劉明爽，田若丹，葛夢煥，文春南，王旭光，劉淼*，麻兵繼，*（.河南農業(yè)大學農學院 中藥材系，鄭州 450046；.河南白云牧港生物科技有限公司，河南 登封 45400）

內生真菌是植物生活史的部分或全部階段定殖于健康植物組織中，同時又不引起植物發(fā)生明顯病變的真菌[1]。研究表明，植物內生真菌是結構多樣、生物活性廣泛的天然產物的重要來源[2]，已成為藥物先導化合物發(fā)現的重要途徑。同時，有些植物內生真菌具有促進宿主植物生長發(fā)育、增強其抗逆性等作用[3]。因此，針對植物內生真菌的研究引起了越來越多的關注。

薯蕷（Dioscorea oppositaThunb.）為薯蕷科纏繞草質藤本植物，其根莖入藥稱為山藥，具有益氣養(yǎng)陰、補脾益腎、固精止帶等功效[4]。山藥不僅作藥用，亦作食用，具有較高的營養(yǎng)價值，是我國著名的藥食同源中藥材。山藥在我國很多省區(qū)以栽培方式生產，以古懷慶府（今河南省焦作市溫縣、沁陽市、武陟縣等沿沁河一帶）質量最佳，其為我國道地產區(qū)[5]，習稱“懷山藥”。當前，針對懷山藥的研究主要集中在其栽培技術、次生代謝產物以及多糖提取工藝等方面，而對其內生真菌的研究還比較薄弱。

近年來本研究組一直致力于懷山藥藥材品質以及內生真菌資源的開發(fā)與利用等研究。在前期研究中，通過高通量測序技術分析了懷山藥中內生真菌種群分布情況[6]，明確了懷山藥主要優(yōu)勢內生真菌的種群結構；對懷山藥可培養(yǎng)的內生真菌進行了系統(tǒng)分離和鑒定[7]；對懷山藥內生真菌的次生代謝產物開展了初步研究[8]，并發(fā)現一株懷山藥內生鐮孢屬真菌能夠分泌生長激素3-吲哚乙酸[9]。這些研究為探討懷山藥品質與內生真菌之間的聯系以及挖掘懷山藥內生真菌活性次生代謝產物提供了實驗基礎。

為了研究懷山藥內生真菌中活性次生代謝產物，進一步開發(fā)利用懷山藥內生真菌資源，本研究選取一株懷山藥內生真菌Alternariasp.L12 為研究對象，對其大米發(fā)酵物乙酸乙酯萃取部位的化學成分進行研究，以期發(fā)現結構新穎的活性物質。

1 儀器與試藥

Avance Ⅲ400 MHz 超導核磁共振儀（瑞士Bruker 公司）；Agilent 1100 分析型高效液相色譜 儀（美 國Agilent 公 司）；Amethyst C18-H 分析 柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）（美 國Sepax 公司）；Waters 1525 制備型高效液相色譜儀（美國Waters 公司）；ZORBAX SB-C18半制備柱（5 μm，9.4 mm×250 mm）（美國Agilent 公司）；SWCJ-2D 型雙人凈化工作臺（上海蘇京工業(yè)儀器）；GXZ 多段編程型智能培養(yǎng)箱（寧波江南儀器廠）；LDZX-30FBS 立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）。

薄層硅膠板GF254（青島鼎康硅膠有限公司）；柱層析硅膠（80 目，青島海洋化工廠）；Sephadex LH-20（美國通用）；RP-C8（日本富士）；色譜甲醇、乙腈（天津四友）；PDA、PDB 培養(yǎng)基（Solarbio 生物試劑有限公司）；石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、甲醇等試劑均為分析純（天津富宇）。

2 方法

懷山藥新鮮樣品采自道地產區(qū)焦作懷山藥種植基地，采用PDA 培養(yǎng)基從懷山藥中分離得到實驗菌種。通過5.8S rDNA-ITS 測序技術，對比GenBank 數據庫，將其鑒定為鏈格孢屬真菌（菌株編號為Alternariasp.L12）。因該菌株鑒定到屬水平，故列出其ITS 序列為TGGAACCTCTCGG GGTTACAGCCTTGCTGAATTATTCACCCTTGT CTTTTGCGTACTTCTTGTTTCCTTGGTGGGTT CGCCCACCACTAGGACAAACATAAACCTTTT GTAATTGCAATCAGCGTCAGTAACAAATTAAT AATTACAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTT CTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCG ATAAGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAAT CATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCTTT GGTATTCCAAAGGGCATGCCTGTTCGAGCGT CATTTGTACCCTCAAGCTTTGCTTGGTGTTGG GCGTCTTGTCTCTAGCTTTGCTGGAGACTCGC CTTAAAGTAATTGGCAGCCGGCCTACTGGTTT CGGAGCGCAGCACAAGTCGCACTCTCTATCA GCAAAGGTCTAGCATCCATTAAGCCTTTTTTT CAACTTTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATAC CCGCTGAACTTAAGCATTCAATAAGCGGAGG AA。

2.1 菌種的活化、培養(yǎng)與發(fā)酵

將保存于－80℃冰箱中的菌種于常溫下活化后，接種于已滅菌的PDA 培養(yǎng)基，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d 備用。然后將在PDA 培養(yǎng)基預培養(yǎng)的菌種接種到PDB 培養(yǎng)基（200 mL）中，在恒溫搖床中28 ℃、120 r·min－1條件下振蕩培養(yǎng)5 d，得真菌發(fā)酵種子液。在600 mL 的圓形發(fā)酵瓶中，加入100 g 大米和100 mL 去離子水，于121℃高壓滅菌20 min 后放冷備用。將已制備的種子液加入發(fā)酵瓶中（共20 瓶，每瓶約10 mL），在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)28 d，即得。

2.2 真菌發(fā)酵物的提取與分離

將Alternariasp.L12 大米發(fā)酵物用甲醇浸提，每次3 d，共提取3 次，抽濾。取濾液經減壓濃縮除去甲醇后，用乙酸乙酯萃取，萃取液減壓濃縮除去有機溶劑得到乙酸乙酯浸膏64.97 g。乙酸乙酯浸膏經硅膠柱層析，用不同比例二氯甲烷-丙酮（1∶0、2∶1、0∶1，V/V）依次洗脫，得到3個組分（Fr.1 ～3）。Fr.1 經硅膠柱層析、Sephadex LH-20 凝膠柱層析分離得到化合物3（7.4 mg）。將Fr.2 部分通過反相中壓柱色譜，用20%、40%、60%、80%、100%甲醇依次洗脫，得到5 個亞組分（Fr.2.1 ～2.5）。Fr.2.1（20%甲醇洗脫部分）經硅膠柱層析、凝膠柱層析和半制備HPLC 分離得到化合物8（11.7 mg）；Fr.2.2 經硅膠柱層析和半制備HPLC 分離得到化合物5（25.9 mg）、6（13.9 mg）、7（20.3 mg）；Fr.2.4 經硅膠柱層析、Sephadex LH-20 凝膠柱層析和半制備HPLC 分離得到化合物1（10.1 mg）、2（9.6 mg）、4（7.4 mg）。

3 結果

化合物1：棕色油狀物。1H-NMR（CD3OD，400 MHz）δH：5.35（1H，brs，H-9），4.04（1H，dd，J＝12.6，5.2 Hz，H-2），1.44（3H，s，Me-14），0.98（3H，d，J＝6.9 Hz，H-22），0.86（3H，d，J＝6.7 Hz，H-21）；13C-NMR（CD3OD，100 MHz）δC：199.7（C-1），72.3（C-2），31.1（C-3），28.9（C-4），174.1（C-5），88.4（C-7），44.5（C-8），119.8（C-9），149.9（C-10），46.0（C-11），16.2（C-12），106.8（C-13），23.4（C-14），34.0（C-15），36.5（C-16），26.1（C-17），34.5（C-18），36.9（C-19），68.5（C-20），17.2（C-21），20.9（C-22）。該化合物的核磁數據與文獻[10-11]報道基本一致，故鑒定為tricycloalternarene 1b（見圖1）。

化合物2：白色針晶（二氯甲烷-甲醇）。1H-NMR（DMSO-d6，400 MHz）δH：11.84（1H，s，7-OH），10.37（1H，s，3-OH），7.24（1H，d，J＝1.9 Hz，H-10），6.73（1H，d，J＝2.3 Hz，H-2），6.66（1H，d，J＝2.3 Hz，H-4），6.63（1H，d，J＝1.9 Hz，H-8），3.92（3H，s，H-12），2.74（3H，s，H-11）；13C-NMR（DMSO-d6，100 MHz）δC：138.9（C-1），118.1（C-2），159.0（C-3），102.1（C-4），164.6（C-7），99.6（C-8），166.6（C-9），103.9（C-10），25.5（C-11），56.3（C-12），153.1（C-4a），98.9（C-6a），138.3（C-10a），109.3（C-10b）。以上數據與文獻[12]報道基本一致，故鑒定為alternariol-9-O-monomethyl ether（見圖1）。

化合物3：白色無定形粉末。1H-NMR（CD3OD，400 MHz）δH：6.53（1H，d，J＝8.5 Hz，H-7），6.26（1H，d，J＝8.5 Hz，H-6），5.22（2H，dd，J＝15.2，7.6 Hz，H-22，H-23），3.77（1H，m，H-3），1.02（3H，d，J＝6.8 Hz，H-21），0.94（3H，d，J＝6.8 Hz，H-28），0.91（3H，s，H-19），0.89（3H，s，H-19），0.86（3H，overlap，H-27），0.84（3H，overlap，H-26）；13C-NMR（CD3OD，100 MHz）δC：34.5（C-1），29.5（C-2），65.6（C-3），36.8（C-4），82.1（C-5），135.4（C-6），130.3（C-7），79.3（C-8），51.3（C-9），36.4（C-10），20.0（C-11），39.3（C-12），44.4（C-13），51.7（C-14），23.0（C-15），28.4（C-16），56.2（C-17），11.9（C-18），17.2（C-19），39.7（C-20），20.2（C-21），135.4（C-22），132.1（C-23），42.9（C-24），33.0（C-25），18.7（C-26），19.0（C-27），16.8（C-28）。參考文獻[13]報道的波譜數據，鑒定為過氧麥角甾醇（見圖1）。

化合物4：淺黃色結晶（二氯甲烷-甲醇）。1H-NMR（DMSO-d6，400 MHz）δH：7.26（1H，d，J＝1.6 Hz，H-10），6.72（1H，d，J＝2.3 Hz，H-2），6.64（1H，d，J＝2.3 Hz，H-4），6.38（1H，d，J＝1.6 Hz，H-8），2.71（3H，s，H-11）；13C-NMR（DMSO-d6，100 MHz）δC：138.3（C-1），117.5（C-2），158.4（C-3），101.5（C-4），164.0（C-6），164.3（C-7），100.8（C-8），165.4（C-9），104.3（C-10），25.2（C-11），152.6（C-4a），97.3（C-6a），138.0（C-10a），108.9（C-10b）。以上數據與文獻[14]報道基本一致，故鑒定為alternariol（見圖1）。

化合物5： 白色針晶（甲 醇）。1H-NMR（CD3OD，400 MHz）δH：7.11（2H，d，J＝8.2 Hz，H-2，6），6.74（2H，d，J＝8.2 Hz，H-3，5），3.50（2H，s，H-7）；13C-NMR（CD3OD，100 MHz）δC：126.9（C-1），131.5（C-2，6），116.4（C-3，5），157.6（C-4），41.2（C-7），176.4（C-8）。以上數據與文獻[15]報道基本一致，故鑒定為對羥基苯乙酸（見圖1）。

化合物6： 白色結晶（甲 醇）。1H-NMR（CD3OD，400 MHz）δH：7.07 ～7.14（2H，overlap，H-4，H-6），6.77 ～6.80（2H，overlap，H-3，H-5），3.60（2H，s，H-7）；13C-NMR（CD3OD，100 MHz）δC：123.0（C-1），156.9（C-2），116.0（C-3），129.4（C-4），120.6（C-5），132.2（C-6），36.8（C-7），176.4（C-8）。以上核磁數據與文獻[16]報道的一致，故鑒定為鄰羥基苯乙酸（見圖1）。

化合物7： 無色結晶（甲 醇）。1H-NMR（CD3OD，400 MHz）δH：7.23 ～7.35（5H，m，H-2，3，4，5，6），3.61（2H，s，H-7）；13C-NMR（CD3OD，100 MHz）δC：136.2（C-1），130.5（C-2，6），129.6（C-3，5），128.0（C-4），42.1（C-7），175.8（C-8）。以上數據與文獻[17]報道基本一致，故鑒定為苯乙酸（見圖1）。

化合物8：白色結晶（甲 醇）。1H-NMR（CD3OD，400 MHz）δH：7.05（2H，d，J＝8.4 Hz，H-2，6），6.72（2H，d，J＝8.4 Hz，H-3，5），3.70（2H，t，J＝7.1 Hz，H-8），2.73（2H，t，J＝7.1 Hz，H-7）；13C-NMR（CD3OD，100 MHz）δC：131.2（C-1），131.0（C-2，6），114.7（C-3，5），156.9（C-4），39.6（C-7），64.7（C-8）。以上數據與文獻[18]報道基本一致，故鑒定為對羥基苯乙醇（見圖1）。

圖1 化合物1 ～8 的化學結構Fig 1 Chemical structure of compound 1 ～8

4 結論與討論

前期研究表明，懷山藥含有豐富的鏈格孢屬內生真菌。本研究首次對一株懷山藥鏈格孢屬內生真菌的次生代謝產物開展了化學成分研究，共分離得到8 個化合物，經鑒定均為已知化合物。其中化合物1 為混合萜類真菌毒素，化合物2 和4 為鏈格孢酚類真菌毒素，因此，在懷山藥飲片安全檢測中要引起重視。尤其是懷山藥藥材儲藏期間這些真菌毒素是否存在累積效應還需要進一步研究。另有文獻表明，化合物1、2 和4 還具有多種生物活性，如化合物1 對Lewis 肺癌細胞3LL 和人神經母細胞瘤SH-SY5Y 具有顯著的體外細胞毒活性[19]；化合物2 和4 對 KB 和KBv200 癌細胞具有顯著的細胞毒活性[20]。因此，不管是從食品安全的角度，還是從挖掘懷山藥鏈格孢屬內生真菌的活性次生代謝產物角度，該屬真菌都具有繼續(xù)深入研究的意義和價值。