桂孟玹，黃彬，王瑞國，林久茂*（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福州 3501；.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福州 3501；3.福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福州 3501；4.中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)福建省高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（福建中醫(yī)藥大學(xué)），福州 3501）

結(jié)直腸癌（CRC）是人類最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率越來越高，目前已成為世界第三大高發(fā)癌癥[1]。CRC 的發(fā)生和炎癥密切相關(guān)，促炎細(xì)胞因子的過度分泌可以促進(jìn)腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移[2-3]。近年來研究表明，白介素 6 （interlenkin-6，IL-6）及其受體的信號通路參與了CRC 的發(fā)生、發(fā) 展[4-5]。IL-6 與IL-6 受 體（IL-6R）的 結(jié)合會啟動細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)級聯(lián)反應(yīng)，從而激活轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）增強(qiáng)局部炎癥環(huán)境，STAT3 持續(xù)的激活會引起腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡失衡，進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[6]。

當(dāng)前CRC 的治療主要通過手術(shù)切除并配合化療藥物以提高生存率，并降低術(shù)后的腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，但由于化療藥物對正常細(xì)胞亦具有殺傷作用，容易引起嚴(yán)重的毒副反應(yīng)，導(dǎo)致患者的生存質(zhì)量下降[7-8]。目前，已有研究報道使用中草藥輔助抗腫瘤，并取得了不錯的效果[9-10]。白花蛇舌草是目前已有應(yīng)用于輔助治療CRC 的中草藥，其主要藥效成分齊墩果酸（oleanolic acid，OA）是一種五環(huán)三萜類化合物，具有顯著的抗炎、抗腫瘤、護(hù)腎、保肝等作用[11-14]。近年來，基于具有明確藥效的中草藥，從其中發(fā)掘中草藥藥效活性成分并開發(fā)成單體藥物是當(dāng)前中西醫(yī)結(jié)合臨床治療重大疾病的熱點(diǎn)。有研究表明，OA 對多種惡性腫瘤細(xì)胞具有抑制增殖的作用，但其藥效功能研究尚未完全闡明，藥效作用機(jī)制有待進(jìn)一步明確[15]。因此，本研究以人結(jié)腸癌HT-29 細(xì)胞為對象，評價OA 對HT-29 細(xì)胞的增殖和凋亡的影響，并通過研究OA 對IL-6/STAT3 信號通路的調(diào)控作用，為該化合物防治結(jié)腸癌提供理論研究基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 試藥

齊墩果酸（OA，批號：O5504）、白介素 6（IL-6，批號：I1395）（美國Sigma 公司）；人結(jié)腸癌HT-29 細(xì)胞（中國科學(xué)院細(xì)胞庫）。DMEM 培養(yǎng)基（批號：SH30022.01）、胎牛血清（FBS，批號：10099-141）、青霉素-鏈霉素（批號：15070063）、胰蛋白酶-EDTA（批號：25200-056）、TRIzol 試劑（批號：12183555）、Caspase-3 活力試劑盒（批號：037-100）（美國Invitgen 公司）；抗Bcl-2、Bax、CyclinD1、CDK4、p15、p-STAT3、STAT3、β-actin 單克隆抗體及辣根過氧化物酶（HRP）偶聯(lián)的二抗（Cell Signal Technology 公司，批號分別為：15071、89477、55506、12790、36303、9145、9139、3700、7074）。BCA 蛋白檢測試劑盒（批號：kgabca）、DAPI 染色試劑盒（批號：kga215）（南京凱基生物科技有限公司）。

1.2 儀器

酶標(biāo)儀（Infinite M200， TECAN，瑞士）， 倒置顯微鏡（Leica DMIL LED，Solms，德國），熒光顯微鏡（Leica DMI4000B，Solms， 德國）， 凝膠分析系統(tǒng)（Model Gel Doc 2000，Bio-Rad Laboratory，美國）。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞在含有10%FBS、100 U·mL－1青霉素和100 μg·mL－1鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基中，37°C，5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)，以貼壁單層形式生長。

2.2 實(shí)驗(yàn)分組設(shè)置

實(shí)驗(yàn)設(shè)置空白對照組、IL-6（10 ng·mL－1）處理組和不同濃度OA（40、80、120 μmol·L－1）＋I(xiàn)L-6（10 ng·mL－1）組。

2.3 MTT 法檢測細(xì)胞增殖情況

當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到70%～80%后，使用胰酶消化細(xì)胞，在3000 r·min—1，離心5 min 后，棄去上清，用DMEM 完全培養(yǎng)基重新懸浮，并稀釋成1×105個·mL－1。以100 μL 每孔接種到96孔板中，在37°C 孵育24 h 后，按照分組加入OA和/或IL-6 處理24 h，然后每孔加入100 μL MTT（0.5 mg·mL－1），繼續(xù)孵育4 h，加入100 μL 二甲基亞砜溶解紫色甲瓚晶體。用酶標(biāo)儀于570 nm處檢測吸光度（A）值，計算細(xì)胞活力。細(xì)胞活力（%）＝實(shí)驗(yàn)組A值/對照組A值×100%。

2.4 倒置顯微鏡觀察細(xì)胞密度變化

HT-29 細(xì)胞以2.5×105個·mL－1的密度，每孔2 mL 的體積接種于6 孔板中。按照分組加入OA 和/或IL-6 處理細(xì)胞24 h，用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，觀察細(xì)胞密度變化。

2.5 DAPI 染色和Annexin V/PI 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡

將HT-29 細(xì)胞以1×105個·mL－1的密度接種于12 孔培養(yǎng)板中，每孔1 mL 細(xì)胞懸液，按照分組加入OA 和/或IL-6 處理細(xì)胞24 h 后，用無菌PBS 洗滌細(xì)胞，4%多聚甲醛固定10 min，室溫下用DAPI（4 μg·mL－1）染色10 min，再用無菌PBS 清洗，在熒光顯微鏡下觀察。

為了驗(yàn)證OA 是否可以誘導(dǎo)HT-29 細(xì)胞凋亡，將2.5×105個·mL－1的HT-29 細(xì)胞 以2 mL 的 細(xì)胞懸液體積接種于6 孔板中，按上述方法同樣處理HT-29細(xì)胞后，根據(jù)廠家說明書，采用FACSCalibur細(xì)胞分析儀（BD Biosciences）和Annexin V-/PI 試劑盒進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

2.6 Caspase-3 活力測定

根據(jù)Caspase-3 活力測定試劑盒說明書，通過比色分析來測定Caspase-3 的活性。按照分組加入OA 和/或IL-6 處理HT-29 細(xì)胞24 h 后，用試劑盒提供的裂解緩沖液在冰上裂解HT-29 細(xì)胞30 min。裂解細(xì)胞在16 000×g 下離心10 min，用BCA 法測定上清液中的蛋白質(zhì)濃度。隨后，將100 μg 蛋白與50 μL Caspase-3 的特定底物在37°C 的避光條件下孵育2 h，使用酶標(biāo)儀在405 nm 波長處測定吸光度，計算Caspase-3 活力。

2.7 細(xì)胞周期分析

將2 mL 的2.5×105個·mL－1HT-29 細(xì) 胞接種于6 孔板中，按照分組加入OA 和/或IL-6處理HT-29 細(xì)胞24 h 后，收集細(xì)胞，并調(diào)整細(xì)胞濃度至2×105個·mL－1，碘化丙啶（PI）細(xì)胞周期分析試劑盒染色后，用熒光激活細(xì)胞分選法檢測細(xì)胞周期進(jìn)程。將細(xì)胞置于70%乙醇中，于4℃條件下固定過夜，然后用預(yù)冷的PBS 洗滌兩次，再用核糖核酸酶（8 μg·mL－1）和磷脂酰肌醇（10 μg·mL－1）孵育30 min。通過流式細(xì)胞儀的FL1 通道檢測熒光信號，并使用ModFit LT 軟 件（版 本3.0；Verity Software House，Inc.，Topsham，ME，USA）分析細(xì)胞周期各時相中DNA 的比例。

2.8 集落形成實(shí)驗(yàn)

將處于指數(shù)生長期培養(yǎng)的HT-29 細(xì)胞以1×105個·mL－1的密度接種到12 孔培養(yǎng)板中，按照分組加入OA 和/或IL-6 處理HT-29 細(xì)胞24 h，隨后收集細(xì)胞以1×103個·mL－1，每孔2 mL的細(xì)胞懸液接種到6 孔板中。在37°C、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育8 d 后，將形成的細(xì)胞集落固定在4%多聚甲醛中10 min，結(jié)晶紫染色計數(shù)。

2.9 Western blot 分析

將2×105個·mL－1的HT-29 細(xì)胞接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，按照分組加入OA 和/或IL-6 處理HT-29 細(xì)胞24 h 后，收集細(xì)胞樣本，用含有不同蛋白抑制劑的RIPA 裂解緩沖液裂解細(xì)胞，用BCA 法測定總蛋白濃度，從每個細(xì)胞裂解液中提取等量的蛋白質(zhì)，經(jīng)SDS-PAGE 電泳后轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，用5%脫脂奶粉封閉2 h，并與相應(yīng)的抗STAT3、p-stat3、CyclinD1、CDK4、Bcl2、BAX 或β-actin（稀釋倍數(shù)，1∶1000）一抗在4°C 下孵育過夜，用適當(dāng)?shù)睦备^氧化物酶偶聯(lián)二抗結(jié)合ECL 化學(xué)發(fā)光試劑，對不同指標(biāo)進(jìn)行檢測，并做圖像分析。

2.10 反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）分析

將2×105個HT-29 細(xì)胞接種于含有2 mL 完全DMEM 培養(yǎng)基的6 孔板中，按照分組加入OA和/或IL-6 處理HT-29 細(xì)胞24 h 后，用TRIzol 試劑提取總RNA，用SuperScript 反轉(zhuǎn)錄酶（Promega Corporation）反轉(zhuǎn)錄1 μg 的RNA。PCR 法檢測Bcl-2、Bax、CyclinD1、CDK4、p15 mRNA 的表達(dá)，以GAPDH 作為內(nèi)參。通過凝膠電泳（1.5%瓊脂糖凝膠）分析樣品，并使用凝膠分析系統(tǒng)分析DNA條帶。

2.11 統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 24.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行處理。結(jié)果用±s表示；先進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)，滿足條件者，兩組比較采用t檢驗(yàn)；未滿足條件者，兩組比較用 Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 OA 對HT-29 細(xì)胞生長有抑制作用

MTT 比色法檢測OA 對IL-6 刺激下HT-29 細(xì)胞活力的影響。如圖1 所示，與對照組相比，IL-6刺激使HT-29 細(xì)胞的存活率明顯提高，其活力值為145.49% （P＜0.05）。40、80、120 μmol·L－1的OA 干預(yù)24 h 后，IL-6 刺激的細(xì)胞存活率下降，具有明顯的濃度依賴性。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這些結(jié)果，通過倒置顯微鏡觀察OA 對HT-29 細(xì)胞密度的影響。如圖2 所示，OA 處理可劑量依賴性地降低HT-29 細(xì)胞的密度。綜上所述，OA 可抑制IL-6刺激后HT-29 細(xì)胞的生長。

圖1 OA 對HT-29 細(xì)胞增殖能力的影響Fig 1 Effect of OA on the proliferation of HT-29 cells

圖2 OA 對HT-29 細(xì)胞密度的影響（200×）Fig 2 Effect of OA on HT-29 cell density （200×）

3.2 OA 誘導(dǎo)HT-29 細(xì)胞凋亡

圖3 結(jié)果表明，與空白對照組相比，10 ng·mL－1IL-6 刺激后凋亡細(xì)胞比例無明顯改變（P＞0.05）。相反，OA 以劑量依賴的方式顯著增加早期和晚期凋亡細(xì)胞的百分比，與單獨(dú)用IL-6刺激的細(xì)胞相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。此外，DAPI 染色檢測了凋亡的HT-29 細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞質(zhì)凝聚和細(xì)胞核碎裂的程度。圖4 結(jié)果顯示，經(jīng)OA 處理的HT-29 細(xì)胞的細(xì)胞核染色較未經(jīng)OA 處理的HT-29 細(xì)胞染色強(qiáng)度更強(qiáng)，表明OA可促進(jìn)HT-29 細(xì)胞凋亡。

圖3 Annexin V/PI 流式細(xì)胞儀檢測OA 對HT-29 細(xì)胞凋亡的影響Fig 3 Annexin V/PI flow cytometry of OA on HT-29 cell apoptosis

圖4 DAPI 染色觀察OA 對HT-29 細(xì)胞凋亡的影響（200×）Fig 4 DAPI staining of OA on the apoptosis of HT-29 cells （200×）

3.3 OA 可誘導(dǎo)HT-29 細(xì)胞中Caspase-3 的活化

Caspase-3 的激活通過比色法進(jìn)行檢測。Caspases 是胞質(zhì)內(nèi)天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶，是細(xì)胞凋亡反應(yīng)中的關(guān)鍵蛋白。Caspases的激活對執(zhí)行凋亡功能非常重要。如圖5 所示，IL-6 可抑制Caspase-3 的活化。而OA 可顯著誘導(dǎo)HT-29 細(xì)胞Caspase-3 的活化，且呈劑量依賴性。與IL-6 刺激的HT-29 細(xì)胞相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

3.4 OA 阻斷HT-29 細(xì)胞G1/S 期進(jìn)程

圖5 OA 對HT-29 細(xì)胞Caspase-3 活力的影響Fig 5 Effect of OA on the Caspase-3 activity of HT-29 cells

在細(xì)胞周期中，G1期向S 期的轉(zhuǎn)換是細(xì)胞調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程從而調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖的兩個主要檢查點(diǎn)之一。因此，通過PI 染色和熒光激活細(xì)胞分選分析，研究了OA 對HT-29 細(xì)胞G1向S 期進(jìn)程的影響。如圖6 所示，未經(jīng)處理的對照組、IL-6刺激的HT-29 細(xì)胞和IL-6 刺激的HT-29 細(xì)胞經(jīng)不同濃度的OA（分別為40、80、120 μmol·L－1）處理后，S 期細(xì)胞比例分別為33.67%、34.81%、29.19%、26.31%和21.30%。此外，采用集落形成實(shí)驗(yàn)檢測了OA 對HT-29 細(xì)胞周期的影響。如圖7 所 示，40、80、120 μmol·L－1的OA 作 用24 h，可使IL-6 刺激的細(xì)胞集落形成率分別降低至79.68%、35.44%和23.00%（P＜0.05）。這些結(jié)果表明，OA 通過阻斷細(xì)胞周期從G1期到S 期的進(jìn)程來抑制HT-29 細(xì)胞的增殖。

圖6 OA 對HT-29 細(xì)胞周期的影響Fig 6 Effect of OA on the cell cycle of HT-29

3.5 OA 抑制IL-6 介導(dǎo)的HT-29 細(xì)胞STAT3 活化

許多人類癌細(xì)胞株，包括HT-29，在體外并不組成性地表達(dá)p-STAT3，本研究通過給予HT-29 細(xì)胞外源性IL-6 刺激來誘導(dǎo)STAT3 的激活，并對細(xì)胞裂解產(chǎn)物進(jìn)行Western blot 分析以確定STAT3 在Tyr705 處的磷酸化水平。如圖8 所示，IL-6（10 ng·mL－1）刺激HT-29 細(xì)胞后，p-STAT3蛋白表達(dá)水平顯著升高，而OA 顯著抑制其磷酸化，且呈劑量依賴性。

3.6 OA 下調(diào)HT-29 細(xì)胞中Bcl-2、Bax、CyclinD1、CDK4、p15 的表達(dá)

為探討OA 對IL-6 刺激HT-29 細(xì)胞后的作用機(jī)制，采用RT-PCR 和Western blot 方法檢測OA 對IL-6/STAT3 信號通路的重要靶基因表達(dá)水平的影響。這些基因包括抗凋亡的Bcl-2，促凋亡的Bax、p15以及促增殖的CyclinD1和CDK4。如 圖9 所示，IL-6 刺激后這些基因的mRNA 表達(dá)水平均無明顯變化，而在蛋白水平上，IL-6 刺激可明顯引起CyclinD1 和CDK4 的表達(dá)升高，對Bcl-2、Bax、p15 的表達(dá)無明顯變化。而經(jīng)過OA 處理后，OA 可顯 著 降低IL-6 介導(dǎo) 的Bcl-2、CyclinD1、CDK4三個基因的表達(dá)；可上調(diào)Bax和p15的基因和蛋白的表達(dá)水平，但在不同濃度的OA 處理的HT-29 細(xì)胞中，促凋亡Bax 的表達(dá)水平顯著升高。

圖7 OA 對HT-29 細(xì)胞集落形成能力的影響Fig 7 Effect of OA on the colony forming ability of HT-29 cells

圖8 OA 對HT-29 細(xì)胞STAT3 活化的影響Fig 8 Effect of OA on the activation of STAT3 in HT-29 cells

4 討論

圖9 OA 對HT-29 細(xì)胞IL-6/STAT3 信號通路的影響Fig 9 Effect of OA on IL-6/STAT3 signaling pathway in HT-29 cells

近年研究表明，IL-6 介導(dǎo)的STAT3 信號通路的失調(diào)與人類各種實(shí)體瘤（包括CRC）的發(fā)展密切相關(guān)，異常激活的STAT3 可通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、血管生成、侵襲、轉(zhuǎn)移和抑制凋亡來促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[16-17]。因此，本文研究IL-6/STAT3 信號通路的調(diào)節(jié)，以開發(fā)新的CRC 治療藥物。IL-6 是促進(jìn)細(xì)胞增殖和抑制細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵，通過結(jié)合IL-6R 和共受體糖蛋白130（gp130）起作用，從而激活相關(guān)的Janus 激酶（JAK）。隨后，活化的JAKs 使gp130 磷酸化，從而導(dǎo)致STAT3的募集和激活，STAT3 是細(xì)胞存活和增殖所必需的重要轉(zhuǎn)錄因子，其異常激活可介導(dǎo)各種細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1），CDK4、Bcl-1基因的過表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞過度增殖和凋亡抗性增加，這可能導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[18-21]。

本研究結(jié)果顯示，OA 能顯著抑制IL-6 導(dǎo)致的人結(jié)腸癌HT-29 細(xì)胞過度增殖，DAPI 染色和AnnexinV 檢測均發(fā)現(xiàn)OA 有明顯的促凋亡作用，Caspase-3 顯著激活，均呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性。流式細(xì)胞儀結(jié)果表明，OA 將HT-29 細(xì)胞周期阻滯在G1期。此外，OA 可顯著抑制IL-6 介導(dǎo)的STAT3 激活并呈劑量依賴性，且抑制STAT3 下游基 因Bcl-2、CyclinD1和CDK4的mRNA 和 蛋白表達(dá)，同時可增加Bax、p15的表達(dá)。因?qū)嶒?yàn)?zāi)康脑谟谠u價OA 的藥效作用及其潛在機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)未設(shè)置陽性藥物組。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，OA 可以通過調(diào)節(jié)IL-6/STAT3 信號通路及其靶基因來有效抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其凋亡。因此，OA 有可能作為未來防治結(jié)腸癌的潛在藥物。