王立彪 劉玉慧 相恒杰 黃文龍 陳文霞

河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 國(guó)家兒童區(qū)域醫(yī)療中心（河南鄭州 450000）

先天性甲狀腺功能減退癥（congenital hypothyroidism，CH）是新生兒和嬰兒常見(jiàn)的一種內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病，發(fā)病率約1/2000～1/4000，其中由甲狀腺球蛋白（thyroglobulin，TG）基因缺陷導(dǎo)致的CH患者較罕見(jiàn)，這類患者血清TG水平多降低或缺乏，但極少數(shù)患者TG水平升高。本文報(bào)告1個(gè)血清TG水平增高CH家系的臨床資料。

1 臨床資料

河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院收治的1例45日齡黃疸女?huà)搿；純合礕 3 P 2，孕38 周順產(chǎn)，出身體質(zhì)量2 800 g，生后Apgar評(píng)分1分鐘、5分鐘均為10分，臍帶、胎盤未見(jiàn)明顯異常?；純耗赣H孕期無(wú)高危因素，生后當(dāng)天即出院。患兒生后正常開(kāi)奶，奶量完成可。患兒生后3 天出現(xiàn)顏面皮膚黃染，具體膽紅素值不詳。家屬自行給予益生菌口服治療，黃疸逐漸加重。15 日齡時(shí)患兒仍全身皮膚黃疸，伴鞏膜稍黃染，至當(dāng)?shù)蒯t(yī)院經(jīng)皮測(cè)膽紅素為10.4 mg/dL，繼續(xù)口服益生菌治療。但黃疸消褪不理想，伴黃綠色糊狀便，3 天1 次。當(dāng)?shù)蒯t(yī)院查總膽紅素208.9 μmol/L，直接膽紅素12.4 μmol/L，白蛋白41.3 g/L，遂轉(zhuǎn)入院。入院體格檢查：神清，精神反應(yīng)可，無(wú)特殊面容，全身皮膚黏膜輕度黃染伴鞏膜稍黃染，心肺腹未見(jiàn)明顯異常，神經(jīng)系統(tǒng)無(wú)異常。入院實(shí)驗(yàn)室檢查：游離三碘甲腺原氨酸（FT3）2.95 pmol/L，游離甲狀腺素（FT4）0.01 pmol/L，促甲狀腺素（TSH）354.75 mIU/L，甲狀腺球蛋白（TG）377.68 ng/mL，抗甲狀腺過(guò)氧化物酶抗體（TPO-Ab）、抗甲狀腺球蛋白抗體（TG-Ab）、促甲狀腺受體抗體（TSHR-Ab）均無(wú)異常；血常規(guī)、C 反應(yīng)蛋白、降鈣素原（PCT）、腎功能、心肌酶、電解質(zhì)、優(yōu)生優(yōu)育十項(xiàng)（弓形蟲(chóng)、巨細(xì)胞病毒、風(fēng)疹病毒、單純皰疹病毒1型及單純皰疹病毒2型5種病原的IgG、IgM抗體）及EB病毒四項(xiàng)（EBV衣殼抗原IgG、EBV早期抗原IgG、EBV核抗原IgG、EBV 衣殼抗原IgM）等相關(guān)檢查未見(jiàn)明顯異常。甲狀腺超聲示甲狀腺形態(tài)正常，無(wú)結(jié)節(jié)、囊腫?；純涸\斷為CH。予左甲狀腺素鈉片替代治療3 個(gè)月后，患兒甲狀腺功能及甲狀腺球蛋白恢復(fù)正常（FT 3 6.32 pmol/L，F(xiàn)T4 14.82 pmol/L，TSH 0.65 mIU/L，TG 3.02 ng/mL）。家族中無(wú)甲狀腺相關(guān)疾病史，父母及哥哥均無(wú)異常（表1）。

因家屬要求明確CH 原因及預(yù)測(cè)是否需終身服藥，經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)以及家屬知情同意后，用EDTA 抗凝采血管采集患兒兄妹及其父母外周血，送至北京金準(zhǔn)基因科技有限責(zé)任公司進(jìn)行相關(guān)基因檢測(cè)。使用血液提取試劑盒（Blood DNA Kit V 2，CW 2553，康為世紀(jì)）提取基因組 DNA，并對(duì)基因組 DNA 進(jìn)行質(zhì)控。對(duì)DNA 樣本進(jìn)行超聲破碎、文庫(kù)構(gòu)建、雜交捕獲（SureSelect 雜交緩沖液體系，Agilent）及擴(kuò)增、純化，建立患兒的DNA目標(biāo)基因捕獲文庫(kù)。后使用 Qubit dsDNA HS Assay kit（Invitrogen,Q32851）對(duì)測(cè)序文庫(kù)的 DNA 樣本進(jìn)行定量。按照捕獲文庫(kù)DNA樣本濃度及測(cè)序深度要求，使用Illumina HiSeq X Ten 平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，平均測(cè)序深度為 100×，獲得fastq 格式的原始數(shù)據(jù)。使用Burrows-Wheeler Alignment（v0.7.15）工具將測(cè)序reads 比對(duì)到人類參考基因組（hg 19 版）。使用GATK（v 3.6）、CODEX、XHMM（v 1.0）、KSCNV（康旭開(kāi)發(fā)）等軟件檢測(cè)單核苷酸變異（SNV）、小的插入缺失變異（InDel）及可能存在的拷貝數(shù)變異（CNV）。參考1000 G（V 1，V 3）、dbSNP、ESP 6500、ExAC、RefSeq、Ensembl、UCSC 等公共數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)變異信息進(jìn)行注釋。使用 PolyPhen-2、SIFT 和 MutationTaster2等軟件對(duì)變異進(jìn)行蛋白功能損傷預(yù)測(cè)。參考 OMIM、HGMD、ClinVar 等數(shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)行疾病信息注釋。經(jīng) GERP++保守性分析和過(guò)濾，保留可能與疾病有關(guān)的變異。對(duì)各樣本位點(diǎn)進(jìn)行一代驗(yàn)證。在人類基因組數(shù)據(jù)庫(kù) GenBank 中獲得上述變異位點(diǎn)基因序列，在引物設(shè)計(jì)網(wǎng)站Primer Z（http://genepipe.ncgm.sinica.edu.tw/primerz/primerz 4 .do）設(shè)計(jì)引物并合成。對(duì)變異位點(diǎn)進(jìn)行PCR擴(kuò)增后行Sanger測(cè)序，將獲得序列與之前的序列進(jìn)行比對(duì)，排除二代測(cè)序中假陽(yáng)性位點(diǎn)。

基因檢測(cè)結(jié)果：在患兒TG 基因上發(fā)現(xiàn)2 個(gè)復(fù)合雜合變異，其中父源變異c.2149 C>T 導(dǎo)致編譯第717 號(hào)氨基酸精氨酸（R）的密碼子變?yōu)榻K止密碼子（p.R 717*），從而導(dǎo)致肽鏈合成提前終止。根據(jù)美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)遺傳變異分類標(biāo)準(zhǔn)與指南（ACMG）分類為疑似致病變異；母源變異c.5401+113 A>G 為剪切位點(diǎn)變異，可能影響mRNA剪接，ACMG分類為臨床意義未明變異?；純焊绺鐢y帶c.5401+113A>G單雜合變異，患者父母均為攜帶者，哥哥及父母的FT3、FT4、TSH、TG、TPO-Ab、TG-Ab、TSHR-Ab 檢查結(jié)果正常且并無(wú)甲狀腺功能減退相關(guān)癥狀。由于TG基因變異c.2149C>T及c.5401+113A>G在HGMD數(shù)據(jù)庫(kù)中未見(jiàn)報(bào)道，為新發(fā)現(xiàn)的TG基因變異位點(diǎn)（圖1、圖2）。

2 討論

CH 是新生兒和嬰兒中常見(jiàn)的一種內(nèi)分泌疾病，為常染色體隱性遺傳，發(fā)病率約1/4000～1/2000，其中85%是由于甲狀腺分化、遷移或生長(zhǎng)異常（甲狀腺發(fā)育不全）和促甲狀腺激素抵抗引起，15%是由于甲狀腺激素合成過(guò)程出現(xiàn)缺陷導(dǎo)致激素生成異常引起[1]。本例患兒的父母及哥哥均攜帶1個(gè)TG變異位點(diǎn)，無(wú)臨床癥狀；患兒則為復(fù)合雜合變異，出現(xiàn)明顯的甲狀腺功能減退，符合常染色體隱性遺傳方式。

表1 患兒家系臨床表型

圖1 TG 基因c.2149C ＞T 測(cè)序圖

圖2 TG 基因c.5401+113A ＞G 測(cè)序圖

TG是一種相對(duì)分子質(zhì)量為660 000的同型二聚體糖蛋白，僅在甲狀腺中合成，是甲狀腺激素生物合成的高度專門化基質(zhì)，在甲狀腺激素合成過(guò)程中TG 不僅為T3、T4合成提供骨架，同時(shí)可起到儲(chǔ)存碘和甲狀腺激素的作用[2]。TG 基因位于人類8 q 24.2-8 q 24.3染色體上，長(zhǎng)度約270 kb，包含48個(gè)外顯子，其結(jié)構(gòu)異常可能導(dǎo)致TG 的合成或功能異常[3-5]。自1991 年首次報(bào)道TG基因變異可引起CH以來(lái)[6]，目前已發(fā)現(xiàn)100多種不同的TG基因變異類型[2,7]，但TG基因變異導(dǎo)致的CH仍較為罕見(jiàn)，發(fā)病率約為1/100 000[8]。

大多數(shù)由TG 基因變異而導(dǎo)致的CH 患者在左甲狀腺素替代治療前，不管是否存在甲狀腺腫大，都顯示出血清TG 水平降低或缺乏，這也是診斷TG基因缺陷的關(guān)鍵因素[7,9]。本例患兒出現(xiàn)極其罕見(jiàn)的臨床表型，血清TG 水平不僅沒(méi)有降低，反而升高。檢索文獻(xiàn)，除本例外，僅有4 例TG 升高的CH 患者的報(bào)道[10-12]。約80%的TG單體一級(jí)結(jié)構(gòu)是三個(gè)連續(xù)的半胱氨酸（cysteine，Cys）重復(fù)結(jié)構(gòu)域（重復(fù)結(jié)構(gòu)域 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ），剩余的20%（構(gòu)成分子的羧基末端結(jié)構(gòu)域）與乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterase，AChE）具有驚人的同源性，并且可能充當(dāng)分子伴侶的作用。通常情況下，TG 基因變異可引起其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物不能正確的折疊，導(dǎo)致TG 蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的滯留，不能分泌到血液中，導(dǎo)致CH，此類患者多伴有甲狀腺腫和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)累積病[11,13]。未正確折疊的TG蛋白不能在細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸，然后被伴侶蛋白通過(guò)未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response，UPR）的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路重新折疊或降解[14]。文獻(xiàn)報(bào)道的4 例TG 增高病例中，變異所致氨基酸改變p.G 2322 S 和p.A 2215 D 位于膽堿酯酶樣（cholinesterase-like，ChEL）結(jié)構(gòu)域中，p.C1995S位于Cys重復(fù)結(jié)構(gòu)域Ⅲ中，均可引起TG錯(cuò)誤折疊，并且在p.C 1995 S 伴TG 增高的病例中觀察到缺乏伴侶蛋白激活，因而導(dǎo)致不完全的UPR 使錯(cuò)誤折疊的TG釋放入血，導(dǎo)致血清TG升高[10-12]。由此推測(cè)c.2149 C>T及c.5401+113 A>G 基因變異，可能引起TG 基因類似結(jié)構(gòu)域改變，導(dǎo)致血清TG升高。此外CH患者甲狀腺功能一般多表現(xiàn)為TSH增高，而既往4例病例中僅p.G2322S氨基酸改變者出現(xiàn)TSH增高，剩余3例TSH均未見(jiàn)明顯異常。其中p.A 2215 D 氨基酸改變者為1 例男性患者，10 歲時(shí)因甲狀腺腫大行部分甲狀腺切除術(shù)，34 歲時(shí)再次因甲狀腺腫大行甲狀腺全切術(shù)，臨床病理表現(xiàn)為濾泡增生，甲狀腺碘攝取率明顯升高，且經(jīng)重組人TSH 刺激后血清TG 無(wú)明顯升高；而p.C 1995 S 氨基酸改變者為2 例腺瘤性甲狀腺腫的成年姐妹，甲狀腺碘攝取率也明顯升高。這3 例患者均考慮存在TG基因異常導(dǎo)致的CH，其中p.A2215D變異者變異的TG分子能夠部分從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)逃逸并合成少量的甲狀腺激素，這或許可以部分解釋為何攜帶TG基因變異的部分CH患者甲狀腺功能仍為正常。

總之，發(fā)現(xiàn)TG 基因的兩個(gè)新的變異，該復(fù)合雜合變異導(dǎo)致CH 患者血清TG 水平升高且不伴有甲狀腺腫大，其原因可能與TG 折疊錯(cuò)誤或不完全的UPR有關(guān)。