張馨予，王勇，堯雪洲，楊彥斌

（1.云南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院肺病科，云南昆明650021；2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院腫瘤科，北京100020；3.云南中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心，云南昆明650500；4.云南省中醫(yī)醫(yī)院肺病科，云南昆明650021）

非小細(xì)胞肺癌是一類發(fā)生于肺部的惡性腫瘤，約占原發(fā)性肺癌總數(shù)的80%左右[1]?，F(xiàn)有研究認(rèn)為，細(xì)胞外基質(zhì)的降解在非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲與轉(zhuǎn)移過程中起著至關(guān)重要的作用，基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）便是其中重要的一類細(xì)胞外基質(zhì)降解酶[2-3]。MMPs能夠降解參與信號傳導(dǎo)的細(xì)胞外基質(zhì)中的多種成分，在惡性腫瘤中呈高表達(dá)，可破壞低于腫瘤細(xì)胞的組織屏障，在惡性腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移等病理生理過程中具有重要的影響作用[4-5]。目前，MMPs 家族已分離鑒別出20 余種以上，但在臨床研究中，以MMP1（matrix metalloproteinase 1，MMP1）最 為 常見，研究發(fā)現(xiàn)許多惡性腫瘤細(xì)胞的MMP1表達(dá)增多，且表達(dá)水平會(huì)隨著腫瘤的分期分級增加而上升[6-7]。由此可見，研究MMP1表達(dá)水平與惡性腫瘤的相關(guān)性，對指導(dǎo)臨床治療與腫瘤藥物研發(fā)具有重要意義。目前，非小細(xì)胞肺癌已進(jìn)入精準(zhǔn)治療時(shí)代，根據(jù)基因表達(dá)情況選擇科學(xué)有效的靶向治療藥物是當(dāng)下的研究重點(diǎn)。但目前對于MMP1基因異常表達(dá)在非小細(xì)胞肺癌中的研究成果較少，為此，本文應(yīng)用生物信息學(xué)方法，采用Oncomine 腫瘤芯片數(shù)據(jù)庫及癌細(xì)胞系百科全書（Cancer Cell LineEncyclopedia，CCLE）、Kaplan Meier Plotter 在線分析數(shù)據(jù)庫來探究MMP1在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞與正常細(xì)胞中的表達(dá)差異，以及MMP1與患者預(yù)后的相關(guān)性，以期能為此類疾病的預(yù)后分析與靶向腫瘤藥物研發(fā)提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫及軟件

研究采用Oncomine v4.5 腫瘤芯片數(shù)據(jù)庫、CCLE 在線分析數(shù)據(jù)、Kaplan Meier Plotter 在線分析數(shù)據(jù)庫分析MMP1在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)情況。

1.2 研究方法

Oncomine v4.5 數(shù)據(jù)庫資料的挖掘、篩選條件設(shè)定：（1）基因（gene）：基質(zhì)金屬蛋白酶1（MMP1）；（2）數(shù)據(jù)類型（data type）：mRNA；（3）分析類型（differential analysis）：癌癥vs.正常分析（cancer vs.normal Analysis）；（4）閾值（Threshold）：PVALUE=0.001，倍數(shù)變化（fold change）=2，基因排名（gene rank）=top10%。Kaplan Meier Plotter 在線分析數(shù)據(jù)庫資料的挖掘、篩選條件設(shè)定：（1）癌癥類型（cancer）：肺癌（lung cancer）；（2）基因符號（affy id/gene symbol）：MMP1；（3）組織學(xué)分類（histology）：腺癌（adenocarcinoma）或鱗狀細(xì)胞癌（squamous cell carcinoma)；（4）Cox回歸（Cox regression）：多元（multivariate）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

Oncomine 數(shù)據(jù)庫收集MMP1 在不同腫瘤中的表達(dá)指標(biāo)，篩選近20 年有關(guān)非小細(xì)胞肺癌中MMP1表達(dá)的研究，分析比較MMP1 在肺癌細(xì)胞組織與正常細(xì)胞組織中的表達(dá)差異；利用CCLE 在線數(shù)據(jù)庫分析MMP1基因在不同癌細(xì)胞系（40 類）的表達(dá)情況；并采用Kaplan Meier Plotter 在線數(shù)據(jù)庫進(jìn)行非小細(xì)胞癌患者的生存分析，以評價(jià)MMP1表達(dá)水平與患者預(yù)后的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 不同腫瘤中MMP1的表達(dá)結(jié)果分析

本次研究中，從Oncomine 數(shù)據(jù)庫中共收集到有關(guān)MMP1在多種類型腫瘤中表達(dá)水平的研究338項(xiàng)，其中有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）的研究結(jié)果共有62項(xiàng)，包括MMP1表達(dá)水平升高61 項(xiàng)，MMP1表達(dá)水平下降1項(xiàng)。見圖1所示：

2.2 MMP1在肺癌中的表達(dá)分析

圖1 不同腫瘤中MMP1的表達(dá)結(jié)果Figure 1 Expression of MMP1 in different tumors

通過對Oncomine 數(shù)據(jù)庫中近20 年（2001-2020）肺癌研究結(jié)果的篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)共有8個(gè)項(xiàng)目參與了MMP1在非小細(xì)胞肺癌（包括肺腺癌、鱗狀細(xì)胞肺癌）細(xì)胞組織與正常細(xì)胞組織中表達(dá)水平的研究，結(jié)果顯示MMP1在肺癌細(xì)胞中呈高表達(dá)，與正常細(xì)胞相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05），見表1。通過對這8 項(xiàng)研究的Meta 分析，顯示MMP1基因表達(dá) 差 異 中 位 數(shù) 數(shù) 值 為469.5，P值 為1.20×10-4，見圖2。

2.3 MMP1在肺癌細(xì)胞和正常細(xì)胞中的差異分析

提取Oncomine數(shù)據(jù)庫8項(xiàng)肺癌分析的MMP1表達(dá)數(shù)據(jù)，利用GraphPad Prism 5 軟件制作散點(diǎn)圖比較MMP1在肺癌細(xì)胞和正常細(xì)胞中的差異，8 項(xiàng)研究均顯示肺癌細(xì)胞中MMP1表達(dá)水平明顯高于正常細(xì)胞（P＜0.05），見圖3。

2.4 MMP1在不同癌組織細(xì)胞中的表達(dá)分析

利用CCLE 在線數(shù)據(jù)庫分析MMP1基因在不同癌細(xì)胞系（40類）的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，MMP1在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)值排名第23 位，處于中間位置，提示MMP1在非小細(xì)胞肺癌中有著比較高的表達(dá)，見圖4所示。

表1 8項(xiàng)肺癌分析的MMP1表達(dá)水平比較Table 1 Comparison of MMP1 expression levels in 8 lung cancer analysis

圖2 8項(xiàng)肺癌分析的MMP1表達(dá)水平比較Figure 2 Comparison of MMP1 expression levels in 8 lung cancer analysis

2.5 MMP1表達(dá)水平與非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后相關(guān)性分析

利用Kaplan Meier Plotter 在線數(shù)據(jù)庫進(jìn)一步分析了MMP1表達(dá)水平與患者預(yù)后的相關(guān)性，結(jié)果顯示MMP1表達(dá)水平對肺腺癌患者預(yù)后有顯著影響HR=1.53（1.21～1.94）（P=0.000 34）；但MMP1表達(dá)水平對鱗狀細(xì)胞肺癌患者預(yù)后無顯著影響HR=0.91（0.72～1.15）（P=0.43）。見圖5示。

3 討論

非小細(xì)胞肺癌發(fā)病率在我國一直居高不下，約占原發(fā)性肺癌總數(shù)的80%左右[1]，其中大多數(shù)患者確診時(shí)就已處于中晚期，治療難度大，且療效較差。近年來隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的長足發(fā)展以及基因靶向藥物的出現(xiàn)，使得非小細(xì)胞肺癌患者的治療及預(yù)后得到了明顯的改善，但患者的實(shí)際獲益仍遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于預(yù)期[8-9]。為進(jìn)一步提高肺癌患者的治療效果及預(yù)后，醫(yī)學(xué)界一直十分關(guān)注肺癌相關(guān)的分子生物學(xué)技術(shù)研究，經(jīng)過不斷的努力現(xiàn)已陸續(xù)發(fā)現(xiàn)ALK[10]、PD-L1[11-12]、PD-1[13]、ROS-1[14]、MMPs[15-17]等 肺 癌 驅(qū) 動(dòng)基因或免疫治療靶點(diǎn)，針對這些靶點(diǎn)研發(fā)腫瘤分子靶向藥物，極大地提高了肺癌患者的治療效果及生存質(zhì)量。

圖3 MMP1在肺癌細(xì)胞和正常細(xì)胞中的差異分析Figure 3 Differential analysis of MMP1 in lung cancer cells and normal cells

圖4 MMP1在不同癌組織細(xì)胞中的表達(dá)排行Figure 4 Expression of MMP1 in different cancer tissues

圖5 MMP1表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后相關(guān)性Figure 5 Correlation between MMP1 expression and prognosis of patients with NSCLC

目前MMPs家族分離鑒別出的成員共有26 個(gè)，將其依次編號為MMP1～MMP26。這些MMPs家庭成員又根據(jù)其作用底物及片斷同源性的差異分為6大類，包括：明膠酶、膠原酶、基質(zhì)溶解素、基質(zhì)降解素、furin 活化的MMP、其他分泌型MMP。其中，MMP1 作為MMPs的家族成員之一，歸為膠原酶一類，其在肺癌[18]、胃癌[19]、食管鱗癌[20]、人骨肉瘤[21]等多種惡性腫瘤細(xì)胞中呈高表達(dá)。MMP1的主要作用底物為纖維性膠原，其能通過降解細(xì)胞外基質(zhì)中的膠原纖維和明膠及改變細(xì)胞中的微環(huán)境，影響惡性腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移能力，作用于腫瘤發(fā)生的初始階段時(shí)會(huì)促使腫瘤的形成[22]。但目前醫(yī)學(xué)界對于MMP1的研究還局限于臨床病例分析，鮮有研究對MMP1表達(dá)水平進(jìn)行多種癌癥類型、多種亞型以及多樣本資料的科學(xué)統(tǒng)計(jì)分析。

本研究試著通過幾個(gè)收錄有龐大癌基因信息的在線數(shù)據(jù)庫，分析不同肺癌研究中MMP1的表達(dá)差異。其中，Oncomine 數(shù)據(jù)庫是目前世界上最大的癌基因芯片數(shù)據(jù)庫和整合數(shù)據(jù)挖掘平臺，擁有最全的癌癥突變譜、基因表達(dá)數(shù)據(jù)以及相關(guān)的臨床信息，可用于發(fā)現(xiàn)新的生物標(biāo)記物或新的治療靶點(diǎn)[23]。本次研究通過對Oncomine 數(shù)據(jù)庫MMP1與非小細(xì)胞肺癌相關(guān)數(shù)據(jù)信息的統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，MMP1在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)明顯增多，與正常細(xì)胞組織比較有明顯差異。臨床相關(guān)研究也發(fā)現(xiàn)，鱗狀細(xì)胞肺癌中MMP1的表達(dá)水平較正常細(xì)胞明顯升高，認(rèn)為其可能參與了鱗狀細(xì)胞肺癌的侵襲與轉(zhuǎn)移[24]。MMP1是一類Zn2+依賴的細(xì)胞外蛋白水解酶，可以降解Ⅰ型膠原與Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型纖維膠原[25]。在肺惡性腫瘤細(xì)胞中產(chǎn)生的MMP1，經(jīng)由旁分泌作用于癌基質(zhì)，從而引起了腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移。因此認(rèn)為，MMP1是非小細(xì)胞肺癌的重要分子標(biāo)記物。

美國Broad 研究所、Dana-Farber 癌癥研究所和Novartis 生物醫(yī)學(xué)研究所的多個(gè)課題組于2012 年合作完成了“癌細(xì)胞系百科全書”（CCLE）計(jì)劃，對覆蓋30多種組織來源的947種人類癌細(xì)胞系進(jìn)行了大規(guī)模深度測序，整合了DNA 突變、基因表達(dá)和染色體拷貝數(shù)等遺傳信息[26]。本研究采用CCLE 在線分析數(shù)據(jù)庫，進(jìn)一步分析了MMP1基因在不同癌細(xì)胞系（40類）的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，MMP1在非小細(xì)胞肺癌中有著較高的表達(dá)，表達(dá)值排名第23 位，這一結(jié)果與Oncomine 數(shù)據(jù)庫研究結(jié)果也比較相符，提示MMP1檢測在非小細(xì)胞肺癌的療效及預(yù)后評估中有著一定的應(yīng)用價(jià)值。Kaplan Meier plotter 在線數(shù)據(jù)庫主要用作惡性腫瘤的生存分析，該數(shù)據(jù)庫包含5萬多個(gè)與惡性腫瘤患者預(yù)后相關(guān)的基因信息。本研究通過Kaplan Meier plotter 數(shù)據(jù)庫了解MMP1與非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后的相關(guān)性，結(jié)果顯示，MMP1表達(dá)水平對肺腺癌患者預(yù)后有顯著影響，但對鱗狀細(xì)胞肺癌患者預(yù)后無顯著影響，提示MMP1檢測對肺腺部患者預(yù)后評估有重要意義。

綜上所述，MMP1在非小細(xì)胞癌中的表達(dá)增多，與正常細(xì)胞中的表達(dá)水平比較有明顯差異；此外，MMP1表達(dá)水平與肺腺癌患者的預(yù)后存在顯著相關(guān)性，可以作為非小細(xì)胞肺癌惡性程度的標(biāo)志物之一。研究為腫瘤分子靶向藥物研發(fā)及臨床科學(xué)治療提供了理論依據(jù)。