊抗兔IgG（1∶5 000）室溫孵育2 h，顯色，曝光膠片，觀察結(jié)果并分析蛋白灰度值。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 25.0 軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 各組大鼠血清TNF-α和HMGB1水平比較

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清TNF-α 和HMGB1 水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，利多卡因組大鼠血清TNF-α 和HMGB1 水平顯著降低（P＜0.01），見圖1。

2 各組大鼠心肌梗死率的比較

假手術(shù)組、模型組和利多卡因組大鼠心肌梗死率分別為0、（48.52±4.67）%和（41.23±4.15）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組比較，利多卡因組大鼠心肌梗死率顯著降低（P＜0.01），見圖2。

3 各組大鼠血清Myo和cTnI水平比較

Figure 1.Comparsion of serum TNF-α（A）and HMGB1（B）levels of rats in each group.Mean±SD. n=15.**P＜0.01 vs sham group；##P＜0.01 vs model group.圖1 各組大鼠血清TNF-α和HMGB1水平比較

Figure 2.TCC staining of rat myocardium in each group.圖2 各組大鼠心肌TCC染色圖

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清Myo和cTnI水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，利多卡因組大鼠血清Myo和cTnI水平顯著降低（P＜0.01），見圖3。

Figure 3.Serum Myo（A）and cTnI（B）levels of rats were com?pared in each group.Mean±SD. n=5.**P＜0.01 vs sham group；##P＜0.01 vs model group.圖3 各組大鼠血清Myo和cTnI水平比較

4 各組大鼠心肌組織病理學(xué)變化

假手術(shù)組大鼠心肌纖維結(jié)構(gòu)排列緊密，無明顯異常；模型組大鼠心肌組織排列紊亂、細(xì)胞水腫、炎癥細(xì)胞浸潤、間質(zhì)血管擴(kuò)張充血，可見局灶性心肌壞死；利多卡因組大鼠心肌病理損傷減輕，見圖4。

Figure 4.Morphological changes of myocardial pathology in each group（HE staining，scale bar=100 μm）.圖4 各組大鼠心肌病理學(xué)形態(tài)變化

5 各組大鼠心肌組織MDA含量和SOD活性比較

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌組織MDA 含量顯著升高，SOD 活性顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，利多卡因組大鼠心肌組織MDA 含量顯著降低，SOD活性顯著升高（P＜0.01），見圖5。

Figure 5.Comparison of MDA content and SOD activity in myo?cardial tissue of rats in each group.Mean±SD. n=10.**P＜0.01 vs sham group；##P＜0.01 vs model group.圖5 各組大鼠心肌組織MDA含量和SOD活性比較

6 各組大鼠心肌組織Nrf2 和HO-1 mRNA 表達(dá)水平比較

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌組織Nrf2 和HO-1 mRNA 表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，利多卡因組大鼠心肌組織Nrf2 和HO-1 mRNA表達(dá)水平進(jìn)一步升高（P＜0.01），見圖6。

7 各組大鼠心肌組織Nrf2 和HO-1 蛋白表達(dá)量比較

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌組織Nrf2 和HO-1 蛋白表達(dá)量升高（P＜0.01）；與模型組比較，利多卡因組大鼠心肌組織Nrf2 和HO-1 蛋白表達(dá)量進(jìn)一步升高（P＜0.01），見圖7。

討論

Figure 6.Relative expression of Nrf2 and HO-1 mRNA in myo?cardial tissue of rats in each group.Mean±SD. n=10.**P＜0.01 vs sham group；##P＜0.01 vs model group.圖6 各組大鼠心肌組織Nrf2和HO-1 mRNA水平的比較

Figure 7.Relative protein expression of Nrf2 and HO-1 in myo?cardial tissue of rats in each group.Mean±SD. n=10.**P＜0.01 vs sham group；##P＜0.01 vs model group.圖7 大鼠心肌組織Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)

本研究采用經(jīng)典盲腸結(jié)扎穿孔法制備膿毒癥大鼠模型，膿毒癥發(fā)生時(shí)，大量炎癥因子如TNF-α、HMGB1 及白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）等釋放可導(dǎo)致多器官損傷。TNF-α 是膿毒癥發(fā)生發(fā)展的重要促炎因子，HMGB1 是一種普遍存在的核蛋白，可介導(dǎo)先天免疫反應(yīng)，是膿毒癥致死效應(yīng)的關(guān)鍵炎癥介質(zhì)，膿毒癥晚期單核/巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞可在TNF-α 等炎癥因子刺激作用下分泌HMGB1 等促炎因子，HMGB1 表達(dá)水平與膿毒癥嚴(yán)重程度及預(yù)后高度相關(guān)［12-13］。膿毒癥可導(dǎo)致多器官功能障礙，心臟是易受損器官之一，心肌損傷是導(dǎo)致膿毒癥死亡率增加的重要原因之一。Myo 和cTnI 是心肌損傷標(biāo)志物，其中Myo 是一種氧結(jié)合的血紅蛋白，主要存在于骨骼肌和心肌，對心肌損傷具有較高的敏感性。cT?nI 特異存在于心肌細(xì)胞中，心肌細(xì)胞損傷時(shí)釋放入血，且持續(xù)時(shí)間較長。本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清TNF-α 和HMGB1 水平、大鼠心肌梗死率、血清Myo 和cTnI水平顯著升高，提示膿毒癥心肌損傷大鼠制備成功。而利多卡因可降低膿毒癥心肌損傷模型大鼠血清TNF-α、HMGB1、Myo 和cTnI 水平，減輕心肌病理損傷，減少心肌梗死面積。利多卡因是一種臨床常用藥，具有價(jià)格低廉、抗炎、抗細(xì)胞損傷等作用，還可加快術(shù)后康復(fù)、促進(jìn)抗癌細(xì)胞增殖等作用，持續(xù)靜脈泵注射可有效降低膿毒癥大鼠炎癥因子TNF-α 和HMGB1 表達(dá)，抑制肺組織HMGB1 表達(dá)，減輕膿毒癥肺損傷，提高動(dòng)物存活率［14］，提示利多卡因可抑制膿毒癥心肌損傷大鼠炎癥因子表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)及心肌梗死損傷程度，與郭志佳等［15］研究報(bào)道結(jié)果一致。

氧化應(yīng)激反應(yīng)過度激活是引起心肌損傷的重要環(huán)節(jié)，其中Nrf2/HO-1 通路是抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要信號通路之一，Nrf2 是重要抗氧化因子，生理?xiàng)l件下，Nrf2 與Kelch 樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1（Kelch like epichlorohydrin associated protein 1，Keap1）相偶聯(lián)處于抑制狀態(tài)，氧自由基可刺激Nrf2增加并與Ke?ap1 解離，Nrf2 通過核轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核與氧化反應(yīng)元件（antioxidant responsive element，ARE）啟動(dòng)HO-1、SOD 和GSH-PX 等抗氧化酶表達(dá)，啟動(dòng)抗氧化反應(yīng)［16-17］。研究認(rèn)為，促進(jìn)Nrf2/HO-1 通路激活可保護(hù)心肌梗死后不良的心臟重構(gòu)［18］，可能與促進(jìn)下游SOD和GSH-PX等抗氧化酶表達(dá)，提高心肌抗氧化能力有關(guān)，而利多卡因減輕心肌損傷是否與該通路激活有關(guān)未見報(bào)道［19］。本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌組織MDA 含量、心肌組織Nrf2 和HO-1 蛋白表達(dá)量顯著升高，SOD 活性顯著降低，可能與心肌損傷后機(jī)體出現(xiàn)自身代償使Nrf2/HO-1 通路激活有關(guān)［20］；利多卡因可顯著降低膿毒癥心肌損傷大鼠心肌組織MDA 含量，增加SOD 活性及心肌組織Nrf2 和HO-1 表達(dá)水平，與文獻(xiàn)報(bào)道一致，提示利多卡因可能對Nrf2/HO-1 通路激活有促進(jìn)作用，進(jìn)而減輕膿毒癥大鼠心肌損傷，提高其抗氧化應(yīng)激能力。

綜上所述，利多卡因可減輕膿毒癥大鼠心肌損傷，其機(jī)制可能與促進(jìn)Nrf2/HO-1 通路激活，提高心肌細(xì)胞抗氧化應(yīng)激能力有關(guān)。但本項(xiàng)工作只是初步探究了利多卡因抗膿毒癥心肌損傷的作用機(jī)制，關(guān)于其對Nrf2/HO-1 下游炎癥相關(guān)信號通的影響尚不完全明確，有待深入研究。