卓超洲，沈觀樂，雷朝君，余瑞林，梁杰，高嫵媚，魏艾

（深圳市龍華區(qū)人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，廣東深圳518109）

支氣管哮喘是一種常見的疾病，我國(guó)成年人患病率約為1.24%[1]。并且隨著工業(yè)化發(fā)展，哮喘的發(fā)病率也在逐年上升[2]。哮喘的發(fā)病是多種炎癥細(xì)胞（嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞等）共同參與、相互作用的結(jié)果[3]。白細(xì)胞介素家族是一類與免疫調(diào)節(jié)相關(guān)的細(xì)胞因子，在炎癥反應(yīng)中起重要作用。白細(xì)胞介素家族至少有40個(gè)成員，IL4則是其中一個(gè)[4]。目前已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)，哮喘患者的血清中IL4 水平顯著上升，可能與氣道炎癥相關(guān)[5]。但是目前對(duì)IL4 在哮喘中的調(diào)控機(jī)制尚不清楚，因此在本研究中，通過對(duì)GEO 數(shù)據(jù)庫中哮喘患者的轉(zhuǎn)錄組及甲基化數(shù)據(jù)進(jìn)行挖掘，探究了IL4 及其相關(guān)基因在哮喘發(fā)生中的作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)IL4可能是治療哮喘的潛在靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源及預(yù)處理

本研究所用到的測(cè)序數(shù)據(jù)均來源于公共數(shù)據(jù)庫——GEO（Gene Expression Omnibus，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）。哮喘患者的mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)集來源于：GSE27011和GSE40888[6-7]。DNA甲基化數(shù)據(jù)來源于GSE40736[8]。miRNA 表達(dá)數(shù)據(jù)來源于GSE142237。LncRNA表達(dá)數(shù)據(jù)來源于GSE106230[9]。

1.2 差異表達(dá)lncRNA和miRNA分析

使用GSE106230 數(shù)據(jù)篩選哮喘患者顯著高表達(dá)的lncRNA，GSE142237 數(shù)據(jù)集篩選miRNA 顯著低表達(dá)的基因。差異表達(dá)分析用R 語言（version 3.6）的limma 包[10]，log2foldchange＞1，P＜0.05 的lncRNA被認(rèn)為是顯著高表達(dá)。log2foldchange＜-1，P＜0.05的miRNA被認(rèn)為是顯著低表達(dá)。

1.3 CeRNA網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

IL4 與miRNA 互作信息來源于miRWalk（http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/），miRNA 與lncRNA互作信息來源于StarBase3（http://starbase.sysu.edu.cn/）。IL4 相關(guān)的ceRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖用Cytoscape 進(jìn)行展示[11]。

1.4 基因富集分析

將GSE27011 數(shù)據(jù)集中的哮喘患者按照IL4 的表達(dá)量進(jìn)行從高到低排序。按照IL4 表達(dá)量的中位數(shù)將患者分為IL4 高表達(dá)組和低表達(dá)組。本研究用GSEA（version，4.0.3）軟件對(duì)表達(dá)矩陣進(jìn)行分析，采用c2.cp.kegg.v7.1.symbols.gmt 數(shù)據(jù)集，按照缺省參數(shù)設(shè)置進(jìn)行基因富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA），設(shè)定隨機(jī)組合次數(shù)為1 000，|NES|＞1，P＜0.05的基因集被認(rèn)為是顯著富集的。

1.5 基因功能分析

本研究將與IL4 呈正相關(guān)和負(fù)相關(guān)的基因分別進(jìn)行基因本體（GO）和京都基因與基因組百科全書（KEGG）分析。GO 分析用R 語言（version 3.6）的clusterProfiler 包[12]。KEGG 分 析 使 用 的 在 線 分 析KOBAS3（http://kobas.cbi.pku.edu.cn/）。P＜0.05 被認(rèn)為是顯著富集的功能或者通路。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用R 語言（version 3.6）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。哮喘患者和正常人的IL4 表達(dá)量及甲基化水平比較采用獨(dú)立樣本秩和檢驗(yàn)?；虮磉_(dá)之間的關(guān)系采用Pearson 相關(guān)性分析。P＜0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GEO數(shù)據(jù)樣本統(tǒng)計(jì)

GSE27011包含36例哮喘患者和18例正常人的白細(xì)胞mRNA 表達(dá)數(shù)據(jù)。GSE40888 包含65 例哮喘患者和40 例正常人的外周血單核細(xì)胞mRNA 表達(dá)數(shù)據(jù)。GSE40736包含97例哮喘患者和97例正常人的外周血單核細(xì)胞DNA 甲基化數(shù)據(jù)。GSE142237包含8 例哮喘患者和4 例正常人的支氣管上皮miRNA表達(dá)數(shù)據(jù)。GSE106230包含9例哮喘患者和3例正常人的外周血lncRNA表達(dá)數(shù)據(jù)。

2.2 喘患者和正常人IL4差異比較

通過將哮喘患者和正常人的IL4 表達(dá)水平進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)患者中IL4 顯著高表達(dá)（P=0.042 8，圖1A）。哮喘患者和正常人的IL4 DNA 甲基化水平進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)患者中IL4 DNA 甲基化水平顯著降低（P=0.028 3，圖1B）。

表1 數(shù)據(jù)集及樣本分布情況Table 1 Data set and samples distribution

2.3 CeRNA網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

ceRNA 網(wǎng) 絡(luò) 中，lncRNA 與mRNA 是 正 調(diào) 控 關(guān)系，miRNA與mRNA是負(fù)調(diào)控關(guān)系[13]，因此本研究利用GSE142237 數(shù)據(jù)集篩選了在哮喘患者中顯著下調(diào)的miRNA（50 個(gè)）。利用GSE106230 數(shù)據(jù)集篩選了在哮喘患者中顯著上調(diào)的lncRNA（26 個(gè)）。通過預(yù)測(cè)IL4 與miRNA 的互作關(guān)系、miRNA 與lncRNA的互作關(guān)系，最終得到一個(gè)包含4個(gè)miRNA、6個(gè)lncRNA 和IL4 的ceRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（圖2），表2 展示了這些lncRNA和miRNA的上調(diào)下調(diào)情況。

2.4 基因富集（GSEA）分析

圖1 哮喘患者和正常人IL4差異比較結(jié)果。Figure 1 Difference of IL 4 between asthmatic patients and normal people

GSEA 分析發(fā)現(xiàn)有19 條通路顯著富集在IL4 高表達(dá)患者中。如表3所示，高IL4患者富集的通路主要涉及代謝類通路和一些受體信號(hào)通路。對(duì)排名為前2的通路進(jìn)行了展示（圖3）。

表2 CeRNA網(wǎng)絡(luò)中miRNA和lncRNA差異表達(dá)分析結(jié)果Table 2 Differential expression analysis of miRNA and lncRNA in ceRNA network

2.5 IL4相關(guān)基因篩選

利用GSE27011 和GSE40888 兩個(gè)數(shù)據(jù)集中的哮喘患者基因表達(dá)矩陣，分別計(jì)算IL4 與其他基因表達(dá)的相關(guān)性。其中GSE27011 篩選到1 584 個(gè)顯著與IL4表達(dá)相關(guān)的基因（816個(gè)正相關(guān)，768個(gè)負(fù)相關(guān)）。GSE40888 篩選到7 690 顯著與IL4 表達(dá)相關(guān)的基因（5 119 個(gè)正相關(guān)，2 571 個(gè)負(fù)相關(guān)）。圖4 和圖5 分別對(duì)GSE27011 和GSE40888 2 個(gè)數(shù)據(jù)集相關(guān)性最強(qiáng)的前4 個(gè)基因進(jìn)行了展示。將2 個(gè)數(shù)據(jù)集篩選到的相關(guān)基因取交集，一共得到210 個(gè)基因（144正相關(guān)，66負(fù)相關(guān)，圖6）。

表3 IL4高表達(dá)患者顯著富集的通路Table 3 Pathways enriched by IL4-overexpression patients

圖3 IL4高表達(dá)患者富集的top2通路Figure 3 Top 2 pathways enriched by IL4-overexpression patients

2.6 IL4功能及通路分析

選取與IL4 正相關(guān)的基因集進(jìn)行GO 和KEGG富集分析，以此來分析IL4 表達(dá)所促進(jìn)的功能（圖7A）或通路（圖7C）。在分子功能（biological process，BP）方面，主要與一些蛋白結(jié)合或者磷酸酶活性有關(guān)，例如：蛋白激酶B結(jié)合、激活素結(jié)合、跨膜受體蛋白酪氨酸磷酸酶活性、跨膜受體蛋白磷酸酶活性等；在細(xì)胞成分（cellular component，CC）方面，參與構(gòu)成一些細(xì)胞器，例如反式高爾基網(wǎng)囊泡的網(wǎng)格蛋白外套、跨高爾基網(wǎng)絡(luò)轉(zhuǎn)運(yùn)囊泡膜、內(nèi)溶酶體膜等；在生物學(xué)過程（molecular function，MF）方面，主要參與一些通路的調(diào)節(jié)作用，如：輔助性T-helper2 細(xì)胞分化的調(diào)控、前列腺素生物合成過程的調(diào)控、谷氨酸分泌的正調(diào)節(jié)等。在KEGG 通路方面，主要參與一些代謝通路，如甘油磷脂代謝、花生四烯酸代謝；一些重要物質(zhì)的合成，如：氨酰-tRNA 生物合成、甾體激素生物合成、泛酸和輔酶A 生物合成和初級(jí)膽汁酸生物合成；另外還參與一寫信號(hào)傳導(dǎo)通路，如：mTOR 信號(hào)通路、幽門螺桿菌感染中的上皮細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和甲狀腺激素信號(hào)通路。選取與IL4 負(fù)相關(guān)的基因集進(jìn)行富集分析，以此來分析IL4 表達(dá)所抑制的功能（圖7B）或通路（圖7D）。在分子功能方面，主要與一些蛋白結(jié)合或者磷酸酶活性有關(guān)，如泛素化類修飾依賴蛋白質(zhì)結(jié)合、長(zhǎng)春新堿結(jié)合、泛素-泛素連接酶活性、磷脂酰肌醇磷酸激酶活性和NAD 依賴性組蛋白脫乙酰酶活性（H3-K14 特異性）等。在細(xì)胞成分方面，參與構(gòu)成DNA 復(fù)制因子A 復(fù)合體、核酸復(fù)制顆粒、樹突棘膜、黑素體膜和殼質(zhì)體等。在生物學(xué)過程方面，主要參與一些通路的調(diào)節(jié)作用，如：eIF2α 磷酸化對(duì)翻譯起始的調(diào)控、ATF6 介導(dǎo)的未折疊蛋白反應(yīng)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白輸出的負(fù)調(diào)控和蛋白質(zhì)多泛素化的負(fù)調(diào)控等。在KEGG 通路方面，主要參與一些基本生命活動(dòng)的通路，如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白質(zhì)加工、醛固酮合成與分泌、泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)水解和加壓素調(diào)節(jié)的水重吸收和粘蛋白型O-聚糖生物合成等。

圖4 GSE27011數(shù)據(jù)集中與IL4相關(guān)性最強(qiáng)的前四個(gè)基因。Figure 4 Strongest four genes correlated with IL4 in GSE27011 data set

圖5 GSE40888數(shù)據(jù)集中與IL4相關(guān)性最強(qiáng)的前4個(gè)基因。Figure 5 Strongest four genes correlated with IL4 in GSE40888 data set

圖6 GSE27011和GSE40888兩個(gè)數(shù)據(jù)集中與IL4呈正相關(guān)和負(fù)相關(guān)基因交集Figure 6 Intersection of positive and negative correlation genes with IL4 between GSE27011 and GSE40888 data sets

圖7 基因本體（GO）和京都基因與基因組百科全書（KEGG）分析Figure 7 Gene Ontology(GO)and Kyoto Encyclopedia of Genes(KEGG)analysis

3 討論

DNA 的甲基化修飾可引起染色質(zhì)結(jié)構(gòu)改變，從而調(diào)控基因的表達(dá)，在疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用[14]。本研究中，通過比較哮喘患者和正常人的IL4 基因位點(diǎn)上DNA 甲基化水平，發(fā)現(xiàn)哮喘患者的IL4甲基化水平顯著降低，而IL4在哮喘患者中的表達(dá)水平顯著上升，因此推測(cè)，IL4 DNA 甲基化水平的降低促進(jìn)了IL4的表達(dá)。

目前越來越多研究表明，lncRNA 可以與mRNA競(jìng)爭(zhēng)性與miRNA 結(jié)合，從而調(diào)控mRNA 的表達(dá)[13]。這類調(diào)控機(jī)制的失衡可能導(dǎo)致疾病的發(fā)生。因此，本研究建立了IL4 相關(guān)的ceRNA 網(wǎng)絡(luò)，以探究相關(guān)的調(diào)控機(jī)制。網(wǎng)絡(luò)中的OIP5-AS1 已被報(bào)道可以作為哮喘的診斷標(biāo)記物[15]，hsa-miR-125b-5p 也被報(bào)道與IL4的表達(dá)具有一定的相關(guān)性[16]。網(wǎng)絡(luò)中l(wèi)ncRNA和miRNA 的調(diào)控可能導(dǎo)致了哮喘患者IL4 的異常表達(dá)。

GSEA 分析發(fā)現(xiàn)高IL4 表達(dá)水平的患者富集的大多為代謝相關(guān)的通路，其中糖代謝、亞油酸、花生四烯酸、谷胱甘肽及各種氨基酸代謝已被報(bào)道過在哮喘患者中及健康對(duì)照中存在顯著差異[17]。

通過對(duì)IL4 正相關(guān)的mRNA 進(jìn)行通路分析，發(fā)現(xiàn)這些mRNA 所在的一些通路與哮喘發(fā)生相關(guān)，例如：花生四烯酸代謝通路被發(fā)現(xiàn)與哮喘急性發(fā)作相關(guān)[18]；內(nèi)吞作用，細(xì)胞膜上重要結(jié)構(gòu)蛋白caveolin-1參與細(xì)胞的內(nèi)吞作用，該蛋白也被報(bào)道可作用于中氣道平滑肌細(xì)胞，與哮喘的發(fā)病相關(guān)[19]；幽門螺桿菌感染中的上皮細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，幽門螺桿菌感染被發(fā)現(xiàn)與兒童哮喘發(fā)病呈正相關(guān)性[20]；甘油磷脂代謝通路，甘油磷脂被發(fā)現(xiàn)在哮喘組小鼠與對(duì)照組小鼠有顯著差異[21]；mTOR 信號(hào)通路在哮喘鼠模型中可參與肺組織炎性浸潤(rùn)和氣道重塑等病理過程而介導(dǎo)哮喘的發(fā)生[22]；甲狀腺激素信號(hào)通路，甲狀腺激素被報(bào)道可增強(qiáng)哮喘患者的氣道平滑肌重構(gòu)[23]。對(duì)于與IL4 呈負(fù)相關(guān)的mRNA，其富集的通路，也與哮喘相關(guān)，例如：自噬，自噬在支氣管哮喘的發(fā)病過程中可能既有保護(hù)作用，又有損害作用[24]；泛素介導(dǎo)的蛋白水解通路，paucigranulocytic 哮喘中發(fā)現(xiàn)一些顯著高甲基化的基因，這些基因富集于泛素介導(dǎo)的蛋白水解通路[25]。

本研究通過應(yīng)用生物信息學(xué)方法分析哮喘患者和正常人的轉(zhuǎn)錄組及甲基化數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)IL4 在哮喘中顯著高表達(dá)，并探究了其異常表達(dá)的調(diào)控機(jī)制，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)IL4 的高表達(dá)可能導(dǎo)致與哮喘相關(guān)的代謝異常。另外本研究還挖掘出與IL4 表達(dá)相關(guān)的mRNA，發(fā)現(xiàn)這些mRNA 可能通過調(diào)控一些相關(guān)通路參與哮喘的發(fā)病。本研究從多組學(xué)多角度研究了IL4 的異常表達(dá)及其相關(guān)基因?qū)ο恼{(diào)控作用，研究顯示IL4可能可以作為哮喘治療的靶點(diǎn)。