羅亮，李欣蔓，馬靖宜，林居純，符華林，顧健，何黎黎，袁志翔*（.西南民族大學藥學院，成都 6004；.四川農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，成都 630）

隨著中藥在國際市場的日漸滲透，對于免疫抑制的治療，人們將目光投向了“藥食同源”的中藥材[1]。蘆筍（Asparagus.）俗稱石刁柏、龍須菜等，是天門冬科天門冬屬多年生草本植物石刁柏的幼苗，可供蔬食，是國際上公認的防癌保健蔬菜[2]。蘆筍不僅含有多糖、黃酮類、皂苷類化合物等多種功能成分，還富含具有多種特殊生理功能的氨基酸，尤其是天冬氨酸和谷氨酸[3]。蘆筍幼苗因未出土而呈白色，故被稱為白蘆筍，出土后呈綠色被稱為綠蘆筍。研究發(fā)現(xiàn)綠蘆筍富含葉綠素，白蘆筍含豐富的微量元素、多種氨基酸、蛋白質(zhì)和維生素[4]。蘆筍的免疫作用受到了醫(yī)學研究領域的重點關(guān)注，蘆筍汁對中樞及周圍免疫器官中T 淋巴細胞的增殖均有刺激作用[3]；蘆筍的醇提物可以顯著增強脾淋巴細胞增殖能力，顯著提高血清溶血素含量，并具有劑量依賴性[5]。

然而，目前工業(yè)化生產(chǎn)中，對蘆筍榨汁后殘渣一般作廢棄物處理，造成環(huán)境危害和資源浪費，為進一步開發(fā)和利用蘆筍，本課題研究了白蘆筍鮮汁以及榨汁后殘渣醇提物中不同極性部位對免疫抑制小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用。

1 材料

1.1 動物

SPF 級昆明種小白鼠，體質(zhì)量（20±2）g，雌雄各半，共80 只[成都達碩實驗動物有限公司，合格證號：SCXK（川）2020-030]。飼養(yǎng)條件：12 h 光照/12 h 黑暗，溫度為（25±3）℃，濕度為35%～60%，自由進食及飲水。

1.2 試藥

新鮮白蘆筍（四川匯誠藥業(yè)有限公司，西南民族大學中藥教研室任艷老師鑒定為正品）；環(huán)磷酰胺（粉末，純度：97%，上海源葉生物科技有限公司，批號：X22D8Y51136）；黃芪多糖（粉末，純度：70%，成都乾坤動物藥業(yè)股份有限公司，批號：20180901）；蘇木素-伊紅生化試劑（鴻泉生物有限公司，批號：20190103）；淋巴細胞分離液（華奧生物醫(yī)藥有限公司，批號：180706）；IL-2、IL-4、TNF-α、IFN-γELISA 試 劑盒（武 漢貝 茵萊生物科技有限公司，批號：201905）；CCK-8 試劑（MedChemExpress，批號：25090117）；刀豆蛋白（ConA，Sigma，批號：218L032）；脂多糖（LPS，批號：320V301，Sigma 美國）。

1.3 儀器

DZF-6020 真空干燥箱（上海三發(fā)科學儀器有限公司）；SHZ-ⅢD 循環(huán)水真空泵、RE52CS 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、HH-6J 恒溫水浴鍋（上海亞榮生化儀器廠）；BC-2800VET 獸用全自動血液細胞分析儀（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司）；ST16R高速冷凍離心機（賽默飛世爾科技有限公司）；ESj180-4 型電子天平（沈陽龍騰電子有限公司）。

2 方法

2.1 白蘆筍鮮汁及殘渣提取物的制備

將新鮮白蘆筍洗凈、晾干、切斷、榨汁，過濾離心收集濾液即得白蘆筍鮮汁，分裝儲存于－20℃下備用。剩余殘渣烘干，加入15 倍體積75%乙醇，超聲提取1 h，共提取2 次。合并提取液，減壓濃縮，干燥至恒重，得到醇提物浸膏。浸膏用適量蒸餾水分散，采用系統(tǒng)溶劑法，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇進行萃取，各萃取3 次，每次30 min。合并各相萃取液，余下分散液置于高速冷凍離心機中4000 r·min－1離心15 min，棄去不溶物沉淀，減壓下回收溶劑即得石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、水部位提取物，脂溶性提取物用2%吐溫80 溶液乳化備用。

2.2 動物分組及給藥

小鼠適應性喂養(yǎng)1 周后，按體質(zhì)量隨機分成10 組，每組8 只，雌雄各半。分別為：空白組、模型組、黃芪多糖組（陽性組）、鮮汁低劑量組、鮮汁中劑量組、鮮汁高劑量組、石油醚部位組、乙酸乙酯部位組、正丁醇部位組、水部位組。除空白組外，其余組腹腔注射80 mg·kg－1環(huán)磷酰胺造模，空白組采用等量生理鹽水腹腔注射，連續(xù)3 d，構(gòu)建免疫抑制小鼠模型[6]。造模成功后，鮮汁低、中、高劑量組依次用5、10、20 mL·kg－1鮮汁灌胃。石油醚、乙酸乙酯、正丁醇及水部位組每日用50 mg·kg－1相應提取物溶液灌胃。陽性組用50 mg·kg－1黃芪多糖灌胃。空白組和模型組每日灌胃等量生理鹽水，連續(xù)灌胃7 d。末次給藥24 h 后禁食禁水，處死小鼠，進行臟器指數(shù)測定、細胞因子含量檢測及脾淋巴細胞增殖實驗。

2.3 臟器指數(shù)測定

稱取小鼠質(zhì)量，乙醚麻醉后處死小鼠。取其胸腺、脾臟及肝臟，去除表面無關(guān)結(jié)締組織，生理鹽水洗凈后放于濾紙吸干臟器表面水分后稱重，計算胸腺、脾臟及肝臟指數(shù)。臟器指數(shù)＝臟器質(zhì)量（g）/體質(zhì)量（100 g）[7]。

2.4 細胞因子的測定

取小鼠血清，按照ELISA 試劑盒說明書，分別進行小鼠細胞因子IL-2、IL-4、TNF-α、IFN-γ的檢測[8]。

2.5 脾淋巴細胞增殖

取小鼠脾臟，用PBS 濕潤，無菌條件下研磨獲得脾細胞懸液，用淋巴細胞分離液分離出淋巴細胞，臺盼藍染色計數(shù)活細胞數(shù)，用RPMI-1640完全培養(yǎng)液調(diào)節(jié)細胞密度至1×105個/ 孔，每孔加入200 μL 含10%胎牛血清的RPMI-1640 完全培養(yǎng)液，各劑量組又分別設刀豆蛋白A（ConA，終質(zhì)量濃度為10 μg·mL－1）、脂多糖（LPS，終質(zhì)量濃度為5 μg·mL－1）、不加ConA 或者LPS 空白培養(yǎng)孔。37℃、5%CO2培養(yǎng)48 h，每孔加20 μL CCK-8，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。于酶標儀450 nm 波長下測定吸光度（OD）值[9]。計算各條件下淋巴細胞的增殖率，增殖率（%）＝ODConA/LPS/ODS×100%，ODConA/LPS表示含有ConA 或LPS 的RPMI-1640 培養(yǎng)基中脾淋巴細胞測得的光密度值，ODS表示RPMI-1640 培養(yǎng)基中脾淋巴細胞測得的光密度值。

2.6 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0（IBM，USA）進行分析，以平均值±標準差（SD）表示，采用單因素方差分析（ANOVA）及鄧肯檢驗比較各組間的顯著差異。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 臟器指數(shù)測定

由表1 可知，與空白組相比，模型組胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)及肝臟指數(shù)均明顯變小（P＜0.05），表明環(huán)磷酰胺免疫抑制小鼠造模成功。鮮汁低、中、高劑量組肝臟指數(shù)、胸腺指數(shù)及脾臟指數(shù)與模型組相比，均明顯增大（P＜0.05），與黃芪多糖陽性組以及空白組相比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。鮮汁中劑量組恢復上述臟器指數(shù)能力更強，但不存在顯著的劑量-效應關(guān)系。

表1 白蘆筍鮮汁對小鼠臟器指數(shù)的影響(±s，n ＝8，g/100 g)Tab 1 Effect of white asparagus fresh juice on organ index of mice(±s，n ＝8，g/100 g)

表1 白蘆筍鮮汁對小鼠臟器指數(shù)的影響(±s，n ＝8，g/100 g)Tab 1 Effect of white asparagus fresh juice on organ index of mice(±s，n ＝8，g/100 g)

注：不同上標字母表示差異具有統(tǒng)計學意義。Note：Different superscripts indicate that the difference is statistically significant.

組別 胸腺指數(shù) 脾臟指數(shù) 肝臟指數(shù)空白組 0.201±0.0137a 0.415±0.0325a 5.877±0.416a模型組 0.132±0.0092b 0.322±0.0314b 5.055±0.248b黃芪多糖組 0.201±0.0126a 0.412±0.0274a 5.898±0.284a鮮汁低劑量組 0.190±0.0134a 0.391±0.0238a 5.824±0.340a鮮汁中劑量組 0.204±0.0138a 0.415±0.0272a 5.896±0.334a鮮汁高劑量組 0.186±0.0281a 0.392±0.0264a 5.787±0.332a

由表2 可知，與模型組相比，白蘆筍殘渣醇提物不同極性部位組中石油醚部位、乙酸乙酯部位組小鼠臟器指數(shù)差別無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），隨著萃取溶液極性的增大，正丁醇部位、水部位組小鼠臟器明顯增大（P＜0.05），表明白蘆筍殘渣醇提物中高極性提取物增加免疫低下小鼠的臟器指數(shù)效果明顯。

表2 不同極性部位提取物對小鼠臟器指數(shù)的影響(±s，n ＝8，g/100 g)Tab 2 Effect of different polarity fractions on organ index of mice(±s，n ＝8，g/100 g)

表2 不同極性部位提取物對小鼠臟器指數(shù)的影響(±s，n ＝8，g/100 g)Tab 2 Effect of different polarity fractions on organ index of mice(±s，n ＝8，g/100 g)

注：不同上標字母表示差異具有統(tǒng)計學意義。Note：Different superscripts indicate that the difference is statistically significant.

組別 胸腺指數(shù) 脾臟指數(shù) 肝臟指數(shù)空白組 0.201±0.0137a 0.415±0.0325a 5.877±0.416a模型組 0.132±0.0092b 0.322±0.0314b 5.055±0.248b黃芪多糖組 0.201±0.0126a 0.412±0.0274a 5.898±0.284a石油醚部位組 0.136±0.0093b 0.329±0.0268b 5.068±0.205b乙酸乙酯部位組 0.143±0.010b 0.337±0.0292b 5.205±0.239b正丁醇部位組 0.166±0.0129c 0.371±0.0142c 5.506±0.205c水部位組 0.177±0.0147c 0.383±0.0172c 5.734±0.228ac

3.2 細胞因子測定

白蘆筍鮮汁對小鼠血清細胞因子的表達結(jié)果見圖1。與空白組比較，模型組小鼠血清中IL-2、IL-4、TNF-α、IFN-γ含量均顯著降低（P＜0.05）。給藥治療后，黃芪多糖組及低、中、高白蘆筍汁組血清中IL-2、IL-4、TNF-α、IFN-γ含量均較模型組顯著升高（P＜0.05），與空白組相比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與黃芪多糖組相比，3 個劑量白蘆筍鮮汁組小鼠血清中上述細胞因子濃度差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。白蘆筍汁3 個劑量組之間，中劑量組小鼠血清中IL-2、IL-4、IFN-γ、TNF-α的含量高于低、高劑量組，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結(jié)果表明白蘆筍鮮汁各劑量組均能較好地上調(diào)免疫低下小鼠血清中的IL-2、IL-4、TNF-α、IFN-γ含量。

圖1 白蘆筍鮮汁對小鼠細胞因子的影響Fig 1 Effect of white asparagus fresh juice on cytokines in mice

白蘆筍殘渣醇提物不同極性部位對小鼠細胞因子的影響結(jié)果見圖2。由圖2 可知，與模型組相比，石油醚組、乙酸乙酯組小鼠血清中的IL-2、IL-4、TNF-α、IFN-γ含量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），正丁醇部位組、水部位組小鼠血清中的IL-2、IL-4、TNF-α、IFN-γ含量明顯增加（P＜0.05），且水部位組細胞因子較正丁醇部位組高，表明白蘆筍渣醇提取物中存在免疫活性物質(zhì)，且可能為高極性化合物，其對促進免疫抑制小鼠細胞因子的釋放具有上調(diào)作用。

圖2 不同極性部位提取物對小鼠細胞因子的影響Fig 2 Effect of different polarity fractions on cytokines in mice

3.3 脾淋巴細胞增殖率

白蘆筍鮮汁脾淋巴細胞增殖率見圖3。與空白組相比，模型組小鼠脾淋巴細胞經(jīng)ConA 或LPS 刺激后增殖率均顯著降低（P＜0.05）。與模型組相比，陽性對照黃芪多糖組脾淋巴經(jīng)ConA或LPS 刺激后增殖率均顯著增加（P＜0.05）。低、中、高3 個劑量組白蘆筍鮮汁的脾淋巴細胞增殖率均顯著高于模型組（P＜0.05）。結(jié)果表明，白蘆筍鮮汁對免疫低下小鼠的脾淋巴細胞增殖率有促進作用。

圖3 白蘆筍鮮汁對脾細胞增殖率的影響Fig 3 Effect of white asparagus fresh juice on splenic lymphocyte proliferation rate

不同極性部位脾淋巴細胞增殖率見圖4。與空白組相比，黃芪多糖組脾淋巴細胞經(jīng)ConA、LPS 刺激后增殖率無顯著差異（P＞0.05），但其余各組小鼠脾淋巴細胞經(jīng)ConA、LPS 刺激后增殖率均顯著下降（P＜0.05）。與模型組相比，石油醚、乙酸乙酯部位組小鼠脾淋巴細胞增殖率無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），正丁醇、水部位組小鼠脾淋巴細胞增殖率明顯增加（P＜0.05）。提示白蘆筍渣醇提取物中存在有促進小鼠脾淋巴細胞增殖的物質(zhì)，該物質(zhì)集中在高極性部位中。

圖4 不同極性部位提取物對脾細胞增殖率的影響Fig 4 Effect of different polarity fractions on splenic lymphocyte proliferation rate

4 討論

臟器指數(shù)是動物某臟器的質(zhì)量與其體質(zhì)量比值，動物機體受到損傷后，臟器指數(shù)也隨之改變[10]。白細胞介素、腫瘤壞死因子、干擾素三類細胞因子常用于評價機體免疫能力的強弱[11-12]。脾淋巴細胞增殖實驗已被廣泛用于分析淋巴細胞的反應性，常作為測定機體免疫功能的指標之一[13]。因此，本研究選取上述指標評價白蘆筍鮮汁及殘渣醇提物對免疫抑制小鼠免疫功能的影響。

對不同劑量白蘆筍鮮汁的研究發(fā)現(xiàn)，各劑量組均能較好地提高免疫低下小鼠的臟器指數(shù)，血清中IL-2、IL-4、TNF-α、IFN-γ的水平，促進脾淋巴細胞的增殖，但各劑量組之間差異無統(tǒng)計學意義，未體現(xiàn)出劑量-效應關(guān)系。雖然3 個劑量組之間無明顯差異，但10 mL·kg－1劑量組上述指標高于5、20 mL·kg－1劑量組，為此，考慮白蘆筍鮮汁是否具有雙向免疫調(diào)節(jié)作用[14-15]。這一結(jié)果為白蘆筍鮮汁后續(xù)研究提供了新的研究思路。

對白蘆筍渣醇提物不同極性部位的研究發(fā)現(xiàn)，低、中極性部位組免疫低下小鼠臟器指數(shù)，血清中IL-2、IL-4、TNF-α、IFN-γ水平，脾淋巴細胞增殖率與模型組相比無顯著變化，而高極性部位組免疫抑制小鼠的上述指標顯著增加。提示白蘆筍渣醇提物中含有免疫增強物質(zhì)，且該物質(zhì)可能為高極性化合物。田穎剛等[3]對蘆筍下腳料乙醇提取物活性成分研究發(fā)現(xiàn)，75%乙醇提取物中皂苷含量為18.20%、多糖含量為14.86%，總游離氨基酸含量為12.63%。王芳等[5]用75%乙醇提取風干蘆筍，得到蘆筍的多種活性成分，其主要包括蘆筍皂苷、蘆筍多糖和多種游離氨基酸，結(jié)合相關(guān)研究，推測正丁醇、水部位中提取物可能是氨基酸、多糖以及水溶性苷類成分。這將為以后對白蘆筍殘渣的免疫活性物質(zhì)研究提供參考依據(jù)。