原曉龍 劉 音 康洪梅 陳中華 李云琴 王 毅

（1. 云南省林業(yè)和草原科學(xué)院，云南省森林植物培育與開(kāi)發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/國(guó)家林業(yè)局云南珍稀瀕特森林植物保護(hù)和繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650201；2. 云南省水文水資源局昆明分局/云南省水環(huán)境監(jiān)測(cè)中心昆明市分中心，云南 昆明 650051）

葉綠體植物自身?yè)碛邢鄬?duì)獨(dú)立穩(wěn)定的基因組，具母系遺傳、負(fù)責(zé)光合作用的半自主細(xì)胞器[1]，其結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、分子量較小、拷貝數(shù)豐富，被廣泛應(yīng)用于DNA條形碼分子標(biāo)記、系統(tǒng)進(jìn)化和葉綠體基因工程等[2-3]；基于葉綠體的基因工程可避免花粉逃逸帶來(lái)的生物安全問(wèn)題，可迅速得到表達(dá)量極高的轉(zhuǎn)基因純合后代[4]，及評(píng)估物種的分子系統(tǒng)進(jìn)化水平[1]。除甲硫氨酸和色氨酸外，各氨基酸均有2～6個(gè)三聯(lián)體同義密碼子與其相對(duì)應(yīng)[5]。在翻譯過(guò)程中，編碼同一氨基酸的同義密碼子使用頻率并不相同，表現(xiàn)為有的較高，有的較低，這種偏好使用某一密碼子的現(xiàn)象被稱(chēng)為密碼子偏好性[6]。密碼子偏好性是物種在漫長(zhǎng)的進(jìn)化過(guò)程中受環(huán)境選擇、堿基突變、基因漂變等多種因素共同作用，亦受到基因組大小、tRNA豐度和基因表達(dá)水平等的影響[6-8]。

蒜頭果（Malania oleifera）是鐵青樹(shù)科（Olacaceae）蒜頭果屬常綠喬木，1992年被中國(guó)植物紅皮書(shū)列為國(guó)家重點(diǎn)保護(hù)樹(shù)種[9]；目前已處于瀕危狀態(tài)，主要生長(zhǎng)在中國(guó)滇東南和桂西喀斯特山地[10]。蒜頭果果仁中油脂含量含量高達(dá)51.9%～64.5%[11]，果仁油中順-15-二十四碳烯酸（又名神經(jīng)酸、鯊魚(yú)酸）是哺乳類(lèi)動(dòng)物腦苷脂和神經(jīng)組織的主要成分[12]，還是合成某些昆蟲(chóng)信息素中間體和麝香酮的原料[13]，也是一種具重要藥用和保健價(jià)值的高級(jí)脂肪酸[14]，開(kāi)發(fā)前景巨大[13]。蒜頭果在形態(tài)解剖上兼具原始性狀和進(jìn)化特征，對(duì)研究鐵青樹(shù)科植物的進(jìn)化具重大意義[10,15-16]，目前有關(guān)蒜頭果葉綠體基因組的研究報(bào)道較少，本研究以蒜頭果葉綠體基因組的高通量測(cè)序結(jié)果為基礎(chǔ)，通過(guò)分析蒜頭果葉綠體基因組蛋白編碼區(qū)（CDS）序列的堿基組成，中性繪圖、ENC-plot及PR2-plot等方法分析影響密碼子偏好性的主要因素，確定了蒜頭果葉綠體基因組的最優(yōu)密碼子，以期為研究蒜頭果分子系統(tǒng)進(jìn)化、遺傳多樣性分析及培育神經(jīng)酸含量較高的植株品系等提供科學(xué)的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究通過(guò)高通量測(cè)序獲得蒜頭果葉綠體基因組序列，并提交至NCBI（登錄號(hào)：MG799332），對(duì)蒜頭果葉綠體的編碼序列（CDS）進(jìn)行篩選，剔除序列長(zhǎng)度小于300 bp、序列不完整、中間存在終止密碼子的序列，從蒜頭果葉綠體基因組篩選得到含有起始密碼子ATG和末端終止密碼子UAA、UAG、UGA的完整CDS[17]獲得33條。

1.2 方法

1.2.1 密碼子堿基組成分析

將蒜頭果葉綠體基因組中符合條件的33條CDS整合到一個(gè).fasta文件中，通過(guò)CUSP（http://emboss.toulouse.inra.fr/cgi-bin/emboss/cusp）計(jì)算不同基因密碼子各位置的GC含量（GC1，GC2，GC3）[4]；應(yīng)用Codon W 1.4.2 軟件分析密碼子的有效密碼子數(shù)（ENC）、相對(duì)同義密碼子使用度（RSCU）、密碼子適應(yīng)性指數(shù)（CAI）、密碼子偏好性指數(shù)（CBI）、最優(yōu)密碼子使用頻率（FOP）及密碼子3位堿基上的GC含量（GC3S，即密碼子第3個(gè)堿基中出現(xiàn)G或C的頻率）等參數(shù)；對(duì)獲得的各項(xiàng)數(shù)據(jù)，應(yīng)用數(shù)理統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS和EXCEL對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。

ENC可衡量同義密碼子的使用偏度，其取值范圍為20～61，對(duì)應(yīng)密碼子使用偏性從強(qiáng)到弱，即20代表同義密碼子處于完全偏倚狀態(tài)、61代表同義密碼子完全沒(méi)有偏倚；通常以ENC值45為區(qū)分密碼子偏倚性強(qiáng)弱的分界點(diǎn)[4,17]。RSCU表示某個(gè)密碼子的實(shí)際值與理論值間的比值，當(dāng)RSCU＞1時(shí)表明該密碼子實(shí)際值高于理論值，RSCU＜1時(shí)表明其實(shí)際值低于理論值，RSCU=1該密碼子無(wú)偏好性[4]。

應(yīng)用SPSS 17.0分析蒜頭果葉綠體基因組中各基因密碼子不同位置GC堿基含量GC1、GC2、GC3、GCall、ENC和密碼子數(shù)量（N）的相關(guān)關(guān)系，作為判斷各同義密碼子偏好性的依據(jù)。

1.2.2 中性繪圖分析

三聯(lián)體密碼子第1～2位堿基的改變會(huì)導(dǎo)致編碼氨基酸的改變，而第3位堿基的改變通常不會(huì)引起氨基酸的變化[18]。通常密碼子在不存在外界壓力的情況下，3個(gè)位置上的堿基組成無(wú)顯著差異；在外界具選擇壓力的條件下，3個(gè)位置的堿基會(huì)存在一定的差異[4]。以GC12（GC1、GC2的平均值）為縱坐標(biāo)、以GC3為橫坐標(biāo)繪制的散點(diǎn)圖中，每1散點(diǎn)代表1個(gè)基因。在中性圖中，若所有散點(diǎn)均沿對(duì)角線(xiàn)分布，說(shuō)明GC12和 GC3的變異基本一致，即密碼子的堿基組成無(wú)明顯差異，主要受突變的影響；相反則受選擇壓力的影響[18]。結(jié)合SPSS 17.0對(duì)GC12和GC3的相關(guān)性分析，以判斷其密碼子偏好性主要受選擇或突變的影響，當(dāng)GC12和 GC3呈顯著性相關(guān)時(shí)，說(shuō)明密碼子3個(gè)位置上的堿基組成無(wú)明顯差異，其偏好性主要受突變的影響；當(dāng)GC12和 GC3不相關(guān)時(shí)，說(shuō)明密碼子的第1、2位與第3位堿基組成存在顯著差異，且基因組中GC含量較保守，其偏好性主要受選擇的影響[4,18]。另回歸系數(shù)（對(duì)角線(xiàn)斜率）亦可以作為衡量中性程度的指標(biāo)之一，若回歸系數(shù)較小，GC12和GC3的變異的相關(guān)性較低，說(shuō)明選擇是影響密碼子偏好性的主要因素[19]。

1.2.3 ENC-plot分析

ENC-plot分析通過(guò)探討ENC與GC3分布關(guān)系，即通過(guò)對(duì)各基因的密碼子偏好性的圖像可視化手段，同時(shí)含有散點(diǎn)圖和標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，其中的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)代表無(wú)選擇壓力的存在時(shí)，密碼子偏好性完全由基因的核酸序列決定密碼子偏好性[20]。以GC3為橫坐標(biāo)、ENC值為縱坐標(biāo)進(jìn)行ENC-plot分析，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的計(jì)算公式為：

通過(guò)散點(diǎn)與標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)距離判斷影響密碼子偏好性的主要因素，若散點(diǎn)與標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的距離較近則主要受突變的影響，反之受選擇的影響[18,21]。為了能夠準(zhǔn)確量化散點(diǎn)與標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的距離遠(yuǎn)近的基因數(shù)量，需結(jié)合ENC比值頻數(shù)分布差異來(lái)執(zhí)行，具體的衡量標(biāo)準(zhǔn)以-0.05～0.05區(qū)間為界限[21-22]。

1.2.4 PR2-plot分析

統(tǒng)計(jì)各密碼子第3位上A、T、C、G等堿基的具體含量，以A3/（A3+T3）為縱坐標(biāo)、G3/（G3+C3）為橫坐標(biāo)進(jìn)行PR2-plot分析，以平面圖顯示各密碼子中的第3位堿基組成方式，其中A3、T3、C3、G3分別代表各堿基在密碼子第3位上的具體含量；平面圖的中心點(diǎn)代表在無(wú)偏倚情況下的密碼子組成狀態(tài)，即A=T且C=G，各點(diǎn)與中心點(diǎn)的矢量距離則表示其偏倚的程度和方向[20]。

1.2.5 最優(yōu)密碼子的確定

以蒜頭果葉綠體中各基因的ENC值為偏好性參考標(biāo)準(zhǔn)，從兩極各選擇10%的基因構(gòu)建高低偏性庫(kù)，將高、低偏性庫(kù)間ΔRSCU≥0.08的密碼子定義為高表達(dá)優(yōu)越密碼子；同時(shí)將各密碼子在經(jīng)Codon W 1.4.2軟件分析的RSCU值≥1的密碼子定義為高頻密碼子；將同時(shí)滿(mǎn)足ΔRSCU≥0.08和RSCU值≥1的密碼子定為最優(yōu)密碼子，以明確蒜頭果葉綠體基因組密碼子的使用偏性規(guī)律[4,21-22]。

2 結(jié)果與分析

2.1 密碼子堿基組成分析

應(yīng)用Codon W 1.4.2軟件分析蒜頭果葉綠體中各基因的蛋白編碼序列，結(jié)果顯示（表1），GC1含量為33.90%～57.35%，其中GC1≥40%的基因有30條，平均值為47.74%；GC2含量為30.04%～57.45%，其中GC2≥40%的基因有19條，平均值為41.05%；GC3含量為21.28%～36.70%，平均值為28.43%，無(wú)基因的GC含量≥ 40%；全部3個(gè)位置的GC含量平均值為39.07%，各位置的GC含量平均值從高到低依次為GC1＞GC2＞GC3，其第3位平均GC含量遠(yuǎn)低于第1位、第2位，說(shuō)明密碼子第3位堿基多為A和U。33個(gè)蛋白編碼序列的ENC值為40.39～54.86，ENC值大于45的有25個(gè)，可推斷其使用偏性較弱。

密碼子各位置的堿基GC含量GC1、GC2、GC3，3個(gè)位置GC的平均含量GCall、ENC與密碼子數(shù)目（N）的相關(guān)分析（表2），結(jié)果顯示：GCall與GC1、GC2、GC3均呈極顯著相關(guān)，GC1與GC2呈顯著相關(guān)，說(shuō)明密碼子的第1位與第2位的堿基組成相似，但與第3位存在不同。ENC與GC3達(dá)到極顯著相關(guān)水平，與N達(dá)顯著相關(guān)，而與GC1、GC2及GCall之間呈不顯著相關(guān)，說(shuō)明密碼子第3位GC含量和N影響ENC的值，說(shuō)明GC3和基因序列長(zhǎng)度對(duì)密碼子偏好性存在一定影響。

表 1 蒜頭果葉綠體基因組33個(gè)CDS密碼子的GC含量及ENC值Table 1 The GC content and ENC value of 33 CDS codons from M. oleifera

表 2 蒜頭果葉綠體各基因GC含量與ENC值間的關(guān)聯(lián)分析Table 2 The correlation analysis of GC content and ENC value of each gene codons of M. oleifera

除蛋氨酸、色氨酸外，分析其余18種氨基酸的RSCU值（表3），結(jié)果顯示，RSCU≥1的密碼子有30個(gè)，其中UUA、AGA、CAA和AAA等12個(gè)密碼子以A結(jié)尾；GCU、UCU、ACU和UAU等16個(gè)密碼子以U結(jié)尾；而以C和G結(jié)尾的僅有UUG、UCC；說(shuō)明蒜頭果葉綠體基因組中以A和U結(jié)尾的密碼子出現(xiàn)頻率較高，為偏好密碼子；相反以C和G結(jié)尾的密碼子為非偏好密碼子。

2.2 中性繪圖分析

中性繪圖分析（圖1）顯示，GC1和GC2的平均值GC12的取值為0.348～0.546，GC3的取值為0.213～0.367；圖中各基因均位于中性圖對(duì)角線(xiàn)的上方，僅1個(gè)基因位于對(duì)角線(xiàn)附近；GC12和GC3的相關(guān)系數(shù)為0.164 6，相關(guān)性不顯著，回歸系數(shù)為0.000 4，滿(mǎn)足GC12和GC3呈不顯著相關(guān)且回歸系數(shù)趨近于0，說(shuō)明蒜頭果葉綠體基因組密碼子的第3位堿基與第1、2位堿基組成不同，基因組中GC含量高度保守，其密碼子偏好性主要受選擇的影響。

2.3 ENC-plot繪圖分析

蒜頭果葉綠體基因組密碼子的ENC與GC3的關(guān)聯(lián)分析（圖2）顯示，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)（公式（1））計(jì)算，距離較近基因的實(shí)際ENC值與預(yù)期ENC值接近；部分基因位于標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)下方較遠(yuǎn)位置，這部分基因ENC的實(shí)際值與預(yù)測(cè)值具較大差異。通過(guò)計(jì)算ENC比值（（預(yù)期ENC值-實(shí)際ENC值）/預(yù)期ENC值）可以比較ENC值的實(shí)際值與預(yù)期值的差異，結(jié)果顯示（表4），ENC比值分布在-0.05～0.05區(qū)間的數(shù)量有10個(gè)，處于-0.05～0.05區(qū)間外的基因有23個(gè)，占基因總數(shù)的70%，這部分基因與標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)距離較遠(yuǎn)，因此其偏好性與GC3含量相關(guān)。說(shuō)明影響其偏好性主要因素為選擇。

表 3 蒜頭果葉綠體基因組氨基酸相對(duì)同義密碼子使用度分析Table 3 The RSCU analysis of codon in M. oleifera chloroplast genome

圖 1 中性繪圖分析Fig. 1 Neutral plotting analysis

2.4 PR2-plot分析

采用PR2-plot繪圖方法分析各編碼基因部分氨基酸嘌呤（A和G）和嘧啶（T和C）關(guān)系，結(jié)果顯示（圖3），蒜頭果葉綠體基因組中較多的基因分布在PR2圖的下半部或右下半部，說(shuō)明在堿基使用頻率方面，T＞A且G＞C，4個(gè)堿基的使用頻率不一致，說(shuō)明蒜頭果葉綠體基因組密碼子使用偏性在受選擇影響的同時(shí)，亦會(huì)受到其他因素的影響。

圖 2 ENC與GC3關(guān)聯(lián)分析Fig. 2 The correlation of ENC and GC3

表 4 ENC比值頻數(shù)分布Table 4 Distribution of ENC ration

圖 3 PR2-plot繪圖分析Fig. 3 Analysis of PR2 bias plot

2.5 最優(yōu)密碼子的確定

將蒜頭果葉綠體基因組中高表達(dá)基因和低表達(dá)基因分別在Codon W 1.4.2軟件上運(yùn)行，計(jì)算各自密碼子的RSCU值和ΔRSCU值，結(jié)果顯示（表5），ΔRSCU≥0.08的為高表達(dá)優(yōu)越密碼子，共23個(gè)，其中9個(gè)以A結(jié)尾，11個(gè)以U結(jié)尾，3個(gè) 以C結(jié) 尾；ΔRSCU≥0.30的 密 碼 子 有10個(gè)，ΔRSCU≥0.50的密碼子有6個(gè)。將同時(shí)滿(mǎn)足ΔRSCU≥0.08和RSCU≥1的密碼子的定義為最優(yōu)密碼子，共18個(gè)，分別為UUU、UUA、GUA、UCC、CCU、CCA、ACU、ACA、AUU、CAU、CAA、AAU、AAA、GAU、GAA、UGU、AGA和GGU，其中以A結(jié)尾的密碼子8個(gè)，以U結(jié)尾的9個(gè)，以C結(jié)尾的1個(gè)。

表 5 蒜頭果葉綠體基因組最優(yōu)密碼子的確定Table 5 Preferred codons in chloroplast genome of M. oleifera

3 結(jié)論與討論

密碼子偏好性受多因素的影響，而選擇和突變是其中主要的2個(gè)因素[6]。密碼子堿基組成會(huì)因?yàn)橛珊塑账嵬蛔兒突貜?fù)突變而發(fā)生改變，而第3位堿基上的突變通常不會(huì)造成氨基酸的改變，可認(rèn)為密碼子偏好性是某種程度上對(duì)偏好密碼子和非偏好密碼子間保留的一種平衡，是物種進(jìn)化過(guò)程中的自我保護(hù)機(jī)制；同時(shí)第3位堿基具兼并性，面對(duì)的自然選擇的壓力較小，且GC3與密碼子偏好性具顯著相關(guān)關(guān)系等，是決定氨基酸種類(lèi)的重要特征，故將GC3作為分析密碼子偏好性的一個(gè)重要指標(biāo)[23-24]。因此，計(jì)算密碼子第3位堿基的GC含量對(duì)分析密碼子偏好性具重要意義，本研究中蒜頭果葉綠體基因組密碼子第3位堿基的GC含量為28.43%，其GC含量遠(yuǎn)低于密碼子前兩位，與馬尾松（Pinus massoniana）[25]葉綠體基因組中不同位置GC含量依次為GC1（49.12%）＞GC2（40.62%）＞GC3（29.68%），蝴蝶蘭（Phalaenopsis aphroditesubsp.formosana）[26]為GC1（45.83%）＞GC2（39.06%）＞GC3（31.41%），3個(gè)物種葉綠體基因組中密碼子不同位置的GC含量的分布趨勢(shì)一致，僅在具體數(shù)據(jù)上有差異。同時(shí)中性繪圖分析、ENC-plot和PR2-plot分析均發(fā)現(xiàn)蒜頭果葉綠體基因組的密碼子偏好性較弱，主要受選擇的影響，同時(shí)受其他因素的綜合影響，這與大多數(shù)雙子葉植物的表現(xiàn)一致[21-22,25-27]。蒜頭果葉綠體基因組密碼子偏好以AU結(jié)尾，且其最優(yōu)密碼子除了UCC以外，其余的17個(gè)密碼子表現(xiàn)形式均為NNA或NNU模式一致，同樣與大多數(shù)雙子葉植物的模式一致[25-27]。這種密碼子的使用模式可能由于葉綠體基因組中含有豐富的AU堿基，但不同植物密碼子使用模式存在顯著差異，因?yàn)橛H緣關(guān)系較近的植物通常表現(xiàn)為相似的密碼子使用模式[28]。通過(guò)將蒜頭果葉綠體基因組密碼子偏好性與5種柿屬（Diospyros）植物比對(duì)，它們具有相似的GC含量分布趨勢(shì)，密碼子偏好性均較弱，且選擇均為其主要的影響因素[29]。蒜頭果僅分布于云南東南部和廣西西部的喀斯特石灰?guī)r山地中[9]，而蒜頭果葉綠體基因組密碼子的偏好性與其親緣關(guān)系相對(duì)較近的柿屬植物的密碼子使用模式基本一致，表現(xiàn)出一定的特異性，如柿屬植物植物中不含有最優(yōu)密碼子UCC[29]，而蒜頭果中則含有這一最優(yōu)密碼子，說(shuō)明蒜頭果葉綠體基因組的密碼子偏好性相對(duì)保守且具有自身的特殊性。本研究通過(guò)分析蒜頭果葉綠體密碼子偏好性，明確其密碼子使用模式，存在較弱的偏好性，且分析獲得了蒜頭果葉綠體中編碼基因的最優(yōu)密碼子，以期為研究蒜頭果適應(yīng)性、分子系統(tǒng)進(jìn)化及葉綠體基因工程等提供參考依據(jù)。