黃重銘，彭慧婷，林曉彤，曹洋

（1.廣州中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院，廣東廣州510405；2.廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，廣東廣州510405）

在全球范圍內(nèi)，肺癌仍是發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤[1]。肺癌的主要臨床表現(xiàn)為咳嗽、血痰、胸悶胸痛、氣促、發(fā)熱等[2]。由于癥狀缺乏特異性，常與呼吸系統(tǒng)的癥狀相似，患者多不重視，因此確診時往往已失去根治性手術(shù)切除的機會[3]。目前肺癌的治療以手術(shù)、放化療、靶向治療、免疫治療為主，可并發(fā)骨髓抑制、神經(jīng)毒性、肝腎功能損害、皮疹、間質(zhì)性肺炎等不良反應，整體治療效果仍不理想[2,4]。隨著研究的不斷深入，中醫(yī)藥在治療肺癌方面逐漸顯示出獨特的優(yōu)勢。研究表明，中醫(yī)藥在抑制肺癌的增殖和轉(zhuǎn)移，改善放化療及靶向治療的毒副作用，提高患者的生存質(zhì)量，延長生存期等方面發(fā)揮重要作用[5]。

貓爪草是毛茛科植物小毛茛（Ranunculus ternatusThunb.）的干燥塊根，廣泛分布于河南、安徽、浙江、江蘇等地。貓爪草的藥用歷史較短，最早收錄于《中藥材手冊》，1977 年起正式載入《中華人民共和國藥典》[6]。其味甘、辛，性溫，歸肝、肺經(jīng)，具有化痰消腫、解毒散結(jié)的功效?，F(xiàn)代藥理學研究表明，貓爪草具有抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫活性、抗氧化、抗感染等藥理作用[7]，是治療肺癌的常用藥物之一。李穗暉[8]等采用仙魚湯（由仙鶴草、魚腥草、貓爪草、山海螺、天冬、山慈菇、浙貝母、萊菔子、守宮、枳殼、黨參等組成）治療中晚期原發(fā)性支氣管肺癌，結(jié)果顯示治療后免疫功能改善。申剛磊[9]等通過電子病歷系統(tǒng)提取和分析某三甲中醫(yī)院1 175 張治療肺癌的有效處方，中藥頻次統(tǒng)計提示貓爪草是排名前10的高頻藥物。但由于中藥治療腫瘤具有“多成分-多靶點-多通路”的特點，貓爪草治療肺癌的作用機制尚不明確。

近年興起的網(wǎng)絡藥理學基于系統(tǒng)生物學理論，綜合藥物、靶點與疾病之間的復雜網(wǎng)絡關(guān)系，用于分析和預測藥物的作用機制[10-11]。本研究運用網(wǎng)絡藥理學的方法，篩選貓爪草治療肺癌的活性成分和關(guān)鍵靶點，并對貓爪草治療肺癌的作用機制進行預測和分析，既為貓爪草的臨床應用提供一定理論依據(jù)，也為對其更深入的研究提供思路和借鑒。

1 材料與方法

1.1 貓爪草活性成分的篩選

采用TCMSP 數(shù)據(jù)庫（http://tcmspw.com/tcmsp.php）檢索并收集貓爪草的化學成分。選取符合篩選條件OB≥30%，DL≥0.18 的化學成分作為潛在活性成分。查閱相關(guān)文獻資料，收集具有抗癌活性但因不符合篩選條件而被刪除的化學成分。

1.2 貓爪草活性成分作用靶點的收集

將“1.1”項下篩選獲得的貓爪草潛在活性成分，通過Pubchem 數(shù)據(jù)庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）檢索其化學結(jié)構(gòu)，并保存為Smiles 格式。將上述文件分別導入Swiss target prediction 平臺（http://swisstargetprediction.ch/），獲取活性成分作用靶點及靶點類型歸屬。

1.3 疾病靶點的收集與“活性成分-靶點”網(wǎng)絡的構(gòu)建

使 用DisGeNET 數(shù) 據(jù) 庫（http://www.disgenet.org/）和OMIM 數(shù)據(jù)庫（https://omim.org/）收集肺癌相關(guān)靶點并去重合并。使用uniprot 數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/）分別對藥物潛在活性成分靶點和疾病靶點進行標準化。利用Draw venn diagram（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）對活性成分靶點和疾病靶點進行匹配映射，獲取共同靶點，并繪制韋恩圖。采用Cytoscape3.7.0 構(gòu)建“活性成分-靶點”網(wǎng)絡，分析活性成分和靶點網(wǎng)絡，并篩選潛在關(guān)鍵活性成分。

1.4 蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡的構(gòu)建

將共同靶點導入String 數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/），限定研究物種為人類，將最低相互作用分值設置為“higest confident 0.9”，獲取高置信度的PPI網(wǎng)絡關(guān)系。將分析結(jié)果導入Cytoscape3.7.0 進行可視化與網(wǎng)絡拓撲分析。自由度（degree）反映網(wǎng)絡中與該節(jié)點直接相互作用的節(jié)點的數(shù)目。自由度越高，節(jié)點在網(wǎng)絡中的作用越重要。根據(jù)自由度對關(guān)鍵靶點進行篩選。

1.5 分子對接驗證

從TCMSP 數(shù)據(jù)庫中查詢“1.3”項下篩選獲得的關(guān)鍵活性成分，并保存為mol2格式。使用Openbabel 2.4.1 將活性成分的靶點轉(zhuǎn)換為sdf 格式。在PDB 數(shù)據(jù)庫（http://www.rcsb.org/）中查詢并下載核心靶點的3D 結(jié)構(gòu)。使用AutoDockTools 對靶點蛋白進行加氫、去水等預處理。運行AutoDockTools 對活性成分和靶點蛋白進行對接，以最低結(jié)合能作為分子對接的結(jié)果。結(jié)合相關(guān)文獻，結(jié)合能＜0 提示活性成分與靶點蛋白能發(fā)生自發(fā)結(jié)合，結(jié)合能≤5 提示有較強的結(jié)合能力[12]。

1.6 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

DAVID（https://david.ncifcrf.gov/）是一個集成生物知識庫和分析工具的數(shù)據(jù)庫，能夠系統(tǒng)地從給定的基因或蛋白質(zhì)列表中分析生物學意義[13]。將共同靶點上傳至DAVID 數(shù)據(jù)庫，GO 分析時選擇生物過程（BP）、細胞組分（CC）、分子功能（MF）3 個模塊進行功能注釋，通路分析選擇KEGG 模塊。將分析結(jié)果分別編排至Excel 文件中，以P＜0.01 對結(jié)果進行篩選并按照顯著程度由高到低排序。使用Omic-Share 平臺（https://www.omicshare.com/）將排名前20的KEGG分析結(jié)果以氣泡圖的形式展現(xiàn)。

2 結(jié)果

2.1 貓爪草的活性成分

通過檢索TCMSP 數(shù)據(jù)庫，共收集到貓爪草的化學成分79 種。按OB≥30%、DL≥0.18 標準進一步篩選，得到貓爪草潛在活性成分12種。查閱相關(guān)文獻發(fā)現(xiàn)，棕櫚酸（palmitic acid）的OB 值和DL 值雖然不滿足篩選條件，但已被證實具有較好抗癌活性，是貓爪草抗腫瘤的主要化學成分之一，因此將該化學成分也納入其中，最終獲得貓爪草潛在活性成分13種，見表1。

2.2 靶點收集與基因映射

通過Swiss target prediction 平臺對貓爪草潛在活性成分作用靶點進行預測，共得到預測靶點294個，并通過Uniprot 標準化。使用DisGeNET 數(shù)據(jù)庫和OMIM（https://omim.org/）數(shù)據(jù)庫收集肺癌相關(guān)靶點，分別獲得肺癌相關(guān)靶點2 449 個和200 個，去重合并后導入uniprot 標準化，最終獲取肺癌靶點2 303個。將貓爪草294個活性成分靶點和2 303個肺癌靶點進行匹配映射并繪制韋恩圖，見圖1。獲取共同靶點121 個，這些靶點是貓爪草活性成分治療肺癌的潛在靶點。

2.3 “活性成分-靶點”網(wǎng)絡構(gòu)建與分析

將匹配映射獲得的121個潛在靶點及其對應的活性成分信息導入Cytoscape3.7.0，構(gòu)建“活性成分-靶點”網(wǎng)絡，見圖2。圖2 表明，存在多種成分對應1 個靶點或1 種成分對應多個靶點的現(xiàn)象，體現(xiàn)中藥多成分、多靶點協(xié)同作用的特點[14]。網(wǎng)絡與共同靶點直接相連的貓爪草活性成分有8 種，提示這些化學活性成分具有潛在治療肺癌作用。網(wǎng)絡拓撲分析結(jié)果顯示，能同時與30個及以上靶點相連的活性成分（degree 值≥30）有3 種，包括7-O-甲基毛綱草酚（7-O-methyleriodictyol）（degree=50），鄰苯二甲酸正辛酯（truflex OBP）（degree=44）和棕櫚酸（palmitic acid）（degree=30），可能是貓爪草治療肺癌的關(guān)鍵活性成分。

表1 貓爪草活性成分Table 1 Active components of Ranunculi Ternati Radix

圖1 貓爪草活性成分作用靶點與肺癌相關(guān)靶點交集映射圖Figure 1 Intersection map of targets of active components of Ranunculi Ternati Radix and lung cancer related targets

2.4 PPI網(wǎng)絡的構(gòu)建與分析

通過String 數(shù)據(jù)庫得到蛋白互作網(wǎng)絡關(guān)系，并使用Cytoscape3.7.0 對PPI 網(wǎng)絡進行可視化，見圖3。圖中共包含90 個節(jié)點，277 條連線。以節(jié)點的大小和顏色的深淺反映degree 值的大小。節(jié)點越大、顏色越深，對應的degree值越大，則該節(jié)點在網(wǎng)絡中的地位越重要。經(jīng)計算得網(wǎng)絡平均degree 值為6.16，以大于平均degree 值的2 倍為條件對PPI 網(wǎng)絡進行二次篩選[15]，最終獲得7 個關(guān)鍵靶點，見表2。這些關(guān)鍵靶點可能在貓爪草治療肺癌中發(fā)揮重要作用，其蛋白類型以激酶為主。

2.5 分子對接驗證

將篩選得到的7 個關(guān)鍵靶點與3 種關(guān)鍵活性成分進行分子對接，見表3。由表3 可知，每1 個靶點蛋白至少可與1種關(guān)鍵活性成分較好結(jié)合，3種活性成分均能與大部分關(guān)鍵靶點較好結(jié)合。結(jié)果表明，貓爪草的活性成分可以對核心靶點發(fā)揮調(diào)控作用。

2.6 GO功能富集分析

GO 分析獲得P＜0.01 的條目共56 條，其中生物過程（BP）相關(guān)條目33 條，主要涉及轉(zhuǎn)錄、凋亡過程的負調(diào)控、ERK1 和ERK2 級聯(lián)的正調(diào)節(jié)、細胞增殖調(diào)控、細胞周期阻滯的負調(diào)控、蛋白質(zhì)自磷酸化等方面；細胞組分（CC）相關(guān)條目9 條，主要富集在細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶全酶復合物、細胞表面、細胞質(zhì)、質(zhì)膜、胞漿等。分子功能（MF）相關(guān)條目14 條，主要富集在類固醇激素受體、RNA 聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子活性、配體激活序列特異性DNA 結(jié)合、蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、藥物結(jié)合等。按照顯著程度排列對生物過程、細胞組分、分子功能的部分條目信息進行展示，見表4。

2.7 KEGG通路富集分析

圖2 貓爪草活性成分和交集靶點網(wǎng)絡關(guān)系的構(gòu)建Figure 2 Construction of network relationship between active components of Ranunculi Ternati Radix and intersection targets

圖3 貓爪草治療肺癌相關(guān)靶點PPI網(wǎng)絡圖Figure 3 PPI network of related targets in the treatment of lung cancer with Ranunculi Ternati Radix

根據(jù)P＜0.01 共篩選出62 條KEGG 通路。按照顯著程度選取排名前20位的通路進行分析，并通過Omicshare 平臺進行可視化，見圖4。結(jié)合相關(guān)文獻，推測貓爪草活性成分靶點可能通過作用于缺氧誘導因子-1（HIF-1）信號轉(zhuǎn)導通路、抑癌基因p53 信號通路、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）信號通路、磷脂酰肌醇3 激酶/蛋白激酶B（PI3K-Akt）信號通路這4條通路發(fā)揮治療肺癌的作用。由于PI3K-Akt 通路是HIF-1、p53、VEGF 等通路的上游信號通路，且PI3K-Akt 通路富集了較多的貓爪草作用靶點，因此推測PI3K-Akt 信號通路是貓爪草治療肺癌的關(guān)鍵通路。見圖5。

3 討論

本研究共收集貓爪草相關(guān)活性成分共13 種。研究表明，棕櫚酸是貓爪草抗腫瘤的主要活性成分之一，能夠通過誘導細胞凋亡，抑制人肺癌A549 細胞株的增殖。藥代動力學研究表明，棕櫚酸靜脈注射后具有明顯的肺組織靶向性，在肺組織的濃度顯著高于其他組織中的藥物濃度[16]。此外，7-O-甲基毛綱草酚和鄰苯二甲酸正辛酯在“活性成分-靶點”網(wǎng)絡中同屬于關(guān)鍵活性成分，但目前相關(guān)研究較少，可為抗癌中藥單體的研發(fā)提供新線索和研究方向。

肺癌的發(fā)生與多種驅(qū)動基因密切相關(guān)，這些驅(qū)動基因同時也是藥物作用的靶點[2]。表皮生長因子受體（EGFR）和磷脂酰肌醇-3-激酶（PIK3CA）是PPI網(wǎng)絡的關(guān)鍵靶點。EGFR 是肺腺癌常見驅(qū)動基因，其突變可導致酪氨酸激酶異常持續(xù)活化，造成細胞不受控生長而發(fā)生癌變，目前表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（EGFR-TKIs）治療EGFR 敏感突變已經(jīng)取得良好的效果[17]。分子對接結(jié)果表明，EGFR與貓爪草多種關(guān)鍵成分有較好的結(jié)合活性。貓爪草能否在EGFR-TKIs 靶向治療中起協(xié)同增效作用、能否對EGFR 的表達與突變起一定的抑制作用，進而抑制肺癌的進展，值得進一步研究。PIK3CA 作為肺鱗癌較常見的驅(qū)動基因[18]，其擴增可以激活PI3K-AKT 信號通路，導致細胞過度增殖，增強細胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力[19-20]，由于PIK3CA 激活突變對PI3K通路抑制劑最為敏感，因此PIK3CA 有望成為肺鱗癌治療的新靶點[18]。

表2 貓爪草治療肺癌關(guān)鍵靶點信息Table 2 Key target information of Ranunculi Ternati Radix in the treatment of lung cancer

表3 貓爪草關(guān)鍵靶點與關(guān)鍵活性成分的分子對接結(jié)果Table 3 Molecular docking results of Ranunculi Ternati Radix′s key targets and key active components

表4 GO功能富集分析結(jié)果Table 4 Results of GO functional enrichment analysis

圖4 KEGG功能富集分析結(jié)果（前20）Figure 4 Results of KEGG functional enrichment analysis（top 20）

圖5 貓爪草活性成分在PI3K-Akt信號通路的標注圖Figure 5 Annotated drawing of the active components of Ranunculi Ternati Radix in the PI3K-Akt signaling pathway

GO 分析發(fā)現(xiàn)貓爪草作用靶點參與轉(zhuǎn)錄、凋亡過程的負調(diào)控、細胞增殖調(diào)控、細胞周期阻滯的負調(diào)控、蛋白質(zhì)自磷酸化等多種生物學過程，這些過程均與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[21]。KEGG 分析表明，PI3K/AKT 通路是貓爪草治療肺癌的關(guān)鍵通路，是促進細胞存活、增殖、抗凋亡、促血管生成、化療耐受的重要途徑[22]。研究表明，PI3K/AKT 通路可通過促進血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和缺氧誘導因子(HIF)的表達，促進腫瘤新生血管生成，進而促進肺癌轉(zhuǎn)移[23-25]；還可下調(diào)p53 的表達，進而阻斷凋亡信號通路的傳遞，誘導肺癌耐藥[22]。結(jié)合圖5可見，貓爪草作用靶點廣泛分布在PI3K/AKT 通路的上游、核心和下游等部分，因此推測貓爪草可以通過調(diào)控PI3K/AKT通路的相關(guān)靶點，發(fā)揮抗腫瘤作用。

本研究通過網(wǎng)絡藥理學方法，對貓爪草治療肺癌作用機制進行研究，發(fā)現(xiàn)貓爪草可能通過抑制以PI3K-Akt 信號通路為主的多條肺癌相關(guān)途徑，發(fā)揮抑制增殖、促進凋亡、抑制血管生成等作用。貓爪草治療肺癌的作用機制符合中藥多成分、多靶點、多通路的特點，后續(xù)研究將進一步對篩選出來的關(guān)鍵靶點和通路進行實驗驗證，從分子生物學層面明確貓爪草抑制肺癌的調(diào)控機制，為貓爪草的臨床應用提供理論依據(jù)。