鄭柳怡，謝凱楓，楊九妹，黃丹娥，陳玉興

(1.廣州中醫(yī)藥大學第五臨床醫(yī)學院，廣東廣州510405；2.廣東省第二中醫(yī)院/廣東省中醫(yī)藥工程技術研究院，廣東廣州510095；3.廣東省中醫(yī)藥研究開發(fā)重點實驗室，廣東廣州510095)

特應性皮炎(atopic dermatitis, AD)是常見的慢性炎癥皮膚病，表皮屏障破壞以及炎癥反應是該疾病發(fā)生發(fā)展的關鍵因素[1]。體內高水平的組胺和炎性細胞因子等可引起瘙癢、紅斑和尖銳丘疹等癥狀[2]。AD 是一個世界性的健康問題，流行病學顯示高收入國家已有20%的兒童和10%的成年人患有此病，且呈持續(xù)增長趨勢，嚴重者會影響睡眠，引發(fā)壓力或焦慮等[3]。AD 治療多采用皮質類固醇，但長期使用會導致皮膚萎縮、潮紅、多毛、毛細血管擴張、痤瘡等嚴重的副作用[4]。

玉屏風顆粒源于《究原方》的玉屏風散[5]，由黃芪、白術和防風三味藥組成，是益氣固表止汗的經典方劑。已有研究報道玉屏風顆粒在臨床上具有治療特應性皮炎的效果。馬榮雙發(fā)現對嬰兒期特應性皮炎進行治療時使用玉屏風顆?？蓽p少濕疹面積并改善患兒的免疫水平，安全性更高[6]；與單獨使用抗組胺藥物西替利嗪相比，玉屏風顆粒聯合西替利嗪治療特應性皮炎更能有效改善患者受損皮膚狀態(tài)，且復發(fā)率更低[7]。張麗等[8]通過網絡藥理學研究發(fā)現玉屏風散可能通過炎癥反應和細胞增殖來發(fā)揮治療特異性皮炎的作用。然而關于玉屏風顆粒治療特應性皮炎的機制研究，未見報道。故基于已有的研究，本次實驗通過利用組胺和聚肌胞苷酸分別誘導HaCaT 細胞建立特應性皮炎細胞模型，從細胞學角度初步探討玉屏風顆粒對HaCaT 細胞建立特應性皮炎細胞模型細胞炎癥因子表達的影響，為玉屏風顆粒在臨床上的應用提供實驗依據。

1 材料與儀器

1.1 細胞株

HaCaT 人永生化角質形成細胞，廣州吉妮歐生物技術有限公司產品。

1.2 藥品與主要試劑

玉屏風顆粒(YPFKL,國藥集團廣東環(huán)球制藥有限公司，批號170103)；氯雷他定對照品(中國藥品生物制品檢定院，批號100615-200602，質量分數99.8%)：聚肌胞苷酸(Sigma，批號BCBC3546A)；組胺(Sigma，批 號BCBC2083V)；二 甲 基 亞 砜(DMSO,Sangon Biotech，批號F514BA0010)；DMEM 高糖培養(yǎng)基ZQ-100(上海中橋新舟生物科技有限公司，批號20191018)；Penicillin-Streptomycin 雙 抗(Corning, 批號30002321)；0.25%胰酶(Gibco, 批號2085264)；總RNA 提取劑(北京鼎國昌盛生物科技有限責任公司,批號99G00127)。

1.3 主要儀器

CO2細胞培養(yǎng)箱(美國Thermo 公司)；Cellometer Mini自動細胞計數儀(美國Nexcelom 公司)；DMI8倒置熒光顯微鏡(德國Leica 公司)；6321Y602022 型普通PCR 儀 器(Eppendorf 公 司)；C1000 型 熒 光 定 量PCR 儀 器(Bio-Rad 公 司)；Varioskan Flash 型 全 波 長多功能酶標儀(美國Thermo公司)。

2 方法

2.1 人類角質形成細胞HaCaT細胞的培養(yǎng)

HaCaT 細胞采用含10%（φ）胎牛血清和1%雙抗的高糖DMEM 培養(yǎng)基，放入37 ℃、5%（φ）CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，常規(guī)換液及傳代培養(yǎng)，正常情況下細胞貼壁生長。

2.2 MTT 法檢測YPFKL 對正常HaCaT 細胞生長的影響

取處于對數期且生長良好的HaCaT 細胞懸液，調整密度為1×104個/孔，接種于含10%胎牛血清、1%雙抗DMEM 高糖培養(yǎng)基的96 孔板中，培育24 h后，更換新鮮培養(yǎng)基，各組YPFKL 按100、50、25、12.5、6.25、3.125 μg/L 的質量濃度溶解于DMSO 中，各濃度設置4個復孔，藥物分別加入各組細胞中，另外設置不加藥的空白組。作用24 h后,棄去培養(yǎng)基，加入30 μL MTT 溶液(3 mg/mL)，6 h 后，將MTT 溶液吸出，加入150 μL DMSO，震搖15 min 后，用酶聯免疫檢測儀在570 nm 下檢測每組吸光度，以空白組細胞吸光值為參考，各組細胞吸光值所占百分比即為細胞存活率。

2.3 MTT 法檢測YPFKL 對histamine 誘導下的Ha-CaT細胞生長的影響

取處于對數期且生長良好的HaCaT 細胞懸液，調整密度為1×104個/孔，接種于含10%胎牛血清、1%雙抗DMEM 高糖培養(yǎng)基的96 孔板中，細胞分為空白組、模型組和藥物干預組。培育12 h 后，除空白組外，其余各組加入histamine 40 μmol/mL 誘導HaCaT 細胞。繼續(xù)培育24 h 后，藥物干預組按“2.2”方法的濃度分別加入各組細胞中，作用24 h 后同“2.2”法進行MTT檢測。

2.4 MTT 法檢測YPFKL 對Poly(I:C)誘導下的HaCaT細胞生長的影響

取處于對數期且生長良好的HaCaT 細胞懸液，調整密度為1×104個/孔，接種于含10%胎牛血清、1%雙抗DMEM 高糖培養(yǎng)基的96 孔板中，細胞分為空白組、模型組和藥物干預組。培育12 h 后，除空白組外，其余各組加入Poly(I:C) 25 μg/mL 誘導HaCaT 細胞。繼續(xù)培育24 h 后，藥物干預組按“2.2”方法的濃度分別加入各組細胞中，作用24 h 后同“2.2”法進行MTT檢測。

2.5 熒光定量PCR 法檢測YPFKL 對histamine 誘導下的HaCaT 細胞相關炎性細胞因子的mRNA 水平的影響

HaCaT 細胞接種于含10%胎牛血清、1%雙抗DMEM 高糖培養(yǎng)基的6 孔板中，接種密度為1×105個/孔，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)24 h 后，除空白組外，其余各孔加入histamine 40 μmol/mL 誘導HaCaT細胞，藥物干預組加入氯雷他定(100 μmol/L)，YPFKL 高(50 μg/L)、中(25 μg/L)、低濃度(12.5 μg/L)組，24 h 后實驗結束，PBS 洗細胞2 次，用Trizol 法提取總RNA 為模板設計特異性引物由Pubmed-NCBI提供基因序列，引物設計使用Primer-Blast，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，各引物序列見表1。

2.6 熒光定量PCR 法檢測YPFKL 對Poly(I:C) 誘導下的HaCaT 細胞相關炎性細胞因子的mRNA 水平的影響

HaCaT 細胞接種于含10%胎牛血清、1%雙抗DMEM 高糖培養(yǎng)基的6 孔板中，接種密度為1×105個/孔，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)24 h 后，除空白組外，其余各孔加入Poly(I:C) 25 μg/mL 誘導HaCaT細胞，藥物干預組加入氯雷他定(100 μmol/L)，YPFKL 高(50 μg/L)、中(25 μg/L)、低濃度(12.5 μg/L)組，24 h 實驗結束后操作同“2.5”方法進行熒光定量PCR操作，檢測基因見表1。

2.7 統(tǒng)計學方法

采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)進行多組間比較；組間均數兩兩比較，方差齊時采用SNK法；方差不齊時采用Dunnett’s T3法。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

表1 擴增的基因引物信息Table 1 Primer information of amplified genes

3 結果

3.1 MTT 法檢測YPFKL 對正常HaCaT 細胞生長的影響

與空白組比較，質量濃度50、25、12.5 μg/L 的YPFKL 顯著提高細胞存活率(P＜0.01,P＜0.05)，質量濃度6.25、3.125 μg/L 的YPFKL 對細胞存活率無顯著性影響，提示6.25 μg/L及以下濃度YPFKL對細胞生長無影響，100 μg/L YPFKL 組細胞存活率顯著降低(P＜0.01)，提示該濃度對細胞有毒性作用，見表2。

3.2 MTT法檢測YPFKL對histamine誘導下的HaCaT細胞生長的影響

與模型組比較，質量濃度為50、25、12.5、6.25 μg/L的YPFKL 均能顯著提高HaCaT 細胞的存活率(P＜0.01)，見表3。

3.3 MTT 法檢測YPFKL 對Poly(I:C)誘導下的HaCaT細胞生長的影響

與模型組比較，質量濃度為50、25 μg/L YPFKL均能顯著提高HaCaT 細胞的存活率(P＜0.01)，見表4。

表2 不同濃度YPFKL對正常HaCaT細胞存活率的影響Table 2 Effects of different concentrations of YPFKL on the survival rate of normal HaCaT(，n=4)

表2 不同濃度YPFKL對正常HaCaT細胞存活率的影響Table 2 Effects of different concentrations of YPFKL on the survival rate of normal HaCaT(，n=4)

與空白組比較：*P＜0.05，**P＜0.01。

組別空白組YPFKL1 YPFKL2 YPFKL3 YPFKL4 YPFKL5 YPFKL6劑量/(μg·L-1)-100 50 25 12.5 6.25 3.125存活率/%100.00±8.58 77.54±4.96**167.68±10.15**130.64±19.97*119.78±5.51**94.65±9.71 87.54±7.99

表3 不同濃度YPFKL對histamine誘導下的HaCaT細胞存活率的影響(，n=4)Table 3 Effects of different concentrations of YPFKL on the survival rate of HaCaT cells induced by histamine

表3 不同濃度YPFKL對histamine誘導下的HaCaT細胞存活率的影響(，n=4)Table 3 Effects of different concentrations of YPFKL on the survival rate of HaCaT cells induced by histamine

與空白組比較：**P＜0.01；與模型組比較：##P＜0.01。

組別空白組模型組YPFKL1 YPFKL2 YPFKL3 YPFKL4 YPFKL5劑量/(μg·L-1)--5 0 25 12.5 6.25 3.125存活率/%100.00±2.44 66.64±3.63**84.38±3.64##78.73±1.70##78.54±2.17##71.98±2.59##64.85±5.12

表4 不同濃度YPFKL對Poly(I:C)誘導下的HaCaT細胞存活率的影響(，n=4)Table 4 Effects of different concentrations of YPFKL on the survival rate of HaCaT cells induced by Poly(I:C)

表4 不同濃度YPFKL對Poly(I:C)誘導下的HaCaT細胞存活率的影響(，n=4)Table 4 Effects of different concentrations of YPFKL on the survival rate of HaCaT cells induced by Poly(I:C)

與空白組比較：**P＜0.01；與模型組比較：##P＜0.01。

組別正常組模型組YPFKL1 YPFKL2 YPFKL3 YPFKL4 YPFKL5劑量/(μg·L-1)--5 0 25 12.5 6.25 3.125存活率/%100.00±7.50 63.39±2.94**89.45±6.72##80.74±3.82##72.22±4.19 64.87±4.54 66.08±8.05

3.4 YPFKL 對histamine 誘導下的HaCaT 細胞中相關炎癥因子的mRNA水平的影響

與模型組相比，YPFKL 高濃度組HaCaT 細胞IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、MCP-1 的mRNA 表達水平顯著性降低(P＜0.01,P＜0.05)，YPFKL 中濃度組HaCaT 細胞IL-1β和TNF-α mRNA 表達水平顯著性下降(P＜0.01，P＜0.05)，見表5。

表5 YPFKL對histamine誘導下的HaCaT細胞炎癥因子mRNA表達水平的影響Table 5 Effect of YPFKL on the mRNA expression of inflammatory factors in HaCaT cells induced by histamine (，n=3)

表5 YPFKL對histamine誘導下的HaCaT細胞炎癥因子mRNA表達水平的影響Table 5 Effect of YPFKL on the mRNA expression of inflammatory factors in HaCaT cells induced by histamine (，n=3)

與空白組比較：*P＜0.05,**P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05,##P＜0.01。

組別空白組模型組氯雷他定組（μmol·mL-1）YPFKL高濃度組中濃度組低濃度組劑量/(μg·L-1)100 50 25 12.5 IL-1β 1.00±0.20 1.93±0.14**1.34±0.07##1.49±0.14#1.52±0.23#1.80±0.15 IL-6 1.00±0.40 1.88±0.34**1.02±0.04##1.12±0.08#1.33±0.22 1.72±0.18 IL-8 1.00±0.30 1.82±0.21**1.36±0.11 1.15±0.18##1.60±0.12 1.83±0.21 TNF-α 1.00±0.07 1.82±0.17**1.26±0.14##1.14±0.17##1.36±0.12##1.59±0.23 MCP-1 1.00±0.12 1.84±0.06*1.05±0.08##1.15±0.09##1.46±0.27 1.70±0.14

3.5 YPFKL 對Poly(I:C)誘導下的HaCaT 細胞中相關炎癥因子mRNA表達水平的影響

與模型組相比，YPFKL 高濃度組IL-1β、IL-8、TNF-α 和MCP-1 的mRNA 表 達 水 平 顯 著 性 下 降(P＜0.01，P＜0.05)，YPFKL 中濃度組IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α 的mRNA 表 達 水 平 顯 著 性 降 低(P＜0.05)，YPFKL 低濃度組MCP-1 的mRNA 表達水平顯著性降低(P＜0.01)，見表6。

4 討論

特應性皮炎屬于過敏性炎癥疾病，臨床根據癥狀表現以及過敏源將特應性皮炎分為單純型和混合型，混合型通常伴隨呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)生，如哮喘和過敏性鼻炎，患者常見皮膚出現丘疹紅斑，或因抓撓而出現潰爛等現象[7]。其發(fā)病機制復雜，多與皮膚屏障破壞，肥大細胞釋放炎癥因子引起的機體炎癥水平升高相關[8]。當人體接觸過敏原時，表皮細胞釋放促炎細胞因子或趨化因子等炎癥介質，并能產生具有生物活性的白細胞介素-8(IL-8)，IL-8可介導T細胞和中性粒細胞進入表皮參與免疫炎癥反應[9]。肥大細胞也是與過敏性炎癥反應相關的主要效應細胞。當抗原與抗體結合后，肥大細胞開始脫顆粒，釋放組胺等生物活性物質，還產生各種促炎因子，如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、IL-1β和IL-6以及趨化因子[10]。這些介質通過募集和激活免疫細胞進一步促進炎癥反應。其中IL-1β是表皮屏障被破壞后由角質形成細胞釋放的細胞因子，它可以激活樹突狀細胞分泌細胞因子使Th細胞分化失衡，導致皮膚屏障受損[11]。單核細胞趨化蛋白1(MCP-1)在過敏性疾病中起正調節(jié)作用, 它參與早期炎癥反應,可促進大量以組胺為主的炎癥介質釋放[12]。TNF-α是一種多向性的促炎因子，可以誘導淋巴細胞釋放大量細胞因子，并能顯著促進胸腺基質淋巴生成素的釋放，破壞表皮形態(tài)及屏障功能[13]。IL-6、TNF-α、IL-4 以及MCP-1 已成為AD 患者的重要判斷指標，其體內水平與AD病情呈正相關關系[14]。

玉屏風顆粒來源于扶正固表的經典名方玉屏風散，該方君以黃芪，性甘溫而內補脾肺之氣，外能止汗固表；臣以白術能健脾益氣，加強君藥益氣固表之功；防風為佐可散風邪。三藥合用，可奏固表不留邪，驅邪不傷正氣之效[15]。玉屏風顆粒在臨床上具有廣泛的應用且療效顯著。臨床研究發(fā)現，嬰兒期特應性皮炎使用玉屏風顆粒治療可以有效減少濕疹面積，且復發(fā)率較低[6]。較單獨運用氯雷他定相比，玉屏風顆粒聯合氯雷他定，能夠更顯著改善過敏性皮炎患者的臨床體征，獲得更好的臨床療效[16]。

已有研究使用組胺或Poly(I:C)誘導人永生化角質形成細胞產生AD 狀態(tài)的病理細胞模型[17-18]。故本實驗在其基礎上使用HaCaT 細胞構建特應性皮炎細胞模型研究玉屏風顆粒治療該病的可能機制。在本次研究中，質量濃度為100 μg/L 的玉屏風顆粒顯著抑制HaCaT 細胞的存活率，說明該濃度對細胞具有殺傷作用；6.25 μg/L 及以下濃度的玉屏風顆粒對細胞存活率無顯著影響，50、25、12.5 μg/L 可以顯著提高細胞的存活率，且細胞的存活率隨著濃度的升高而提高，可猜測玉屏風顆粒在50 ～12.5 μg/L 濃度范圍內可有效促進HaCaT 細胞增殖，對細胞具有保護作用。當使用組胺誘導HaCaT 細胞成為特異性皮炎細胞之后，50、25、12.5 以及6.25 μg/L 濃度的玉屏風顆粒均可以顯著提高HaCaT 細胞的存活率，且50 和25 μg/L 濃度玉屏風顆粒能不同程度抑制相關炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、MCP-1mRNA的表達，其中50 μg/L濃度的玉屏風顆粒促進細胞增殖且抑制炎癥因子表達的效果最好；當使用Poly(I:C)誘導HaCaT 細胞成為特異性皮炎細胞之后，亦能發(fā)現50、25 μg/L濃度玉屏風顆粒顯著提高細胞存活率，50、25、12.5 μg/L 濃度玉屏風顆粒均能夠不同程度抑制相關炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、MCP-1mRNA 的表達，且發(fā)現玉屏風顆粒促進細胞增殖并抑制炎癥因子表達的能力隨著濃度的升高而加強。

表6 YPFKL對Poly(I:C)誘導下的HaCaT細胞炎癥因子mRNA表達水平表達的影響Table 6 Effect of YPFKL on the mRNA expression of inflammatory factors in HaCaT cells induced by Poly(I:C)(，n=3)

表6 YPFKL對Poly(I:C)誘導下的HaCaT細胞炎癥因子mRNA表達水平表達的影響Table 6 Effect of YPFKL on the mRNA expression of inflammatory factors in HaCaT cells induced by Poly(I:C)(，n=3)

與空白組比較：*P＜0.05,**P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05,##P＜0.01。

組別空白組模型組氯雷他定組（μmol·mL-1）YPFKL高濃度組中濃度組低濃度組劑量/(μg·L-1)100 50 25 12.5 IL-1β 1.00±0.11 1.96±0.18**1.14±0.26##1.14±0.23##1.47±0.06#1.62±0.25 IL-6 1.00±0.69 1.79±0.06*0.84±0.08#1.39±0.17 1.50±0.04#1.56±0.07 IL-8 1.00±0.07 1.77±0.04**1.15±0.17##0.99±0.17##1.43±0.24#1.65±0.14 TNF-α 1.00±0.16 1.79±0.04**1.11±0.09##1.31±0.17#1.37±0.09#1.53±0.28 MCP-1 1.00±0.09 1.79±0.10**1.11±0.07##1.27±0.03##1.52±0.23 0.91±0.06##

綜上所述，玉屏風顆粒可能通過促進角質形成細胞的增殖并抑制細胞炎癥因子的表達來保護皮膚細胞，從而達到修復受損皮膚屏障，緩解皮膚炎癥反應的作用。該實驗僅從體外實驗去闡述玉屏風顆粒治療特應性皮炎的可能機制，下一步將開展動物體內實驗進一步發(fā)現玉屏風顆粒治療特應性皮炎的機制。