劉曉娟，宋艷玲，劉海洋，孫福佳

（1.阜新市產(chǎn)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新推廣中心，遼寧阜新 123000；2.沈陽(yáng)化工大學(xué)制藥工程教研室，遼寧沈陽(yáng) 110142；3.阜新市交通運(yùn)輸綜合行政執(zhí)法隊(duì)，遼寧阜新 123000）

齊墩果酸具有廣泛的生物活性，包括肝臟保護(hù)、抗菌消炎、抗腫瘤、抗HIV和降血糖[1]等藥理作用。經(jīng)查閱文獻(xiàn)，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)將OA的C-3位羥基氧化保護(hù)，28位引入乙二胺片段，降低28反應(yīng)位點(diǎn)的空間位阻，同時(shí)引入取代苯環(huán)作為疏水性基團(tuán)，設(shè)計(jì)1個(gè)新型化合物使OA更容易進(jìn)入細(xì)胞并提高抗腫瘤活性，并通過(guò)計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)，MVD軟件與VEGFR靶點(diǎn)進(jìn)行對(duì)接，用Discovery studio直觀分析化合物與靶點(diǎn)的結(jié)合情況Mol Dock Score（OA）=-68.098 4，Mol Dock Score（化合物4）=-138.638，由于 68.098 4小于138.638，所以預(yù)估化合物4活性高于OA，因此合成化合物4并進(jìn)行體外抗腫瘤活性測(cè)試，見(jiàn)圖1。

圖1 合成路線實(shí)驗(yàn)部分

1 實(shí)驗(yàn)設(shè)備與材料

數(shù)顯微熔點(diǎn)測(cè)定儀，溫度計(jì)未經(jīng)校正；ARX-300/500MHz核磁共振譜儀（德國(guó)Bruker公司），CDCl3為溶劑，TMS為內(nèi)標(biāo)；Agilent1100SL型離子阱質(zhì)譜儀測(cè)定儀（美國(guó)安捷倫公司）；

齊墩果酸（批號(hào)：CY160305，規(guī)格：500mg，陜西慈緣生物技術(shù)有限公司），實(shí)驗(yàn)所用試劑均為市售分析純。顯色劑為10%硫酸乙醇溶液和0.2g/100mL茚三酮乙醇溶液。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 制備3-羰基齊墩果酸

將OA（2.5g，5.47mmol）和200mL丙酮加入干燥的茄型瓶（500mL），攪拌，冰鹽浴下待溫度降至0℃以下，緩慢滴加約150滴Jones試劑，直到溶液橙色不再消失，讓試劑在室溫靜置2h，加入80mL異丙醇進(jìn)行淬滅反應(yīng)30min。反應(yīng)結(jié)束后，通過(guò)真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)掉部分溶劑，并對(duì)溶劑進(jìn)行稀釋，萃取乙酸乙酯，用飽和鹽洗滌3次，用無(wú)水Na2SO4干燥過(guò)夜，經(jīng)靜止，抽濾，洗滌，減壓旋蒸等程序最終得到化合物2白色晶體約1.89g，產(chǎn)率96%。

2.2 制備3-羰基齊墩果酸酰氯

將化合物2（3.50g，7.69mmol）和30mL無(wú)水二氯甲烷加入干燥的反應(yīng)瓶（100mL）中并加熱至40℃，緩慢滴加草酰氯（4.0mL，48.95mmol），回流2h，反應(yīng)結(jié)束后，減壓蒸干溶劑，加入兩次環(huán)己烷，每次30mL，減壓蒸干得淺棕色固體粉末，密閉備用。

2.3 制備3-羰基-28-N（乙基）-齊墩果酸甲酰胺

將羰基齊墩果酸酰氯（1.5g，3.17mmol）和30mL無(wú)水三氯甲烷添加到干燥的反應(yīng)瓶（100mL）中，攪拌，完全溶解后緩慢滴加到乙二胺溶液中，加入DMAP（0.02g，0.17mmol）和無(wú)水吡啶（1.25mL，15.70mmol）。室溫下靜置2h，反應(yīng)完成后用10mL濃度5%鹽酸稀釋后留取下層溶液，萃取二氯甲烷，飽和食鹽水沖洗3次，無(wú)水Na2SO4干燥過(guò)夜，經(jīng)靜止，抽濾，洗滌，旋蒸等程序得到棕色粉末化合物3，50℃真空干燥過(guò)夜。以硅膠柱色譜分離，甲醇-二氯甲烷（1∶150）洗脫，得化合物3白色粉末1.37g（7.85mmol），產(chǎn)率80%。mp：149.5～150.3℃。ESI-MS m/z：497.4[M+H]＋。1H NMR（600MHz，CDCl3）δ/6.60（1H，d，J=5.1Hz，-CONH），5.40（1H，d，J=15.1Hz，H-12），3.51（1H，dd，J=13.7，5.8Hz，CONHCH2CH2），3.22（1H，dd，J=13.9，5.6Hz，CONHCH2CH2），3.07（2H，s，CONHCH2CH2），2.94（2H，t，J=5.4Hz，-NH2），2.63（1H，d，J=9.4Hz，H-18），2.55（1H，m，H-2），2.37（1H，m，H-12）。2.55（1H，ddd，J=15.9，11.1，7.3Hz，H-2），2.37（1H，ddd，J=15.7，6.5，3.5Hz，H-2）。1.17（3H，s，-CH3），1.09（3H，s，-CH3），1.05（6H，s，2CH3），0.92

（3H，s，-CH3），0.91（3H，s，-CH3），0.81（3H，s，-CH3）。

2.4 制備羰基-28-N（2-（甲氧基丁烯氧基苯甲酰胺基）乙基）-齊墩果酸甲酰胺

將肉桂酸（0.74g，5.02mmol），溶解于20mL無(wú)水三氯甲烷中，逐滴加入草酰氯（2.4mL，28.95mmol），保持恒溫40℃3h。待反應(yīng)結(jié)束后，加入兩次環(huán)己烷，每次30mL，減壓蒸干得淺棕色固體粉末，密閉備用。將化合物3（0.54g，1.0mmol）、10mL無(wú)水三氯甲烷加入干燥的50mL茄型瓶中，攪拌，充分溶解后，加入新制備的（0.83g，5mmol）肉桂酸酰氯，無(wú)水吡 啶（0.41mL，5.0mmol） 和 DMAP（0.006g，0.05mmol），升溫至60℃，持續(xù)回流反應(yīng)3h。結(jié)束后用20mL濃度5%稀釋鹽酸清洗后留取下層溶液，萃取二氯甲烷，并用食鹽水沖洗3次，無(wú)水NaSO4干燥過(guò)夜，經(jīng)靜止、抽濾、洗滌、旋蒸等程序得到化合物5a白色粉末固體0.47g，產(chǎn)率75%。mp：138.8～140.1℃。ESI-MS m/z：627.5[M+H]＋。1H NMR（600MHz，CDCl3）δ/7.60（1H，d，J=15.7Hz，COCH=CH-），7.51-7.47（2H，m，ph-H-2’，H-6’），7.38 - 7.32（3H，m，），6.91（1H，d，J=17.7Hz，CONHCH2CH2NH），6.49（1H，t，J=11.5Hz，CONH），6.42（1H，d，J=15.7Hz，COCH=CH-），5.43（1H，t，J=3.4Hz，H-12），3.63-3.25（4H，m，-CONHCH2CH2），2.61（1H，d，J=15.4Hz，H-18），2.57 - 2.47（1H，m，H-2），2.34（ddd，J=15.8，6.6，3.6Hz，H-2），1.17，1.08，1.02，0.99，0.90，0.89，0.79（each 3H，s，-CH3）。

3 化合物的抗腫瘤活性測(cè)試

使用舒尼替尼作為陽(yáng)性對(duì)照藥物，通過(guò)MTT法測(cè)試目標(biāo)化合物的抗腫瘤活性，并選擇人肺癌細(xì)胞和人胃癌細(xì)胞作為測(cè)試目標(biāo)。具體流程：取0.30%胰蛋白酶消化液?jiǎn)螌优囵B(yǎng)的人肺癌細(xì)胞、人胃癌細(xì)胞以含10%胎牛血清的RPMI 1640為培養(yǎng)液稀釋調(diào)整。人胃癌細(xì)胞、人肺癌細(xì)胞為2.1×104個(gè)/mL、2.4×104個(gè)/mL的單細(xì)胞溶液，將其培養(yǎng)于培養(yǎng)板內(nèi)，以250μL/孔接種到培養(yǎng)板內(nèi)。將孔培養(yǎng)板置40℃、CO2濃度為5%濕度保溫箱中培養(yǎng)24h，分別加入濃度為500μg/mL，50μg/mL，5μg/mL，0.5μg/mL，0.05μg/mL的待測(cè)藥物，陰性對(duì)照組與培養(yǎng)液中加入一定體積的溶劑，并建立空白對(duì)照組，繼續(xù)在40℃和CO2濃度為5%保溫箱中放置72h，每孔加入20μL MTT溶液，于40℃下繼續(xù)靜置4h，選取下層溶液，并向每孔加入100μL溶解甲臜顆粒，在振蕩器上上下震蕩使其溶解。測(cè)量每個(gè)孔的光密度，計(jì)算所測(cè)化合物對(duì)細(xì)胞的抑制率及IC50。為了使實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)更具有說(shuō)服力，再重復(fù)該實(shí)驗(yàn)2次取3次結(jié)果平均值作為最終數(shù)據(jù)。

按以下公式計(jì)算抑制率：

用IC50計(jì)算軟件來(lái)計(jì)算半數(shù)抑制濃度（IC50）

表1 目標(biāo)化合物對(duì)SGC7901細(xì)胞和A549細(xì)胞的活性抑制

化合物濃度為5μg/mL，經(jīng)過(guò)48h處理后的細(xì)胞抑制率：所測(cè)化合物4對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC7901的IC50是18.21μmol/L，活性顯著高于母體OA，活性與已上市藥物舒尼替尼相當(dāng)。

4 結(jié)論

所測(cè)化合物4對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC7901的IC50是18.21μmol/L?；钚燥@著高于母體OA，構(gòu)效關(guān)系分析：對(duì)SGC7901人胃癌細(xì)胞的IC50值4 小于OA，表明C-3改造成羰基，羰基與氨基酸殘基形成氫鍵，同時(shí)C-28位羧基引入乙二胺片段，引進(jìn)疏水性基團(tuán)，氨基酸殘基形成牢固氫鍵有關(guān)。證實(shí)了本實(shí)驗(yàn)中計(jì)算機(jī)分子模擬對(duì)接的準(zhǔn)確性與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的合理性。