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        基于串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)簽定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的芍甘附子湯治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎作用機制研究

        2021-04-30 03:10:14董琳琳石璐苗豐豐晨然靖衛(wèi)霞賈占紅趙一穎孫文燕北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院北京0488北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院北京0009
        中南藥學(xué) 2021年3期
        關(guān)鍵詞:附子組學(xué)蛋白質(zhì)

        董琳琳,石璐,苗豐,豐晨然,靖衛(wèi)霞,賈占紅,趙一穎,孫文燕*(.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院,北京 0488;.北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院,北京 0009)

        類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種全身性自身免疫性疾病,患病人群多為中老年人,且女性患病率高于男性。臨床表現(xiàn)為關(guān)節(jié)腫脹、骨質(zhì)破壞,嚴重者可致關(guān)節(jié)畸形,還可累及全身多個器官。該病病因及發(fā)病機制尚未完全明確,目前尚無根治藥物。

        芍甘附子湯出自《傷寒論》,全方由白芍、附子、甘草組成,臨床治療RA 有確切療效[1]。本課題組前期研究結(jié)果表明,芍甘附子湯對牛Ⅱ型膠原(C Ⅱ)誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(CIA)大鼠有明確的治療作用,可顯著改善大鼠關(guān)節(jié)腫脹,減輕關(guān)節(jié)病理損傷,但作用機制尚不明確。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)是近年來新興的一種實驗方法。串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)簽(tandem mass tag,TMT)是利用化學(xué)標(biāo)簽通過串聯(lián)質(zhì)譜對不同樣品中的蛋白同時進行鑒定和定量的研究方法,已廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學(xué)研究[2-3]。本研究通過建立CIA 大鼠模型,以足跖腫脹度及關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分評價芍甘附子湯的藥效,采用TMT 定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)檢測芍甘附子湯對CIA大鼠滑膜組織蛋白表達的影響,進一步應(yīng)用生物信息學(xué)手段對差異蛋白質(zhì)進行分析,初步探究芍甘附子湯防治RA 的作用機制。

        1 材料

        1.1 動物

        SPF 級Wistar 大 鼠,雄 性,體 質(zhì) 量170 ~190 g[北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司,許可證號:SCXK(京)2016-0006]。

        1.2 試藥

        芍甘附子湯(黑順片3 g、白芍9 g、甘草9 g)配方顆粒(北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院,由北京康仁堂藥業(yè)制成,以確保藥品質(zhì)量),給藥時以生理鹽水充分溶解,按照人日用量換算大鼠的等效劑量為2.1 g(生藥)·kg-1。

        牛Ⅱ型膠原(Chondrex 公司,批號:190306),不完全弗氏佐劑(IFA,Sigma 公司,批號:SLBZ0619),A955-4 質(zhì)譜級乙腈(Fisher 公司),尿素、Tris(AMRESCO 公司),氨水(Sigma-Aldrich公司,批號:318612),二硫蘇糖醇(AMRESCO 公司,批號:M109-25G),碘乙酰胺(Bio-Rad 公司,批號:163-2109),甲酸(Sigma-Aldrich 公司,批號:A117-50),考馬斯亮藍R-250(Thermo Fisher Scientific 公司),V5111 質(zhì)譜級胰蛋白酶(Promega公司),去離子水(Milipore 公司),蛋白Marker(Thermo Fisher Scientific 公司,批號:26616),無水乙醇(北京化工廠),硫脲(Sigma-Aldrich),TMT試劑(Thermo Fisher Scientific 公司,批號:90110),CHAPS(AMRESCO 公司),Protease Inhibitor Cocktail(Roche 公司,批號:11836170001)。

        1.3 儀器

        YLS-7B 型足跖容積測量儀(濟南益延科技發(fā)展有限公司),分析天平(賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司),可調(diào)量程移液器(德國Eppendorf 公司),pH計(瑞士Mettler Toledo 公司),MultiskanGO1510酶標(biāo)儀、超低溫冰箱、超速離心機(美國Thermo Fisher Scientific 公司),制冰機(日本Sanyo 公司),渦旋振蕩器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司),金屬浴(英國Stuart 公司),電泳槽(美國Bio-Rad公司),Powerpac1000 電泳儀、脫色搖床(北京新技術(shù)應(yīng)用研究所),恒溫水浴鍋(上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司),RIGOLL-3000 高效液相色譜(北京普源精電科技有限公司),Orbitrap Fusion Lumos 質(zhì)譜儀、SAVANT 系列真空干燥儀(美國Thermo 公司)。

        2 方法與結(jié)果

        2.1 動物分組、造模與給藥[4]

        動物適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后,將2.0 g·L-1的CⅡ醋酸溶液與IFA 等體積混勻,在冰浴條件下充分乳化,并于實驗第1日(d 1)(初次免疫0.2 mL/只)及第7日(d 7)(加強免疫0.1 mL/只)進行尾根部多點皮內(nèi)注射,正常組給予同等劑量的生理鹽水。實驗第21日(d 21),將造模成功即關(guān)節(jié)炎指數(shù)(arthritis index,AI)評分≥2 的大鼠按照分層隨機分配法分成模型組與芍甘附子湯組[2.1 g(生藥)/(kg·d)],并設(shè)置正常組,每組16 只。實驗第21日(d 21)開始給藥干預(yù),正常組和模型組均給予生理鹽水灌胃,治療組則給予2.1 g(生藥)·kg-1芍甘附子湯配方顆粒灌胃,每日1 次,連續(xù)4 周。

        2.2 足跖腫脹度測定及AI 評分

        于實驗前(d 0)、d 7、d 14、d 21、d 28、d 35、d 42、d 49 采用足跖容積測量儀測定,足跖腫脹度計算公式為:腫脹度=致炎后足跖體積-致炎前足跖體積。于實驗d 14、d 21、d 28、d 35、d 42、d 49 對模型組和芍甘附子湯組大鼠進行AI 評分[5]。評分標(biāo)準為無關(guān)節(jié)紅腫,0 分;足小趾關(guān)節(jié)紅腫,1分;趾關(guān)節(jié)及足跖關(guān)節(jié)腫脹,2 分;踝關(guān)節(jié)以下足爪腫脹,3 分;包括踝關(guān)節(jié)在內(nèi)的全部足爪腫脹,4分。

        2.3 TMT 定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析

        2.3.1 蛋白提取 于d 49 取各組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織,每組隨機選取3 只。將研磨使用的物品用液氮預(yù)冷,樣本研磨成粉,按照1∶10(W/V)加入裂解液(7 mol·L-1尿素,1%蛋白酶抑制劑),渦旋混勻。樣本管中加入鋼珠,置于組織研磨儀中勻漿,冰上靜置30 min。13 000 r·min-1,4℃離心15 min,吸取上清液,分裝后凍存于-80℃冰箱。Bradford 法測定蛋白濃度。

        2.3.2 蛋白酶解 每個樣品分別取等量蛋白加入終濃度為25 mmol·L-1的二硫蘇糖醇,渦旋混勻,37 ℃水浴1 h,取出放至室溫。加入終濃度為50 mmol·L-1的碘乙酰胺,渦旋混勻,避光室溫放置30 min。加入0.2 mol·L-1的三乙基碳酸氫銨300 μL,12 000 r·min-1離心10 min,棄掉收集管底部溶液,重復(fù)3 次,再加入0.5 mol·L-1的三乙基碳酸氫銨300 μL,12 000 r·min-1離心10 min。按照胰蛋白酶與蛋白1∶50 的比例,加入胰蛋白酶50 μL,37℃反應(yīng)過夜。次日,加入0.2 mol·L-1的三乙基碳酸氫銨100 μL,12 000 r·min-1離心10 min,重復(fù)3 次,酶解消化后的肽段溶液離心于收集管底部。

        2.3.3 TMT 標(biāo)記及除鹽 從冰箱中取出TMT 試劑,平衡到室溫,將TMT 試劑離心至管底。每管加入41 μL 無水乙腈,渦旋振蕩至完全溶解,離心至管底。加入100 μL 的100 mmol·L-1三乙基碳酸氫銨復(fù)溶樣本(25 ~100 μg 蛋白),渦旋振蕩,離心至管底。將41 μL TMT 試劑按順序加入樣品中,渦旋振蕩,離心至管底,室溫反應(yīng)1 h。標(biāo)記樣品加入8 μL 5%羥胺,室溫孵育15 min 終止標(biāo)記反應(yīng)。HLB固相萃取柱除鹽,置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

        2.3.4 離線高pH 反相高效液相色譜分離 將TMT 的多肽樣品重溶于A 液(98% ddH2O,2%乙腈,氨水調(diào)pH 至10.0)中。經(jīng)離線XBridge?peptide BEH C18高效液相色譜柱(130?,3.5 μm,4.6 mm×150 mm)分離,洗脫緩沖液B 液為98.0%乙腈,2.0%去離子水(pH 10.0)。每隔1 min 收集一管組分,共收集40 管,按順序?qū)悠泛喜?0 管組分。將收集的組分置于旋轉(zhuǎn)真空干燥儀中真空干燥,-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

        2.3.5 LC-MS/MS 分析 使用Orbitrap Fusion Lumos質(zhì)譜儀分析鑒定多肽混合物。使用高靈敏度模式,參數(shù)設(shè)置:每個全掃描為高速信號依賴掃描,掃描75 min。一級全掃描分辨度12 000,掃描范圍為350 ~1550m/z,AGC5e5,最大注射時間為50 ms,碰撞能量為35%,二級掃描分辨度15 000,電荷狀態(tài)篩選(包含+2 至+6 電荷的前體),動態(tài)消除30 s,AGC5e4,最大注射時間為22 ms。

        2.3.6 數(shù)據(jù)分析 所得質(zhì)譜數(shù)據(jù)經(jīng)過Mascot(version 2.5.1)檢索,Scaffold Q +(version 4.6.2)軟件進行蛋白定量定性分析,運用UNIPROT_Rat_29954_20181130.fasta(序列總數(shù):29954)(https://www.uniprot.org/)數(shù)據(jù)庫對蛋白進行初步分類。對蛋白定量數(shù)據(jù)進行成對t檢驗,篩選P≤0.05 的蛋白質(zhì),為顯著差異蛋白質(zhì)。利用Omics Box 軟件(版本:1.2.4)對差異蛋白質(zhì)進行GO(http://geneontology.org/)功能注釋分析,并利用KEGG(https://www.kegg.jp/)富集分析可能的通路。

        2.4 統(tǒng)計方法

        足跖腫脹度及AI 評分均采用SAS 9.2 統(tǒng)計軟件進行分析。實驗數(shù)據(jù)為連續(xù)變量以±s表示,使用方差分析或非參數(shù)檢驗,P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

        2.5 結(jié)果

        2.5.1 芍甘附子湯對CIA 大鼠足跖腫脹度的影響 自初次免疫后d 14 ~d 49,模型組大鼠相對于正常組左后足明顯腫脹(P<0.01)。芍甘附子湯組與模型組比較,左后足跖腫脹度自初次免疫后d 35 ~d 49 明顯下降(P<0.05,P<0.01),見表1。初次免疫后d 14 ~d 49,模型組大鼠相對于正常組右后足跖腫脹度升高(P<0.01)。芍甘附子湯組與模型組比較,自初次免疫后d 35 ~d 49,右后足跖腫脹度明顯減輕(P<0.01)(見圖1 及表2)。

        圖1 各組大鼠后足腫脹情況Fig 1 Swelling of the hind foot of rats in each group A.正常組(normal group);B.模型組(model group);C.芍甘附子湯組(Shaogan Fuzi decoction group);1.給藥前(before the administration);2.給藥后(after the administration)

        表1 芍甘附子湯對CIA 大鼠左后足跖腫脹度的影響(±s,n =16)Tab 1 Effect of Shaogan Fuzi decoction on the swelling of the left hind foot of CIA rats (±s,n =16)

        表1 芍甘附子湯對CIA 大鼠左后足跖腫脹度的影響(±s,n =16)Tab 1 Effect of Shaogan Fuzi decoction on the swelling of the left hind foot of CIA rats (±s,n =16)

        注:與正常組比較,**P <0.01;與模型組比較,△P <0.05,△△P <0.01。Note:Compared with the normal group,**P <0.01;compared with the model group,△P <0.05,△△P <0.01.

        組別 左后足跖腫脹度/mL d 7 d 14 d 21 d 28 d 35 d 42 d 49正常組 0.11±0.07 0.21±0.12 0.24±0.13 0.30±0.14 0.36±0.11 0.43±0.13 0.42±0.12模型組 0.10±0.09 0.66±0.35** 1.16±0.55** 1.44±0.61** 1.30±0.48** 1.31±0.49** 1.25±0.59**芍甘附子湯組 0.09±0.10 0.65±0.50 1.11±0.43 1.34±0.44 0.93±0.48△ 0.88±0.55△△ 0.82±0.42△

        表2 芍甘附子湯對CIA 大鼠右后足跖腫脹度的影響(±s,n =16)Tab 2 Effect of Shaogan Fuzi decoction on the swelling of the right hind foot of CIA rats (±s,n =16)

        表2 芍甘附子湯對CIA 大鼠右后足跖腫脹度的影響(±s,n =16)Tab 2 Effect of Shaogan Fuzi decoction on the swelling of the right hind foot of CIA rats (±s,n =16)

        注:與正常組比較,*P <0.05,**P <0.01;與模型組比較,△△P <0.01。Note:Compared with the normal group,*P <0.05,**P <0.01;compared with the model group,△△P <0.01.

        組別 右后足跖腫脹度/mL d 7 d 14 d 21 d 28 d 35 d 42 d 49正常組 0.08±0.07 0.17±0.09 0.21±0.09 0.29±0.11 0.32±0.12 0.42±0.12 0.41±0.14模型組 0.11±0.12 0.69±0.43** 1.00±0.52** 1.44±0.44* 1.52±0.57** 1.52±0.54** 1.37±0.56**芍甘附子湯組 0.05±0.16 0.48±0.34 1.01±0.37 1.21±0.57 0.94±0.54△△ 0.86±0.56△△ 0.78±0.42△△

        2.5.2 芍甘附子湯對CIA 大鼠AI 評分的影響 正常組AI 評分為0 分,芍甘附子湯組自初次免疫d 28 ~d 49,AI 評分較模型組明顯下降(P<0.05),見表3。

        表3 芍甘附子湯對CIA 大鼠AI 評分的影響(±s,n =16)Tab 3 Effect of Shaogan Fuzi decoction on the AI score of CIA rats (±s,n =16)

        表3 芍甘附子湯對CIA 大鼠AI 評分的影響(±s,n =16)Tab 3 Effect of Shaogan Fuzi decoction on the AI score of CIA rats (±s,n =16)

        注:與模型組比較,△P <0.05。Note:Compared with the model group,△P <0.05.

        組別 AI 評分/分d 14 d 21 d 28 d 35 d 42 d 49模型組 4.38±1.89 5.53±1.78 7.72±1.37 6.00±2.71 5.56±2.45 5.81±2.45芍甘附子湯組 5.38±1.59 6.00±3.01△ 3.81±1.91△ 3.47±2.05△ 3.94±2.05△ 3.94±2.05△

        2.5.3 蛋白質(zhì)組學(xué)差異蛋白質(zhì)鑒定結(jié)果 以Ratio >1.2 或Ratio <0.833 且P<0.05 為篩選條件,模型組與正常組相比較,共鑒定出85 個差異蛋白質(zhì);芍甘附子湯組與模型組相比較,共鑒定出49 個差異蛋白質(zhì)(見表4 及5)。

        2.5.4 GO 富集分析結(jié)果 GO 富集分析包括對芍甘附子湯組與模型組差異蛋白質(zhì)的分子功能(molecular function,MF)、生物學(xué)過程(biological Process,BP)和細胞組分(cellular component,CC)的分析。圖2 為MF、BP、CC 三類富集分析差異顯著性前10 的條目。其中,MF 共涉及45 個功能,主要包括O-?;D(zhuǎn)移酶活性、碳水化合物結(jié)合、β淀粉樣蛋白結(jié)合、L-抗壞血酸結(jié)合、AU 堿基富集結(jié)合、3'-UTR 和AU 堿基富集結(jié)合、泛素結(jié)合酶活性、2-氧代戊二酸依賴性雙加氧酶活性、泛素樣蛋白結(jié)合酶活性、脫氧核糖核苷酸結(jié)合等(見表6);BP 涉及到104 個生物過程,主要有RNA 剪接的負調(diào)控、通過剪接體對mRNA 剪接的負調(diào)控、肽賴氨酸羥化、mRNA 加工的負調(diào)控、干細胞分裂、有絲分裂細胞周期相變的負調(diào)控、通過剪接體調(diào)控mRNA 剪接、細胞周期相變的負調(diào)控、RNA 剪接的調(diào)控等(見表7);CC 涉及到富含四跨素的微結(jié)構(gòu)域、紡錘體基質(zhì)、NatC 復(fù)合體、Rb-E2F 復(fù)合物、突觸前膜的錨固成分、突觸后膜的錨固成分、突觸膜的錨固成分、AMPA 谷氨酸受體復(fù)合物、補體成分C1 復(fù)合物、BRCA1-A 復(fù)合物等(見表8)。

        表4 模型組與正常組的差異蛋白質(zhì)(n =3)Tab 4 Differential protein between model group and normal group (n =3)

        續(xù)表4

        2.5.5 KEGG 通路富集結(jié)果 芍甘附子湯組與模型組差異蛋白質(zhì)的KEGG 通路富集分析涉及到剪接體、細胞衰老、人類免疫缺陷病毒1 感染、賴氨酸降解、RNA 降解、百日咳、FcγR 介導(dǎo)的吞噬作用、病毒性心肌炎、TGF-β信號通路、細胞周期、Apelin 信號通路等18 條相關(guān)通路,其中與RA 相關(guān)的有TGF-β信號通路、Apelin 信號通路等(見圖3 及表9)。

        3 討論

        RA 具有慢性、進行性、侵蝕性和破壞性的特點,致殘率高,對工作及生活影響極大。CIA模型是公認的RA 模型,其關(guān)節(jié)腫脹、炎性細胞浸潤、關(guān)節(jié)滑膜增生、血管翳形成、關(guān)節(jié)軟骨組織病變等臨床特征與RA 患者相似。并且CIA 模型的發(fā)生依賴于T、B 細胞的激活增殖,其發(fā)病機制也與RA 患者相似[6]。本研究選用Wistar 大鼠,采用CⅡ與IFA 尾根部皮內(nèi)注射法復(fù)制CIA模型,注射后動物出現(xiàn)關(guān)節(jié)紅腫、活動受限等關(guān)節(jié)炎表現(xiàn),表明模型復(fù)制成功。

        芍甘附子湯中白芍具有養(yǎng)血斂陰、柔肝止痛功效。甘草作為補益藥,具有調(diào)和諸藥、緩急止痛功效;附子性味辛、甘,大熱,具有散寒止痛功效;諸藥共用可散寒祛濕、通絡(luò)止痛[7]。藥理研究表明,白芍有效成分白芍總苷具有明顯的抗炎作用,對于RA 療效確切,而芍藥苷占白芍總苷的90%以上,多項動物實驗證實其可顯著降低RA 模型大鼠的關(guān)節(jié)腫脹[8]。甘草具有抗炎、調(diào)節(jié)免疫的作用[9-10]。附子具有增強免疫、鎮(zhèn)痛、抗炎等作用[11]。本研究表明芍甘附子湯能顯著降低CIA 大鼠的關(guān)節(jié)腫脹度及AI 評分,即對RA具有治療作用,結(jié)果與文獻報道一致[7]。

        表5 芍甘附子湯組與模型組的差異蛋白質(zhì)(n =3)Tab 5 Differential protein between Shaogan Fuzi decoction group and model group (n =3)

        圖2 生物信息學(xué)分析結(jié)果Fig 2 Bioinformatics analysis results

        圖3 KEGG 通路富集結(jié)果Fig 3 KEGG pathway enrichment results

        表6 差異蛋白質(zhì)的主要分子功能分析Tab 6 Analysis of the main molecular functions of differential proteins

        表7 差異蛋白質(zhì)的主要生物過程分析Tab 7 Analysis of the main biological processes of differential proteins

        表8 差異蛋白質(zhì)的主要細胞組分分析Tab 8 Analysis of main cell components of differential proteins

        中藥復(fù)方通過多靶點、多成分治療疾病,在整體層面上起效。蛋白質(zhì)組學(xué)是對生物體內(nèi)所有蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、功能、相互作用以及在體內(nèi)的變化進行研究,進而對變化的蛋白質(zhì)進行追蹤,尋找潛在的生物標(biāo)志物,提示疾病可能的發(fā)病機制,從而更好地為臨床診斷及預(yù)后提供依據(jù)。蛋白質(zhì)組學(xué)的研究手段與中藥復(fù)方的作用特點不謀而合。因此,本研究采用蛋白質(zhì)組學(xué)方法初步探究芍甘附子湯治療RA 的作用機制。

        蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果表明,與正常組相比,模型組IL1RAP、Cntn1、Copz1 等85 個蛋白表達出現(xiàn)顯著性差異。與模型組相比,芍甘附子湯組有49 個蛋白質(zhì)表達出現(xiàn)顯著性差異。GO 富集分析表明這49 個差異蛋白質(zhì)主要參與免疫及炎癥調(diào)控等過程,大多分布于細胞質(zhì)中,多具有結(jié)合及催化活性。KEGG 分析表明差異蛋白質(zhì)主要涉及18 條信號通路,其中與RA 顯著相關(guān)的為Apelin 信號通路以及TGF-β信號通路,提示芍甘附子湯可通過多種途徑發(fā)揮治療RA 的作用。

        表9 差異蛋白質(zhì)的主要KEGG 信號通路分析Tab 9 Analysis of the main KEGG signaling pathways of differential proteins

        RA 作為一種免疫性疾病,多種免疫細胞及細胞因子的參與促進了其發(fā)生發(fā)展。而IL1RAP在RA 的發(fā)病過程中也發(fā)揮了重要作用。IL1RAP具有白細胞介素-1(IL-1)受體活性及白細胞介素-13(IL-13)受體活性,能夠加速IL-1、IL-13等促炎因子的產(chǎn)生,增強炎癥反應(yīng),還可激活I(lǐng)L-1β、NF-κB 和MAPK 信號通路[12-13],促進疾病的發(fā)展。本研究發(fā)現(xiàn),模型組與正常組相比,IL1RAP 表達上調(diào),而芍甘附子湯組IL1RAP 表達下調(diào),提示芍甘附子湯可能通過下調(diào)IL1RAP表達,調(diào)節(jié)相應(yīng)炎性細胞因子水平,緩解CIA 大鼠的關(guān)節(jié)腫脹情況。但是,芍甘附子湯是直接還是間接降低IL1RAP 的水平從而調(diào)控IL-1β信號通路,仍需進一步研究。

        Ctsl 在多種疾病中都有重要作用,可通過調(diào)節(jié)T 細胞的轉(zhuǎn)化改善炎癥情況,還可促進關(guān)節(jié)軟骨中基質(zhì)的下調(diào),從而促進疾病的發(fā)展[14-15]。多項研究表明Ctsl 與RA 相關(guān),通過靶向抑制Ctsl的產(chǎn)生可有效降低RA 關(guān)節(jié)軟骨侵蝕[16],Ctsl 缺失的AIA(antigen-induced arthritis)小鼠較野生型AIA 小鼠關(guān)節(jié)腫脹顯著好轉(zhuǎn)[17]。本研究中,芍甘附子湯干預(yù)組Ctsl 表達下調(diào),提示芍甘附子湯可能通過抑制Ctsl 的產(chǎn)生而改善RA 的病變。

        ABHD5 具有溶血磷脂酸?;D(zhuǎn)移酶活性,可催化溶血磷脂酸(LPA)轉(zhuǎn)化為磷脂酸(PA)[18]。LPA 不僅參與脂質(zhì)代謝,還是一種重要的脂質(zhì)信號分子,參與細胞分化、凋亡等過程。在RA 患者中,LPA 還可促進成纖維細胞的增殖,加重炎癥反應(yīng),促進RA 的發(fā)展。研究表明,RA 患者滑液中LPA 含量明顯升高。多項實驗顯示,LPA 可通過與G 蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合,介導(dǎo)p38/ERK-MAPK信號通路,參與RA 的發(fā)生發(fā)展[19-20]。本研究表明,芍甘附子湯可能通過上調(diào)ABHD5,增加LPA向PA 的轉(zhuǎn)化過程,進而下調(diào)LPA 的含量,緩解CIA 大鼠炎癥反應(yīng)。

        Apelin 信號通路與RA 相關(guān),該通路中核呼吸因子(nuclear respiratory factor 1,Nrfl)的上游因子過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1α(peroxisome proliferator-activated receptor-γcoactivator-1α,PGC-1α)為線粒體生物發(fā)生的關(guān)鍵因子。尚未有研究表明線粒體生物發(fā)生與RA的關(guān)系,但線粒體生物發(fā)生受到抑制會增加骨關(guān)節(jié)炎的代謝紊亂和炎癥,而促進線粒體生物發(fā)生可以治療關(guān)節(jié)疾病[21-22]。也有研究表明,白藜蘆醇可通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控減少炎癥相關(guān)基因的表達,并推測Nrf1 和GA 結(jié)合蛋白α亞基(GABPA)作為下調(diào)基因與白藜蘆醇減輕炎癥有關(guān)。因此,需要進一步研究芍甘附子湯干預(yù)RA 作用與抑制Apelin 信號通路及下調(diào)Nrf1 表達的關(guān)系。

        研究表明,RA 發(fā)作期間TGF-β信號通路被激活,TGF-β1、Smad2 和Smad3 的表達增加,抑制TGF-β信號通路可降低白細胞介素-6(IL-6)及腫瘤壞死因子α(TNF-α)的水平達到治療RA 的目的[23]。E2F 轉(zhuǎn)錄因子4(E2f4)為Smad2 和Smad3的下游因子。本研究顯示,經(jīng)芍甘附子湯干預(yù)后,E2f4 的表達出現(xiàn)上調(diào),其具體原因有待進一步分析。

        綜上,芍甘附子湯干預(yù)后,CIA 大鼠共有49個蛋白表達出現(xiàn)顯著變化,其治療RA 作用可能主要與下調(diào)IL1RAP、Ctsl,上調(diào)Abhd5 的表達有關(guān),但尚需進行實驗證實。

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