劉 茜 張 憲 陳 敏 尹 全 楊曉鳳

（1.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測(cè)試中心，成都610066； 2.中國(guó)綠色食品發(fā)展中心，北京100081）

葡萄屬于漿果族水果，其豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值頗受消費(fèi)者的喜愛(ài)[1]。葡萄皮含有豐富的天然色素和白藜蘆醇等抗氧化物質(zhì)，不但對(duì)人體內(nèi)糖類的分解有積極的促進(jìn)作用，且有助于抵抗和預(yù)防皮膚癌[2]。葡萄中富含花青素和類黃酮，這兩類物質(zhì)都是強(qiáng)力抗氧化劑，可以減少皮膚上產(chǎn)生皺紋和緩解老年人視力退化[3]。葡萄籽含有多酚類、油脂類、氨基酸、維生素和礦物質(zhì)等物質(zhì)，防治過(guò)敏、癌癥、衰老等疾病[4]。葡萄是世界上產(chǎn)量最大的水果之一[5]。在葡萄的生長(zhǎng)過(guò)程中，灰霉病嚴(yán)重影響其產(chǎn)量和品質(zhì)，為此，我國(guó)從國(guó)外引進(jìn)嘧菌環(huán)胺和異菌脲，廣泛應(yīng)用于防治葡萄灰霉病[6]，并已制定葡萄中嘧菌環(huán)胺和異菌脲的最大殘留限量 （MRL）分別為20 mg/kg 和10 mg/kg[7]。

嘧菌環(huán)胺和異菌脲（結(jié)構(gòu)式見圖1）[8]均屬于殺菌劑，單劑已在番茄、蘋果、葡萄、人參、黃瓜、辣椒、馬鈴薯、西瓜、香蕉、小油菜進(jìn)行了農(nóng)藥殘留登記，但兩種復(fù)配劑尚未登記[9]。目前對(duì)嘧菌環(huán)胺在人參、柑橘、草莓上的藥效試驗(yàn)，病菌的敏感性試驗(yàn)和動(dòng)態(tài)消解及膳食風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估試驗(yàn)已有研究[10～12]，對(duì)異菌脲在楊梅等作物上也有不同方向的研究[13]，但對(duì)兩種農(nóng)藥在葡萄和土壤中的殘留消解及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估尚未見探究。本文于2016－2017 兩年分別在遼寧省和四川省在良好農(nóng)業(yè)規(guī)范 （good agricultural practices，GAP）條件下開展60%嘧菌環(huán)胺·異菌脲可濕性粉劑在葡萄和土壤中的田間試驗(yàn)，且在良好實(shí)驗(yàn)室規(guī)范 （good laboratory practice，GLP）條件下分析兩地葡萄和土壤的殘留消解規(guī)律并進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，旨在為嘧菌環(huán)胺和異菌脲在葡萄生產(chǎn)中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)，同時(shí)也為關(guān)注嘧菌環(huán)胺和異菌脲在土壤環(huán)境中的殘留趨勢(shì)提供參考。

圖1 嘧菌環(huán)胺（a）和異菌脲（b）化學(xué)結(jié)構(gòu)式

一、材料與方法

（一）試劑及儀器

1.試劑。嘧菌環(huán)胺、異菌脲標(biāo)準(zhǔn)品 （純度99.96%、99.82%，德國(guó)Dr.Ehrenstorfer 公司），丙酮、甲苯、乙腈 （色譜純，美國(guó)Fisher 公司），氯化鈉 （分析純，上海中化試劑公司），石墨化碳－氨基復(fù)合柱（500 mg/6 mL，DIKMA 公司）。

2.儀器。氣相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜儀（SHZMADZU TQ－8040），配有三重四極桿質(zhì)量分析器，HP－5MS （0.25 μm×30 m×0.25 mm）色譜柱，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式 （multiple reaction monitoring，MRM），日本島津公司； 高速勻漿機(jī) （IKA－T18 basic，德國(guó)IKA 公司)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 （Rotavapor R－210，瑞士BUCHI 公司）、多功能食品料理機(jī) （博朗3205，德國(guó)BRAUN 公司）。

（二）田間試驗(yàn)本研究的田間試驗(yàn)分為消解動(dòng)態(tài)和最終殘留試驗(yàn)兩部分。試驗(yàn)于2016－2017兩年分別在遼寧省沈陽(yáng)市太子河區(qū)東寧衛(wèi)鄉(xiāng)和四川省成都市龍泉驛區(qū)山泉鎮(zhèn)進(jìn)行。田間試驗(yàn)方案根據(jù)《農(nóng)藥登記殘留田間試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程》[14]和NY/T 788－2004 《農(nóng)藥殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則》[15]設(shè)計(jì)。遼寧省和四川省供試作物及其品種分別是葡萄“貝達(dá)” 和葡萄 “巨峰”，被試物60%嘧菌環(huán)胺·異菌脲可濕性粉劑由山東億嘉農(nóng)化有限公司提供。

1.消解動(dòng)態(tài)試驗(yàn)。葡萄： 以制劑500 倍液（有效成分1200 mg/kg）于葡萄果實(shí)為成熟期1/2 大小時(shí)施藥，小區(qū)面積30 m2，重復(fù)處理3 次，處理間設(shè)保護(hù)間隔區(qū)，另設(shè)清水空白對(duì)照。土壤： 選一塊10 m2的土地單獨(dú)施藥，施藥濃度為1000 g a.i./hm2（制劑0.17 g/m2），施藥次數(shù)1 次，另設(shè)清水空白對(duì)照。葡萄和土壤均施藥后2 h 和1、3、5、7、10、14、21、28、35 d 采樣。

2.最終殘留試驗(yàn)。葡萄： 根據(jù)收獲期向前推算確定施藥時(shí)期，兩個(gè)施藥劑量，低劑量制劑1000倍液（有效成分600 mg/kg），高劑量制劑666.7 倍液（有效成分900 mg/kg）。低劑量和高劑量各設(shè)2次和3 次施藥處理，每個(gè)處理3 次重復(fù)，小區(qū)面積30 m2，施藥間隔期7 d，末次施藥后間隔7、14、21 d 采集樣品。另設(shè)清水空白對(duì)照，處理間設(shè)保護(hù)帶。土壤： 土壤的施藥時(shí)間、施藥量和小區(qū)面積與葡萄一致。

3.樣品采集制備與保存。葡萄： 用隨機(jī)方法在試驗(yàn)小區(qū)內(nèi)上、下、左、右不同部位采集6 串以上生長(zhǎng)正常、無(wú)病害、確已著藥、成熟的葡萄果實(shí)，每小區(qū)采集葡萄樣本不少于2 kg，裝入樣本容器中包扎妥當(dāng)，8 h 內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，用多功能食品加工機(jī)搗碎成漿液，混合均勻后，分取150 g 兩份，裝入樣品盒密封，貼好標(biāo)簽后立即放于－20℃冰柜中保存。土壤： 在試驗(yàn)小區(qū)內(nèi)葡萄樹冠下，用土鉆隨機(jī)采取0～15 cm 土壤樣本，采樣6～12 點(diǎn)，每小區(qū)每次采樣不少于2 kg，裝入樣本容器中包扎妥當(dāng)，8 h 內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，碾碎，過(guò)篩，混勻縮分后保留200 g 左右兩份，分別裝入可封口的樣品袋中，貼好標(biāo)簽后立即將樣品放于－20℃冰箱中保存。

（三）分析方法

1.前處理。（1）提取。稱取10 g（精確至0.001 g）葡萄和土壤試樣于50 mL 離心管中，準(zhǔn)確加入20.0 mL 乙腈，15000 r/min 高速勻漿2 min，濾液全部過(guò)濾到裝有3～5 g NaCl 的50 mL 比色管中，蓋上塞子，振蕩1 min，在室溫下靜置1 h，待乙腈相和水相分層。準(zhǔn)確吸取10.0 mL 上清液于10 mL比色管中，待凈化。（2）凈化。用5 mL 乙腈+甲苯（3∶1，V∶V）預(yù)淋活化石墨化碳/ 氨基復(fù)合柱，待柱液面近干時(shí)，將上述待凈化溶液轉(zhuǎn)入小柱中，開始收集，再用15 mL 乙腈+甲苯 （3∶1，V∶V）淋洗，收集洗脫液于150 mL 濃縮瓶中，濃縮，用正己烷+丙酮 （9∶1，V∶V）定容至5 mL，裝瓶，部分樣品上機(jī)濃度根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度稀釋相應(yīng)倍數(shù)后，待GC－QqQ－MS/MS 測(cè)試。

2.GC－QqQ－MS/MS 檢測(cè)條件。色譜升溫程序： 初始溫度150℃，以10℃/min 升至260℃，再以20℃/min 升至300℃，保持2 min； 載氣為氦氣，流速為1.0 mL/min； 進(jìn)樣口溫度60℃； 進(jìn)樣量1 μL； 進(jìn)樣方式為不分流進(jìn)樣； 電子轟擊源70 eV； 離子源溫度230℃； GC－MS 接口溫度300℃；監(jiān)測(cè)參數(shù)見表1。

3.標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。分別稱取一定量的嘧菌環(huán)胺和異菌脲，用丙酮稀釋為1000 mg/L 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，置于0℃以下冰柜貯存待用； 用丙酮稀釋標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液至100 mg/L，然后分別用葡萄和土壤的空白基質(zhì)溶液逐級(jí)稀釋至0.010、0.050、0.10、0.20、0.50 mg/L 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照上文的檢測(cè)條件上機(jī)測(cè)試，分別以嘧菌環(huán)胺和異菌脲的質(zhì)量濃度（x，mg/L）為橫坐標(biāo)，以峰面積（y）為縱坐標(biāo)，繪制葡萄和土壤的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

4.添加回收試驗(yàn)。在葡萄空白對(duì)照樣品中添加0.010、0.20、2.5 和20 mg/kg （10 mg/kg）4 個(gè)不同濃度的嘧菌環(huán)胺和異菌脲，在土壤空白對(duì)照樣品中添加0.010、0.20 和2.5 mg/kg 3 個(gè)不同濃度的嘧菌環(huán)胺和異菌脲進(jìn)行添加回收試驗(yàn)，每個(gè)添加水平做5 個(gè)平行，分別計(jì)算平均值和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD%）。

表1 嘧菌環(huán)胺和異菌脲的GC-QqQ-MS/MS 參數(shù)

（四）消解動(dòng)力學(xué)根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，消解速率可利用一級(jí)動(dòng)力學(xué)模式進(jìn)行評(píng)價(jià)，公式即Ct＝C0e－kt[16]，t（d）表示樣品的采收間隔期，Ct（mg/kg）代表在t時(shí)采收樣品中的農(nóng)藥殘留量，C0（mg/kg）是原始沉積量，k表示消解速率。公式中C0用2 h的殘留量進(jìn)行分析，DT50代表農(nóng)藥消解半衰期，根據(jù)DT50＝ln2/k 計(jì)算。

（五）風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)農(nóng)藥的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)指標(biāo)很多，本文中選擇兩種指標(biāo)，一種是利用農(nóng)藥的膳食暴露健康風(fēng)險(xiǎn)危害指數(shù) （HI），其用農(nóng)藥的每日膳食暴露量（EDI）與每日允許攝入量（ADI）的比值危險(xiǎn)商（HQ）判斷； 另一種是對(duì)農(nóng)藥的長(zhǎng)期攝入量膳食風(fēng)險(xiǎn)商 （RQ）進(jìn)行評(píng)價(jià)。當(dāng)HI、HQ和RQ均小于100%，則代表風(fēng)險(xiǎn)是可接受的，相反則會(huì)對(duì)人類健康存在潛在的風(fēng)險(xiǎn)。

公式 （1）中，EDI（mg/kg d）為每日膳食暴露 量；C（mg/kg）為 樣 品 中 農(nóng) 藥 殘 留 量；Fi（kg/d）為一般人群每日對(duì)某一食品的消費(fèi)量；bw（kg）為人群平均體重[17]。

公式（2）中，HI（%）為危害指數(shù)；HQ（%）為危險(xiǎn)商；ADI（mg/kg d）為每日允許攝入量[18]。

公式（3）中，NEDI（mg/kg bw）為國(guó)家估計(jì)每日攝入量；STMRi（mg/kg）為農(nóng)藥在某一食品中的規(guī)范殘留試驗(yàn)中值；STMR－Pi（mg/kg）為用加工因子校正的規(guī)范殘留試驗(yàn)中值。

公式（4）中，RQ（%）為農(nóng)藥的慢性膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)商值[19]。

二、結(jié)果與討論

（一）方法的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線在0.010～0.50 mg/L 線性范圍內(nèi)，葡萄和土壤樣品中嘧菌環(huán)胺、異菌脲的峰面積（y）與農(nóng)藥的進(jìn)樣濃度（x）之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，其線性方程及定量限等見表2。

表2 嘧菌環(huán)胺和異菌脲在葡萄和土壤中的線性方程、相關(guān)系數(shù)和定量限（LOQ）

表3 嘧菌環(huán)胺和異菌脲在葡萄及土壤中的添加回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 （n＝5）

（二）回收率和精確度嘧菌環(huán)胺和異菌脲在葡萄及土壤樣品中的添加回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n＝5）測(cè)定結(jié)果見表3。由結(jié)果可見，按照上文中前處理、GC－QqQ－MS/MS 檢測(cè)條件，在葡萄空白樣品中，添加水平濃度嘧菌環(huán)胺和異菌脲的平均回收率分別為92%～108%和84%～105%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.1%～3.8%和3.5%～6.4%，土壤樣品中嘧菌環(huán)胺和異菌脲的平均回收率分別為95%～106%和98%～100%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.4%～2.9%和1.2%～5.7%，均符合NY/T 788－2004 《農(nóng)藥殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則》 中殘留物的檢測(cè)方法要求，表明該檢測(cè)方法是可行的。葡萄樣品中嘧菌環(huán)胺和異菌脲標(biāo)準(zhǔn)樣品典型譜圖見圖2。

圖2 葡萄嘧菌環(huán)胺（a）和異菌脲（b）標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜圖

圖3 葡萄中嘧菌環(huán)胺（a）與異菌脲（b）的消解趨勢(shì)

圖4 土壤中嘧菌環(huán)胺 （a）與異菌脲 （b）的消解趨勢(shì)

（三）消解動(dòng)態(tài)2016－2017年葡萄和土壤中嘧菌環(huán)胺與異菌脲的消解趨勢(shì)如圖3～圖4 所示，具體試驗(yàn)結(jié)果見表4。由結(jié)果可見，均符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程，隨著采樣間隔期的增加，農(nóng)藥總體呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)。受實(shí)際生長(zhǎng)環(huán)境中不可控因素的影響，其中有些采樣間隔期殘留量突然增大，但最終采樣間隔期35 d 時(shí)消解率在90%以上，在土壤中消解半衰期均＜30 d，說(shuō)明嘧菌環(huán)胺和異菌脲屬于易降解的農(nóng)藥。在葡萄中的半衰期在不同年份同一地點(diǎn)的差異不大，但在土壤中的半衰期在不同年份同一地點(diǎn)差異顯著，這可能與當(dāng)年施藥時(shí)間、氣溫、降水量、土壤中微生物的菌群和活躍程度有關(guān)。

表4 嘧菌環(huán)胺和異菌脲在葡萄及土壤中的消解動(dòng)態(tài)

（四）最終殘留以60%嘧菌環(huán)胺·異菌脲可濕性粉劑施藥2 次，施藥間隔7 d，末次施藥后7、10、14 d 采集葡萄和土壤樣品，測(cè)定其嘧菌環(huán)胺和異菌脲最終殘留量，結(jié)果見表5～表6。由結(jié)果可見，葡萄中嘧菌環(huán)胺和異菌脲的殘留量分別為0.35～16 mg/kg 和0.051～4.8 mg/kg，土壤中嘧菌環(huán)胺和異菌脲的殘留量分別為＜0.010～3.2 mg/kg和＜0.010～0.49 mg/kg。結(jié)果表明，隨著采樣間隔的增加，嘧菌環(huán)胺和異菌脲在葡萄和土壤中的殘留量均逐漸降低。距最后一次施藥時(shí)間7 d 后，嘧菌環(huán)胺和異菌脲在葡萄的殘留量均低于我國(guó)制定的最大殘留限量值，且土壤中嘧菌環(huán)胺和異菌脲的殘留量值低于葡萄中的相應(yīng)殘留值，對(duì)環(huán)境的風(fēng)險(xiǎn)影響相對(duì)較小。

表5 葡萄中嘧菌環(huán)胺和異菌脲最終殘留數(shù)據(jù)

表6 土壤中嘧菌環(huán)胺和異菌脲最終殘留數(shù)據(jù)

（五）風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估一般人群對(duì)某種食品的消費(fèi)量參見《2002年中國(guó)居民營(yíng)養(yǎng)與健康現(xiàn)狀》，其中水果的日均消費(fèi)量為0.0457 kg/d，人群的平均體重按照63 kg 計(jì)算，嘧菌環(huán)胺和異菌脲的ADI值分別為0.03 mg/kg bw 和0.06 mg/kg bw （GB 2763－2019），根據(jù)上文中風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)的計(jì)算公式，分別對(duì)葡萄中嘧菌環(huán)胺和異菌脲的殘留中值、殘留最大值和最大殘留限量值進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，其HI、HQ和RQ值見表7。試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，采樣間隔7 d 之后葡萄中嘧菌環(huán)胺和異菌脲的HQ、HI、RQ均小于100%，對(duì)人體健康風(fēng)險(xiǎn)較小且可控。

表7 嘧菌環(huán)胺和異菌脲在葡萄中的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

三、結(jié)論

根據(jù)推薦用量、施藥次數(shù)和采收間隔期，對(duì)60%嘧菌環(huán)胺·異菌脲可濕性粉劑在葡萄和土壤中進(jìn)行兩年兩地試驗(yàn)，嘧菌環(huán)胺在葡萄和土壤的半衰期是6.6～11.2 d，異菌脲在葡萄和土壤的半衰期是1.7～18.7 d。江景勇等[12]和顏麗菊等[13]的研究結(jié)果顯示，嘧菌環(huán)胺在草莓中的消解半衰期為5.776 d，異菌脲在不同品種的楊梅果實(shí)中的半衰期有差異，在“東魁楊梅” 中的半衰期為9.20 d，在 “臨海早大梅” 中的半衰期為13.86 d，這與本試驗(yàn)一致，同一作物不同品種的半衰期有一定差異。采收期間隔7 d 以后，嘧菌環(huán)胺在葡萄中的殘留量低于我國(guó)最大殘留限量值，但大于CAC、美國(guó)、澳大利亞、韓國(guó)、歐盟、日本制定的嘧菌環(huán)胺在葡萄中的最大限量值，因此在葡萄出口貿(mào)易中應(yīng)注意嘧菌環(huán)胺殘留量超標(biāo)問(wèn)題。采收期間隔7 d 以后，異菌脲在葡萄中的殘留量低于上述國(guó)家制定的最大殘留限量值。嘧菌環(huán)胺和異菌脲復(fù)配劑的相互作用也可能會(huì)影響在葡萄和土壤中的消解半衰期和最終殘留量，還有待進(jìn)一步探究。

我國(guó)已制定嘧菌環(huán)胺和異菌脲在葡萄中的最大殘留限量值 （MRL），結(jié)合兩年兩地的農(nóng)藥殘留量，分別對(duì)其各個(gè)采樣間隔期的殘留量中值、殘留量最大值和最大殘留限量值進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，從風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估指標(biāo)危險(xiǎn)商和風(fēng)險(xiǎn)商上看，采樣間隔期7 d 以后，其均小于100%，表明嘧菌環(huán)胺和異菌脲對(duì)一般人類的健康不會(huì)產(chǎn)生危險(xiǎn)。