羅曦，李天嬌，2，3，包永睿，2，3，王帥，2，3，孟憲生，2，3*（.遼寧中醫(yī)藥大學藥學院，遼寧 大連 6600；2.遼寧省中藥多維分析專業(yè)技術創(chuàng)新中心，遼寧 大連 6600；3.遼寧省現(xiàn)代中藥研究工程實驗室，遼寧 大連 6600）

枳殼為蕓香科植物酸橙Citrus aurantiumL.及其栽培變種的干燥未成熟果實，歸脾、胃經，具有理氣寬中、行滯消脹的功效[1]，最早記載于南北朝《雷公炮炙論》[2]，主要含有黃酮類、揮發(fā)油類、香豆素類和生物堿類等化學成分[3]，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等多種藥理活性[4]。結腸癌是消化道腫瘤中常見的惡性腫瘤，中醫(yī)理論認為，“邪之所湊，其氣必虛”，脾胃虛弱是結腸癌的病理基礎，西醫(yī)治療方法手術和化療可能會進一步損傷脾胃功能，故中醫(yī)藥治療結腸癌以健脾理氣為主要方法[5]。據(jù)文獻報道，中醫(yī)臨床治療結腸癌的處方中經常出現(xiàn)理氣藥枳殼[6-8]，但其抗結腸腫瘤方面的相關研究較少。本實驗基于人結腸癌細胞HT-29 體外藥效實驗，通過正交實驗設計，以HT-29 細胞抑制率為指標，對枳殼治療結腸腫瘤藥效物質組分的提取工藝進行篩選，并結合層次分析法，優(yōu)選可代替藥效指標綜合評分的權重系數(shù)，以期為枳殼合理利用、藥效物質基礎及作用機制研究提供前期基礎。

1 材料

1.1 儀器與試藥

UV-1750 型紫外分光光度計（北京瑞利分析儀器公司）；HSS 型電子恒溫水浴鍋（上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠）；YJ-200A 型高速中藥粉碎機（億健品牌）；JE1002 電子天平（上海浦春計量儀器有限公司）；Mettler Toledo ME55 分析天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司）；CO2培養(yǎng)箱（德國NUAIRE 公司）；倒置顯微鏡（德國麥克奧迪公司）；酶標儀（美國Molecular Drvices 公司）；枳殼藥材（亳州市康美中藥有限公司，批號：20200716，經遼寧中醫(yī)藥大學許亮教授鑒定為蕓香科植物酸橙Citrus aurantiumL.及其栽培變種的干燥未成熟果實）；蘆丁對照品（中國食品藥品檢定研究所，批號：100080-201418，供含量測定用）；無水乙醇（分析純，天津市富宇精細化工有限公司）；胎牛血清、McCoy’s 5A 培養(yǎng)基、胰蛋白酶（美國GIBCO 公司）；青霉素/鏈霉素溶液、CCK-8 增強型溶液（Meilunbio 公司）。

1.2 細胞瘤株

人結腸癌細胞HT-29（中國科學院上海生命科學研究院細胞庫）。

2 方法與結果

2.1 枳殼黃酮含量測定

2.1.1 對照品溶液的制備 取蘆丁對照品適量，精密稱定，用無水乙醇溶解稀釋成質量濃度為0.15 mg·mL－1的對照品溶液，備用。

2.1.2 檢測波長的選擇 采用Al（NO3）3-NaNO2-NaOH 比色法[9]，精密吸取蘆丁對照品溶液2 mL置于10 mL 量瓶中，依次加入5%亞硝酸鈉溶液0.50 mL，振搖后靜置6 min，加入10%硝酸鋁溶液0.30 mL，搖勻，靜置6 min，再加入4%氫氧化鈉溶液2 mL，加30%乙醇至刻度，混合搖勻，靜置15 min。不加蘆丁對照品按照以上方法制備空白對照，在400 ～750 nm 波長下進行掃描，結果對照品溶液在510 nm 處有最大吸收，故確定510 nm 為檢測波長。

2.1.3 標準曲線的建立 精密吸取0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL 蘆丁對照品溶液，置于10 mL量瓶中，依次加入5%亞硝酸鈉溶液0.50 mL，振搖后靜置6 min，加入10%硝酸鋁溶液0.30 mL，搖勻，靜置6 min，再加入4% 氫氧化鈉溶液2 mL，加30% 乙醇至刻度，混合搖勻，靜置15 min。在 510 nm 波長處測定吸光度，以蘆丁含量為橫坐標（X），吸光度為縱坐標（A）進行回歸，得方程為A＝0.0011X－0.0069（r＝0.9996）。結果顯示，蘆丁在 0 ～600 μg·mL－1內與吸光度A呈現(xiàn)良好的線性關系。

2.2 HT-29 細胞培養(yǎng)及抑制率檢測

2.2.1 細胞培養(yǎng) 人結腸癌細胞HT-29，按貼壁細胞培養(yǎng)方法，接種于含體積分數(shù)為10%胎牛血清、1% 雙抗的McCoy’s 5A 培養(yǎng)基中，在溫度為 37 ℃、5% CO2、濕度為70%～80%的條件下常規(guī)培養(yǎng)。隔日換液、傳代，取對數(shù)生長期細胞做后續(xù)實驗。

2.2.2 CCK-8 法檢測細胞抑制率 取對數(shù)生長期的人結腸癌細胞HT-29，用含0.25% EDTA 的胰蛋白酶消化，以 7500 cell /孔的密度接種于96 孔板，設調零孔、空白孔和加藥實驗孔。于37℃、5% CO2、濕度為70%～80% 的條件培養(yǎng)24 h 后，加藥實驗組加入樣品溶液100 μL，空白對照組加入等體積培養(yǎng)液（每組5 個復孔），繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后，采用CCK-8 法，用酶標儀在450 nm 處掃描，測定吸光度（OD）。計算藥物對細胞的增殖抑制率，細胞抑制率＝（1－實驗組OD值/對照組OD值）×100%。

2.3 枳殼黃酮提取工藝考察

2.3.1 乙醇濃度單因素考察 對水、30%、50%、75%、95% 乙醇進行考察，結果黃酮含量分別為3.42%、4.01%、4.99%、5.39%、5.02%。表明75%乙醇對枳殼黃酮類成分的提取率最高，因此選用75%乙醇作為最佳提取溶劑。

2.3.2 正交設計 根據(jù)預實驗及參考文獻[10]，取枳殼適量，60℃下烘干后粉碎，精密稱取9 份過40目的枳殼藥材粉末，每份5 g，采用75%乙醇為提取溶劑進行提取，選擇溶劑用量（A）、提取時間（B）、提取溫度（C）作為影響因素，每個因素取3個水平，進行L9（34）正交實驗。因素水平見表1。精密稱取9 組正交實驗獲得的提取物粉末，配制成0.01 g（生藥）·mL－1濃度的含藥培養(yǎng)液，作用于HT-29 細胞，以細胞抑制率為指標，優(yōu)選提取工藝，正交結果見表2，方差分析見表3。

表1 因素水平Tab 1 Factor and level

表2 正交設計直觀分析Tab 2 Orthogonal design visual analysis

表3 方差分析Tab 3 Analysis of variance

以人結腸癌HT-29 細胞抑制率為指標，直觀分析及方差分析影響提取工藝的因素順序為A ＞B ＞C，其中溶劑用量（A）、提取時間（B）對細胞抑制率影響較大（P＜0.05），為主要因素；提取溫度（C）影響較小。由于提取時間（B）也是影響提取工藝的主要因素，故為驗證優(yōu)選提取時間的準確性，在其他提取條件均為最優(yōu)時，對其進行單因素考察。分別對2、2.5、3 h 進行單因素考察，發(fā)現(xiàn)細胞抑制率分別為 77.04%、79.17%、79.51%，為提高生產效率，確定提取時間為2.5 h。綜上所述，結合抑制率結果篩選出最佳提取條件為A2B2C2，即25 倍量75%乙醇，在75℃下提取2.5 h。

2.4 層次分析法對黃酮含量和出膏率權重系數(shù)的確定

以黃酮含量和出膏率為指標，評價枳殼治療結腸腫瘤藥效物質組分的提取工藝，建立評價目標模型，結果見圖1。

圖1 枳殼治療結腸腫瘤藥效物質組分提取工藝評價模型Fig 1 Evaluation model of extraction process of effective components from Fructus aurantii for colon tumor

通過比較同一層次目標（黃酮含量和出膏率）的相對重要程度，構成一系列兩兩比較矩陣。利用Analytic Hierarchy Process（AHP）軟件，計算權重系數(shù)隨機一致性比率CR（CR＝CI/RI），其可作為衡量所得權重系數(shù)是否合理的指標，得到9 組CR＝0.0000 ＜0.1，即認為矩陣具有滿意的一致性，表明9 組權重系數(shù)合理有效，可用于提取工藝優(yōu)選的綜合評分中，見表4。

表4 兩種指標在不同重要程度下的權重系數(shù)Tab 4 Weight coefficient of two indexes in diffrent importance degree

按照各指標不同的權重系數(shù)來計算綜合評分，作為提取工藝的評價指標，以“比較重要”為例，實驗設計和結果見表5 和表6 [綜合評分1 ＝（黃酮含量/最大黃酮含量）×0.8333 ＋（出膏率/最大出膏率）×0.1667；綜合評分2 ＝（黃酮含量/最大黃酮含量）×0.1667 ＋（出膏率/最大出膏率）×0.8333]。

以綜合評分1 為指標，直觀分析及方差分析影響提取工藝的因素順序為A ＞B ＞C，其中溶劑用量（A）影響最大（P＜0.05），為主要影響因素。提取時間（B）和提取溫度（C）無顯著影響，而且 B2 和B3，C2 和C3 結果相差不大，從提高生產效率和節(jié)約能源角度考慮，確定提取時間為2.5 h，提取溫度為75℃。

表5 正交實驗設計及直觀分析結果Tab 5 Orthogonal experiment design and visual analysis

表6 方差分析Tab 6 Analysis of variance

以綜合評分2 為指標，直觀分析及方差分析影響提取工藝的因素順序為 C ＞A ＞B，其中提取溫度（C）影響最大（P＜0.05），溶劑用量（A）和提取時間（B）差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。從提高生產效率和節(jié)約溶劑角度考慮，優(yōu)選出的工藝條件為A1B1C3，即20 倍量75%乙醇，在80℃下提取2 h。

當黃酮含量和出膏率的權重系數(shù)分別為0.8333、0.1667 時，以綜合評分1 與細胞抑制率為指標優(yōu)選的最佳提取條件一致，說明在此權重系數(shù)下，兩者的綜合評分可代替細胞抑制率，作為枳殼治療結腸腫瘤藥效物質組分提取工藝的考察指標。當權重系數(shù)為0.1667、0.8333 時，以綜合評分2 為指標優(yōu)選的最佳提取條件與以細胞抑制率為指標優(yōu)選出的提取工藝不一致。

同時，對其他權重系數(shù)計算綜合評分，進行正交實驗直觀分析和方差分析，得到黃酮含量和出膏率最佳的權重系數(shù)范圍分別為0.75 ～0.90、0.10 ～0.25。在此權重系數(shù)范圍內，其綜合評分可代替細胞抑制率，作為提取工藝的考察指標。

2.5 驗證實驗

平行稱取3 份等量藥材，按照優(yōu)選出的最佳提取工藝，即25 倍量 75% 乙醇，在75℃水浴條件下，回流提取 2.5 h，進行提取。黃酮含量分別為6.106%、6.127%、6.149%，出膏率分別為25.92%、25.99%、25.86%，細胞抑制率分別為73.92%、74.08%、74.15%，3 項指標的RSD分別為0.35%、0.25%、0.18%，說明優(yōu)選的工藝條件穩(wěn)定可行，且體外藥效穩(wěn)定。選取2 個權重系數(shù)范圍內外的數(shù)值，對其綜合評分與細胞抑制率進行Pearson 相關性分析[11-14]，確定權重系數(shù)范圍的準確性和合理性，結果見表7。

表7 權重系數(shù)范圍驗證結果Tab 7 Validation of weight coefficient range

根據(jù)前面得出的黃酮含量和出膏率最佳的權重系數(shù)范圍，通過Pearson 相關性分析可知，在確定的權重系數(shù)范圍內（組別1），綜合評分與細胞抑制率的相關系數(shù)較大；在權重系數(shù)范圍外（組別2），相關系數(shù)較小，說明黃酮含量和出膏率的權重系數(shù)范圍合理。

3 討論

枳殼為健脾理氣、寬腸行滯的常用藥，同時具有抗炎、抗氧化以及抗腫瘤等藥理作用，常被加入“健脾理氣法”治療結腸癌的中藥處方中使用。目前尚無其在抗結腸腫瘤藥效物質組分提取工藝方面的報道，因此本實驗對其進行研究，為開發(fā)以枳殼為原料的抗腫瘤新藥提供實驗依據(jù)和理論基礎。

中藥化學成分復雜，且各化學物質組之間相互影響，因此藥效物質組的含量與藥效之間不呈線性相關。若單以藥效物質組分的含量為提取工藝的考察指標，不能保證所選提取工藝的提取物達到最佳藥效；若單以細胞抑制率結果為評價指標，雖能保證藥效，但操作繁瑣費時。因此，本實驗針對中藥化學成分的特點，運用層次分析法[15-18]，將枳殼治療結腸腫瘤藥效物質組分提取工藝的評價指標構成單層次、兩指標體系，在主觀判斷的基礎上進一步處理，使其在權重系數(shù)的賦予上更加科學、合理，同時建立黃酮含量、出膏率與藥效的關聯(lián)，即通過細胞抑制率結果為指標的正交實驗結果，篩選出代替細胞抑制率的黃酮含量和出膏率綜合指標的權重系數(shù)及其范圍。本實驗篩選出了影響提取工藝的主要和次要因素，避免了賦予權重系數(shù)的偶然性，不但能確保提取物的藥效，且避免了復雜的操作，使工藝更加合理可行。通過Pearson 相關性分析可知，在權重系數(shù)范圍內，其綜合評分可代替藥效指標，作為其抗腫瘤藥效物質組分提取工藝的評價指標。

本實驗以綜合評價指標代替藥效，對枳殼治療結腸腫瘤的藥效物質組分提取工藝進行研究可為其合理開發(fā)和利用奠定基礎，為其治療結腸腫瘤的藥效物質基礎及作用機制研究提供理論依據(jù)。