蔡斌，陳永華，杜露，何浪君

（中南林業(yè)科技大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，湖南 長沙 410004）

近年來，土壤重金屬污染日益嚴(yán)重。其對生態(tài)環(huán)境造成嚴(yán)重破壞，對工農(nóng)業(yè)的發(fā)展及人類的健康也產(chǎn)生了巨大的威脅。在所有元素中，鉛（Pb）是對人類和其他生命危害最為廣泛的有毒金屬之一[1]。由于它的用途與來源廣泛，使其成為我國土壤重金屬污染的主要污染物之一[2]。Pb在土壤中不易淋溶，不被微生物降解，導(dǎo)致其易在土壤中大量累積[3]。土壤中的Pb進入到植物體內(nèi)，對植物的代謝產(chǎn)生危害，阻礙植物的生長發(fā)育，嚴(yán)重時甚至致其死亡[4]。此外，Pb還能通過動植物的食物鏈傳播，最終在人體內(nèi)累積，對人體產(chǎn)生毒害[5]。因此，對土壤Pb污染的治理十分迫切。植物修復(fù)因成本低，效果持久，無二次污染等特點，成為近年來的主要治理手段。植物修復(fù)主要通過植物提取和植物穩(wěn)定化過程來去除或轉(zhuǎn)化土壤中的重金屬，消除或減弱其毒性和遷移性。過去，研究者把重點放在超富集植物的植物提取上，但近十年來，由于植物提取過程普遍效率低下，使用超富集植物進行植物提取的研究一直在減少[6]。而一些耐重金屬的草本植物由于其生長迅速，生物量大且具有一定的經(jīng)濟效應(yīng)而受到廣泛的關(guān)注。如芥菜[7]和曲序香茅[8]等。

博落回（Macleaya cordata（Willd.）R.Br.）屬于多年生草本植物，在中國南方廣泛分布。研究證明，博落回對重金屬具有較高的耐性，對Pb、鋅（Zn）、銅（Cu）、鎘（Cd）、砷（As）皆有較好的富集效果[9]。Wang等[10]的研究證明博落回可用于Hg污染土壤的植物修復(fù)。Nie等[11]證明博落回對Cd具有較好的富集效果，高濃度的Cd脅迫下，仍具有良好的耐受性，且地上部分的Cd富集量接近超富集植物的標(biāo)準(zhǔn)。與超富集植物相比，博落回以其藥用特性和較高的經(jīng)濟價值提供了可持續(xù)的植物修復(fù)的可能性。劉鵬[12]和Pan等[13]均研究了博落回對錳（Mn）的富集及脅迫響應(yīng)機制，證明其對Mn具有良好的耐性及富集特性。但博落回對Pb耐性、富集及脅迫響應(yīng)的研究尚不深入，因此本研究以沙培實驗作為培養(yǎng)條件，研究了博落回對Pb的耐性、轉(zhuǎn)運和富集效應(yīng)以及Pb在博落回體內(nèi)的亞細(xì)胞和化學(xué)形態(tài)分布，同時，研究了博落回對不同濃度Pb脅迫的生理生化響應(yīng)，利用TEM和FTIR技術(shù)觀察了博落回的微觀結(jié)構(gòu)和官能團組成的響應(yīng)，以期為博落回修復(fù)Pb污染土壤提供更多的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

博落回購置于邵陽市某基地，選取生長良好，長勢一致的幼苗植株備用。河沙購置于長沙某建筑材料五金店。

1.2 實驗設(shè)計

于2020年6月開始進行試驗，將所有河沙經(jīng)自來水沖洗后過2 mm篩，再用2%硝酸浸泡過夜后用去離子水沖洗干凈。之后將河沙裝入直徑為20 cm，高度為15 cm的塑料花盆中。分別向盆中河沙加入500 mL不同濃度的溶液態(tài)鉛（分析純硝酸鉛），濃度為0、200、500、800、1 000、1 500、2 000 mg/L。使河沙中的鉛離子充分熟化。1個月后將大小長勢一致的博落回幼苗移栽至花盆中，每盆一株，每個濃度梯度設(shè)置10個平行。用500 mL 1/2 Hoagland營養(yǎng)液進行澆灌培養(yǎng)，2 d澆灌一次，穩(wěn)定1周后，再以Pb(NO3)2形式進行脅迫處理，每周澆2次處理液，每次澆200 mL，分10次完成整個脅迫過程。盆栽實驗在中南林業(yè)科技大學(xué)樹木樓外苗圃進行，平均氣溫在25～35 ℃之間，相對濕度在45%～85%之間。移栽40 d后，全株收獲植物。

1.3 樣品處理和分析

1.3.1 樣品處理 收獲的植株用自來水洗凈根部，然后將植株根部放置于5 mmol/L Ca(NO3)2溶液中浸泡15 min，除去吸附在根系表面的Pb離子，然后用去離子水浸泡沖洗整株植物，濾紙吸干表面水分。將每株植物分為根、莖、葉3個部分。

1.3.2 生長指標(biāo)及Pb含量測定 用卷尺測定博落回地上部高度；根長和根尖數(shù)由根系掃描儀測量（Winrhigo PRO）；將植物根、莖、葉置于烘箱中105 ℃殺青30 min，再于75 ℃烘干至恒重，測定其生物量干重；之后將植物粉碎后稱量1.000 g，在電熱板上采用濕法（HNO3-HClO4）消解[14]，用火焰原子吸收分光光度計（AA-7002，Thermo Fisher）測量Pb含量。

1.3.3 生理生化指標(biāo)測定 用分光光度法測定博落回葉片葉綠素含量；硫代巴比妥酸法測定丙二醛（Malondialdehyde, MDA）含量；考馬斯亮藍(lán)G250顯色法測定可溶性蛋白含量[11]；氮藍(lán)四唑（Nitroblue tetrazolium, NBT）法、愈創(chuàng)木酚氧化法和紫外吸收法分別測定超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）、過氧化物酶（Peroxidase, POD）和過氧化氫酶（Catalase, CAT）的活性[15]。

1.3.4 亞細(xì)胞組分分離及化學(xué)形態(tài)分析 采用差速離心法分離植物組織的不同細(xì)胞組分[16]：在20 mL預(yù)冷（4 ℃）的萃取緩沖液（250 mmol/L蔗糖+1.0 mmol/L二硫蘇糖醇+調(diào)節(jié)pH至7.5的50 mmol/L Tris-HCl）中分別將稱取的2.0 g博落回各組織鮮樣研磨成勻漿并轉(zhuǎn)移到50 mL離心管中，在2 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心1 min。過濾，保留上清液，第一個沉淀為“細(xì)胞壁組分”。上清液繼續(xù)在10 000 r/min的轉(zhuǎn)速下進一步離心30 min，所得沉淀物為“細(xì)胞器組分”，最終上清液為“可溶性組分”。所有操作均在4 ℃下進行。各組分的樣品經(jīng)濕法（HNO3-HClO4）消解后用火焰原子吸收分光光度計測定其具體含量[14]?；瘜W(xué)試劑逐步提取法提取植株體內(nèi)Pb的不同化學(xué)形態(tài)[17]。用指定的提取劑按以下順序提取不同化學(xué)形態(tài)的Pb，包括80%乙醇，去離子水，1 mol/L的NaCl溶液，2%的醋酸（HAc）溶液和0.6 mol/L的HCl溶液。提取后的剩余部分為Pb的殘渣態(tài)。稱取2.0 g洗凈的根、莖和葉組織鮮樣，使用石英砂和研磨棒在20 mL的提取液中將其研磨成勻漿，然后放置于搖床在室溫下震蕩22 h。勻漿在5000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心10 min。過濾和保留上清液，沉淀中再次加入10 mL提取液，室溫下震蕩2 h之后在5000 r/min下離心10 min后過濾，將兩次的上清液混合。使用下一提取劑重復(fù)此過程。各組分的樣品經(jīng)濕法（HNO3-HClO4）消解后用火焰原子吸收分光光度計測定其具體含量[14]。

1.3.5 微觀結(jié)構(gòu)和官能團測定分析 使用透射電子顯微鏡（FEI Tecnai G2 Spirit）分析博落回的微觀結(jié)構(gòu)；用傅立葉紅外光譜儀（Nicolet-460）分析博落回官能團的組成。

1.4 數(shù)據(jù)處理

富集系數(shù)（BCF）是植物地上部富集Pb含量與基質(zhì)中添加的Pb含量之比，表明植物從環(huán)境中富集Pb的效率；轉(zhuǎn)運系數(shù)（TF）是植物地上部富集Pb含量與根部富集Pb含量之比，表示植物將Pb從根部轉(zhuǎn)移到地上部的能力；耐性指數(shù)（TI）是Pb脅迫處理的博落回株高、生物量、根長與對照處理相應(yīng)指標(biāo)之比，取三者平均值所得。

所有數(shù)據(jù)均表示為3次重復(fù)實驗（n = 3）的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。數(shù)據(jù)顯著性檢驗采用 SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件完成，制圖均采用 Origin 2018 軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 博落回對Pb的耐性分析

由Pb脅迫對博落回的生長影響（表1）可知，隨著Pb脅迫濃度的升高，博落回的株高、總生物量、根長以及根尖數(shù)均出現(xiàn)先增后減的趨勢。當(dāng)Pb脅迫為500 mg/L時，植株的各項生長指標(biāo)較對照組均有顯著增加(P＜0.05)，由此可見，博落回對Pb的耐受臨界值為500 mg/L，此濃度及以下Pb脅迫能促進植物的生長，而高于此濃度的Pb脅迫時，植株受到的毒害作用明顯，植株的生長受到抑制。植物的耐性指數(shù)是衡量博落回受到脅迫時抗逆性的重要體現(xiàn)。根據(jù)耐性指數(shù)的大小，可以將植物分為高耐受性（TI ＞ 60%）、中耐受性（35% ≤ TI ≤ 60%）和敏感型（TI ＜ 35%）三類，由表1可知，在受到不超過1 500 mg/L的Pb脅迫時，博落回的耐性指數(shù)均大于60%，屬于Pb的高耐性植物。

表1 Pb脅迫對博落回生長的影響Table 1 Effects of Pb on the growth of M. cordata

2.2 博落回對Pb的富集能力分析

由博落回在Pb脅迫下的重金屬含量（表2）可知，隨著脅迫濃度的增加，博落回各部分對Pb的富集量隨之增強，且各組織中Pb含量呈現(xiàn)根＞莖＞葉的現(xiàn)象。根、莖、葉中富集的Pb含量分別為543.4～2 980.6 mg/kg、147.5～483.7 mg/kg和46～305 mg/kg。博落回的富集系數(shù)隨著脅迫濃度的升高而降低，低濃度（200～500 mg/L）、中濃度（800～1 000 mg/L）與高濃度（1 500～2 000 mg/L）的脅迫比較，富集系數(shù)差異顯著(P＜0.05)。說明隨著Pb濃度的升高，博落回對Pb的富集能力降低，在較低的濃度時，富集系數(shù)最高可達(dá)0.97，說明博落回在低濃度的Pb脅迫時有較強的富集能力。博落回的轉(zhuǎn)運系數(shù)基本呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，在800 mg/L的Pb脅迫時，轉(zhuǎn)運系數(shù)顯著高于低濃度與高濃度處理(P＜0.05)，達(dá)到最大值0.39。

2.3 博落回對Pb的生理生化響應(yīng)

由圖1-A可知：博落回葉綠素含量隨著Pb脅迫濃度的升高，呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，脅迫濃度為500 mg/L時，葉綠素含量水平達(dá)到最高，較對照組顯著(P＜0.05)升高了49.8%，隨后顯著降低。葉綠素a/b的變化趨勢與葉綠素含量的變化一致，并且在Pb濃度高于500 mg/L時，葉綠素a/b的值迅速降低。說明高于此濃度時，植物的葉片黃化過程加劇。

表2 博落回在Pb脅迫下的重金屬含量Table 2 Pb content in different tissues of M. cordata under Pb stress

由圖1-B可知：隨著Pb脅迫濃度的升高，博落回葉片中的MDA含量持續(xù)增加。在Pb脅迫為2 000 mg/L時，MDA的積累量為45.1 μmol/g，較對照顯著升高了509%。說明Pb脅迫對博落回細(xì)胞生物膜產(chǎn)生了毒害作用，膜脂過氧化嚴(yán)重。葉片中的可溶性蛋白含量呈先增加后降低的趨勢，在Pb脅迫為500 mg/L時達(dá)到最大，較對照顯著(P＜0.05)升高了26.8%。Pb脅迫高于500 mg/L時，可溶性蛋白的含量急劇減少。

由圖2可知：隨著Pb脅迫濃度的升高，三種抗氧化酶的活性均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。當(dāng)脅迫濃度為500 mg/L時，SOD和CAT的活性達(dá)到最大值，分別較對照顯著(P＜0.05)升高了55.9%和35.7%。而濃度高于500 mg/L時，SOD和CAT活性開始降低。Pb濃度為800 mg/L時，POD的活性達(dá)到最大值，較對照顯著(P＜0.05)升高了19.7%。濃度高于800 mg/L時，POD活性開始降低。在Pb脅迫達(dá)到2 000 mg/L時，SOD、CAT和POD活性較對照分別降低了32.1%、19.4%和32.7%。說明低濃度的脅迫促進抗氧化酶的活性，清除體內(nèi)多余的活性氧自由基（ROS），高濃度的脅迫抑制抗氧化酶的活性，過量的ROS在植物體內(nèi)累積。

2.4 Pb在博落回不同部位的亞細(xì)胞分布

由圖3可知：不同Pb濃度脅迫處理下，Pb在博落回根部的分布均表現(xiàn)為F1（細(xì)胞壁組分）＞F3（可溶性組分）＞F2（細(xì)胞器組分）的趨勢，Pb主要分布在根部細(xì)胞的細(xì)胞壁組分（53%～83%），其次是可溶性組分（9%～33%），在細(xì)胞器組分（8%～14%）中占比最少。而在地上部，隨著脅迫濃度的升高，Pb主要的分布從細(xì)胞壁組分變?yōu)榭扇苄越M分。當(dāng)Pb的脅迫濃度大于500 mg/L時，Pb在博落回根莖葉細(xì)胞中細(xì)胞器組分的占比均有增加，說明當(dāng)脅迫濃度大于500 mg/L時，Pb進入到細(xì)胞內(nèi)部，使得細(xì)胞器組分中Pb含量的增加。

2.5 Pb在博落回不同部位的化學(xué)形態(tài)分布

由圖4可知：不同Pb濃度脅迫處理下，Pb在博落回的根部以鹽酸提取態(tài)（29%～67%）為主要化學(xué)形態(tài)，其次是醋酸提取態(tài)（10%～32%）和氯化鈉提取態(tài)（7%～20%）。而在博落回的地上部，Pb以去離子水提取態(tài)（11%～80%）為最主要的化學(xué)形態(tài)。隨著Pb脅迫濃度的升高，各組織中Pb的乙醇提取態(tài)和去離子水提取態(tài)的總占比顯著增加，特別是在地上部，莖中Pb的去離子水提取態(tài)的占比從11%增至最高為67%，葉中去離子水提取態(tài)的占比從39%增至最高為80%。而Pb的鹽酸提取態(tài)含量則在博落回各組織中均顯著下降，在根、莖、葉中的占比分別從67%、53%和49%降至最低為29%、10%和6%。

2.6 博落回不同組織的微觀結(jié)構(gòu)響應(yīng)

采用TEM技術(shù)比較分析了對照組CK分別和低濃度Pb脅迫（500 mg/L）、中濃度Pb脅迫（1 000 mg/L）、高濃度Pb脅迫（2 000 mg/L）處理下博落回各組織的微觀結(jié)構(gòu)變化（圖5）。結(jié)果顯示，對照組的博落回根（圖5-A）、莖（圖5-B）、葉（圖5-C）細(xì)胞整體結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞器未見受損，葉片細(xì)胞葉綠體結(jié)構(gòu)完整，片層結(jié)構(gòu)均勻有序排列；低濃度（圖5-D、5-E、5-F）與中濃度（圖5-G、5-H、5-I）處理時，博落回各組織細(xì)胞出現(xiàn)一定損傷，細(xì)胞壁出現(xiàn)裂痕，細(xì)胞壁與細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)區(qū)別于大顆粒物質(zhì)淀粉粒（SG）的細(xì)小黑色顆粒，可能為重金屬顆粒的沉淀[18]。在濃度達(dá)到2 000 mg/L時，博落回根部細(xì)胞（圖5-J）細(xì)胞壁扭曲變形，液泡失水導(dǎo)致原生質(zhì)層與細(xì)胞壁分離，產(chǎn)生質(zhì)壁分離現(xiàn)象；葉片細(xì)胞（圖5-L）液泡失水，葉綠體腫脹且片層結(jié)構(gòu)不均勻；各組織細(xì)胞的細(xì)胞壁與細(xì)胞內(nèi)部均有大量細(xì)小的黑色顆粒物。

2.7 博落回不同組織官能團組成響應(yīng)

采用FTIR技術(shù)比較分析了對照組CK、低濃度Pb脅迫（500 mg/L）和高濃度Pb脅迫（2 000 mg/L）下博落回根（圖6-A）、莖（圖6-B）、葉（圖6-C）官能團組成的變化（圖6）。3 340 cm-1處附近的吸收峰是分子間氫鍵-OH自由羥基的伸縮振動峰，主要來自纖維素和多糖等碳水化合物[19]。該處吸收峰強度隨Pb濃度的升高而增強。這說明植物促進了碳水化合物的分泌，隨著Pb濃度的升高，博落回細(xì)胞壁中的羥基結(jié)合Pb離子形成穩(wěn)定的化合物，而高濃度的Pb脅迫導(dǎo)致吸收峰強度顯著增強可能是由于高濃度Pb脅迫破壞了細(xì)胞壁中羥基結(jié)合Pb離子的機制，導(dǎo)致其大量累積。2 930 cm-1處附近的吸收峰是由脂碳鏈(-CH3, =CH2, =CH-)中的飽和C-H鍵與羧酸O-H鍵伸縮振動峰的疊加，主要來自細(xì)胞壁中的蛋白質(zhì)和果膠等組織成份[20]。博落回的根與葉在此處吸收峰強度隨Pb濃度的升高而增強。這是由于植物的耐性機制，根葉處分泌有機酸以螯合Pb離子，隨著Pb脅迫濃度增強，Pb離子對細(xì)胞壁的傷害加強，導(dǎo)致其羧酸螯合力變?nèi)酰鹞辗鍙姸鹊脑鰪姟? 650 cm-1處附近的吸收峰來源于C=O的伸縮振動，主要來自蛋白質(zhì)酰胺Ⅰ帶[21]。博落回根和葉在此處的吸收峰強度隨著Pb濃度的升高而增強，這可能是不斷增加的Pb離子增加了根葉部富脯氨酸和富甘氨酸蛋白的含量，這類蛋白可能具有緩解重金屬對植物毒害的作用[22]。1 050 cm-1處附近的吸收峰來源于C-O基團的伸縮振動，主要來自于醇、醚基、酯基或酚等碳水化合物。高濃度的Pb濃度下，博落回的根和葉細(xì)胞在此處吸收峰強度顯著大于其他兩組。這是由于此處吸收峰與細(xì)胞膜的膜脂過氧化程度相關(guān)，Pb脅迫造成脂肪族酮類化合物過氧化產(chǎn)物累積[23]，這與前文MDA的研究相對應(yīng)。

3 討論

3.1 博落回對Pb的耐性與富集能力

本研究證明，博落回對Pb具有良好的耐性，可以在不同的Pb濃度污染環(huán)境中生長。隨著脅迫濃度的升高，博落回的生長參數(shù)均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。這與多種植物受到Pb脅迫時的反應(yīng)相似，包括紫花香薷（Elsholfizia argyiLevl.）[24]、東南景天（Sedum alfrediiHance）[25]等。本研究中博落回對Pb的耐受能力為500 mg/L，當(dāng)Pb濃度升高時，博落回的株高、生物量、根長均受到抑制。博落回各組織中Pb的富集量隨著濃度的升高而增加，表現(xiàn)為根＞莖＞葉，說明博落回對Pb具有富集作用，且根部是最主要的富集場所，這有利于植物根系對Pb的固定作用，限制Pb在土壤和植株體內(nèi)的遷移，加強博落回的植物穩(wěn)定化能力。但隨著濃度的升高，富集系數(shù)和轉(zhuǎn)運系數(shù)降低，說明高濃度的Pb脅迫會抑制博落回對Pb的富集和轉(zhuǎn)運。其耐性指數(shù)屬于高耐性植物的水平，說明博落回具有很強的適應(yīng)Pb污染的能力。

3.2 博落回對Pb的生理生化響應(yīng)

葉綠素的含量可以反映植物的光合能力[26]。在本試驗中，葉綠素的含量先增后降。葉綠素含量的降低可能是由于高濃度的Pb離子與葉綠體中的蛋白質(zhì)巰基結(jié)合所致[27]。也可能是ROS破壞葉綠體的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致葉綠素合成受損[28]。MDA是植物在逆境和衰老過程中膜脂過氧化的終產(chǎn)物，通常用來反映生物膜的損傷程度，可溶性蛋白作為細(xì)胞膜滲透性保護物質(zhì)，可反映植物在遭受Pb脅迫時對外界適應(yīng)能力的大小[26]。隨著脅迫濃度的升高，植物體內(nèi)累積的MDA含量不斷增加，可溶性蛋白含量呈現(xiàn)先增后減的趨勢。說明Pb濃度在大于500 mg/L時會使細(xì)胞膜喪失原有的結(jié)構(gòu)與功能，但在低濃度時，植物可通過自身生理響應(yīng)，增加可溶性蛋白的含量，調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓，提高細(xì)胞的保水能力，從而對生物膜起到保護作用。MDA與可溶性蛋白含量的變化與Zhang等[29]的研究結(jié)果類似。植物體內(nèi)抗氧化酶SOD、CAT和POD屬于植物的抗氧化防御系統(tǒng)[28]。隨著Pb濃度的升高， SOD、CAT和POD活性呈先升高后迅速降低的趨勢，表明在低濃度脅迫時，抗氧化系統(tǒng)能夠清除由Pb的毒害而產(chǎn)生的過量ROS，高濃度的Pb脅迫導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS超過了抗氧化酶能夠清理的限度，細(xì)胞受到損害，抗氧化酶活性、葉綠素和可溶性蛋白含量均顯著降低。Nie等[11]關(guān)于博落回對Cd的生理響應(yīng)研究也得出類似結(jié)論。因此，植物通過生理生化等響應(yīng)調(diào)節(jié)葉綠素、可溶性蛋白的含量和抗氧化酶的活性是博落回對Pb重要的耐受機理。

3.3 Pb在博落回不同部位的亞細(xì)胞與化學(xué)形態(tài)分布

Pb主要分布在博落回細(xì)胞的細(xì)胞壁和可溶性組分中。說明細(xì)胞壁固定與液泡區(qū)隔化是博落回對Pb的重要耐受與解毒機制，這與Wang等[30]和Zhang等[31]的研究結(jié)果一致。細(xì)胞壁被認(rèn)為是防止重金屬進入細(xì)胞的第一道屏障，植物通過細(xì)胞壁的固定作用，減少Pb向細(xì)胞內(nèi)部的遷移，從而保護細(xì)胞的結(jié)構(gòu)[32]。而隨著脅迫濃度的升高，Pb在細(xì)胞壁中的占比減少，在細(xì)胞器和可溶性組分中的占比增加。說明在高濃度脅迫下，Pb被更多的轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)部，對細(xì)胞產(chǎn)生較大的傷害。TEM圖片可以看出，低濃度時細(xì)胞內(nèi)的黑色顆粒主要存在于細(xì)胞壁之中，這些顆粒物可能是Pb的沉淀[18]，因此可以推測此時細(xì)胞壁的固定作用限制Pb在細(xì)胞內(nèi)的遷移且使其失活，而在中高濃度下，細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞器中也含有大量黑色Pb的顆粒，細(xì)胞依靠液泡的區(qū)隔化，通過螯合作用來降低Pb的有效性。

Pb的不同提取狀態(tài)決定了它們對植物的脅迫程度。乙醇和去離子水提取態(tài)的Pb具有最強的生物毒性和遷移活性，最容易對植物產(chǎn)生毒害。NaCl的提取態(tài)次之，HAc和HCl提取態(tài)的生物毒性和遷移活性最弱[33]。乙醇提取無機鉛（主要為硝酸鹽/亞硝酸鹽、氯化物）和氨基酚鉛，去離子水提取有機酸絡(luò)合物的水溶性鉛和Pb(H2PO4)2，NaCl溶液主要提取果膠和蛋白質(zhì)結(jié)合態(tài)鉛，HAc溶液用于提取不溶性磷酸鉛，包括PbHPO4、Pb3(PO4)2和其他鉛的磷酸鹽絡(luò)合物，HCl溶液主要用于提取草酸結(jié)合態(tài)的鉛[34]。在本試驗中，Pb在根部以鹽酸和醋酸提取態(tài)為主，其次是氯化鈉提取態(tài)；與小麥（Triticum aestivum L.）[35]的研究結(jié)果一致，且與Cd在欒樹（Koelreuteria paniculata Laxm.）[36]中的化學(xué)形態(tài)類似。這表明Pb與磷酸鹽配體、草酸鹽配體、蛋白以及果膠配體結(jié)合可減輕對博落回的毒害[30]。并且Pb在博落回根部以遷移活性弱的形態(tài)存在，有利于將Pb固定在地下部分，減少對植株的損害，而在地上部分，Pb轉(zhuǎn)化為遷移活性強的化學(xué)形態(tài)。隨著濃度的升高，乙醇和去離子水所提取到的Pb的占比增加，說明高濃度下，博落回固定Pb的能力下降，Pb在植物體內(nèi)的遷移和毒性增加。Pb在博落回體內(nèi)主要以低毒性與遷移性的形態(tài)存在也可能是博落回對Pb的重要耐性機理。

3.4 Pb對博落回微觀結(jié)構(gòu)與官能團的影響

TEM的結(jié)果表明，Pb對根部的破壞體現(xiàn)在損傷細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，使其扭曲變形，甚至破裂，導(dǎo)致失去其對細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)的保護和阻止重金屬進入的作用。Pb對莖的主要破壞體現(xiàn)在細(xì)胞質(zhì)膜破裂，細(xì)胞失水導(dǎo)致質(zhì)壁分離，從而阻礙營養(yǎng)物質(zhì)和水分的運輸。Pb對葉的主要破壞體現(xiàn)在扭曲細(xì)胞結(jié)構(gòu)，破壞葉綠體的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其功能受損[32]。FTIR的結(jié)果表明，博落回在受到Pb脅迫時，細(xì)胞壁內(nèi)羥基和羧基等基團含量增加，這些基團可以提供Pb結(jié)合位點，提高細(xì)胞壁對Pb的吸附固定能力[37]。羥基、羧基等主要基團組成的細(xì)胞壁多糖，能與金屬陽離子結(jié)合，生成穩(wěn)定化合物來降低Pb對博落回的毒性[38]，細(xì)胞內(nèi)不斷分泌的有機酸可以螯合Pb離子[20]。同時，富脯氨酸和富甘氨酸蛋白等的含量增加，這些誘導(dǎo)蛋白可能對博落回免受Pb的毒害起重要作用。而當(dāng)脅迫濃度達(dá)到2 000 mg/L時，博落回通過分泌羥基、有機酸等物質(zhì)結(jié)合Pb離子的耐性機制受到損害，這些物質(zhì)無法正常結(jié)合Pb離子，導(dǎo)致其在博落回體內(nèi)過量累積[32]。過量脂肪族酮類化合物過氧化產(chǎn)物在細(xì)胞中累積，加深膜脂過氧化程度[23]。

4 結(jié)論

1）博落回屬于Pb高耐性植物，低于500 mg/L的Pb脅迫濃度促進植株的株高、生物量和根系的生長，提高葉綠素、可溶性蛋白的含量及抗氧化酶的活性水平，從而維持細(xì)胞的正常代謝，保證植物的生長發(fā)育；高于此濃度會導(dǎo)致各項指標(biāo)明顯降低，抑制植物生長。

2）博落回對Pb的富集量隨脅迫濃度的升高而增大，但其富集與轉(zhuǎn)運能力會隨著脅迫濃度增大而減弱。根部的富集能力最強，這有利于通過Pb在博落回根部的積累、沉淀或根表吸收來加強環(huán)境中Pb的固化。

3）Pb主要以草酸鉛和磷酸鉛的形式存在于博落回根部。細(xì)胞壁與液泡對Pb的固定螯合作用是博落回抵御Pb的主要方式，在高濃度下，Pb向遷移與毒性高的有機鉛和無機鉛的形式轉(zhuǎn)化，在細(xì)胞器與細(xì)胞質(zhì)中的含量增加。

4）Pb脅迫會破壞細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致Pb進入到細(xì)胞內(nèi)部，破壞亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的功能。同時，Pb脅迫會提高博落回體內(nèi)-OH、-COOH等基團和有機酸、蛋白質(zhì)的含量，這些物質(zhì)可與Pb離子結(jié)合形成穩(wěn)定化合物，從而降低Pb對博落回的毒害作用。