艾米拉·奧肯，吳濤，白小慧，買吾蘭江·買提努爾*

（1.中國科學(xué)院新疆理化技術(shù)研究所干旱地區(qū)植物資源與化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆天然藥用植物資源利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊 830011；2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100039）

唇形科薄荷屬（Mentha L.）是一種傳統(tǒng)的用途廣泛的一年或多年生的芳香草本植物，分布于世界各地，特別是在歐亞大陸和非洲、南美洲等溫暖地區(qū)大量分布[1]。在18世紀(jì)中期，瑞典植物學(xué)家林奈建立了薄荷屬并記載了13種有關(guān)植物。之后，隨著人們的不斷探索，不但細(xì)分了原有的植物種類，而且新增了幾十個(gè)物種。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的薄荷屬植物的純種和變種分別約有30和140余種。薄荷屬植物生長(zhǎng)在潮濕的環(huán)境中，比如河流與湖泊附近，但在荒漠地區(qū)也曾發(fā)現(xiàn)過該種植物的生長(zhǎng)。該屬植物種類眾多，因?yàn)榫哂袕?qiáng)大的生態(tài)適應(yīng)能力，再加上可以無性繁殖等特點(diǎn)，在全國各地均有分布。根據(jù)《中國植物志》的記載，我國的薄荷屬植物有12種，其中5種為野生種，7種為引進(jìn)栽培品種，主要分布于黑龍江、吉林、遼寧等東北地區(qū)以及華東、西北等地區(qū)[2]。

薄荷屬植物中揮發(fā)油類和黃酮類化合物最為豐富，還含有萜類、氨基酸類、醌類、有機(jī)酸類等化合物[3]。從薄荷屬植物莖、葉中提取的薄荷油、椒樣薄荷油、留蘭香油經(jīng)過進(jìn)一步加工得到的薄荷腦等天然產(chǎn)物被廣泛地應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化妝品、香料、煙草等工業(yè)領(lǐng)域。薄荷屬植物具有味辛、性涼等特點(diǎn)，被認(rèn)為是一種良好的中藥和保健品。其功效主要為清熱解毒，因而可用于治療風(fēng)熱感冒、喉嚨腫痛、牙痛、喉痹、口舌生瘡、風(fēng)疹、蕁麻疹等疾病[4]。芳香植物不但具有多種藥用價(jià)值，而且其天然提取物是香精和香料的重要組成部分。與人工合成的香料相比，天然香料具有一些獨(dú)有的優(yōu)勢(shì)，除了具有毒性低、香味獨(dú)特等特點(diǎn)，還具有清除自由基、抗微生物等合成香料不具備的特點(diǎn)?；诖?，在眾多的產(chǎn)業(yè)中，特別是在醫(yī)藥、食品、化妝品等領(lǐng)域，天然植物被大量使用[5-6]。薄荷屬植物揮發(fā)油由于其有生物學(xué)特性，越來越受到人們的重視，其揮發(fā)油具有抗細(xì)菌[7]、抗真菌[8]、抗氧化[9]和殺蟲作用[10]。因此，本研究對(duì)新疆特有的4種薄荷屬植物：薄荷、亞洲薄荷、留蘭香、唇萼薄荷揮發(fā)油化學(xué)成分和生物活性進(jìn)行研究。采用氣相色譜四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（gas chromatography-quadrupole time of flight-mass spectrometry，GC-QTOF-MS）分析4種薄荷揮發(fā)油化學(xué)成分，并結(jié)合氣相色譜-氫火焰離子化檢測(cè)器（gas chromatography-flame ionization detector，GC-FID）來進(jìn)行定量。此外分別用半抑制濃度（IC50）和最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）值來評(píng)價(jià)揮發(fā)油抗氧化和抗菌活性，為后續(xù)薄荷屬植物活性成分的深入研究提供參考，為天然資源的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

薄荷（標(biāo)本號(hào)：WY-02268）、亞洲薄荷（標(biāo)本號(hào)：WY-02651）、留蘭香（標(biāo)本號(hào)：WY-02653）、唇萼薄荷（標(biāo)本號(hào)：WY-02652）：新疆恩薩爾維吾爾醫(yī)飲片藥業(yè)有限公司，所有樣品均經(jīng)過中國科學(xué)院新疆理化技術(shù)研究所魯春芳博士鑒定，標(biāo)本存于中國科學(xué)院新疆理化技術(shù)研究所。酵母膏（分析純）、蛋白胨（分析純）：天津市化學(xué)試劑二廠；氯化鈉（分析純）、無水乙醇（分析純）、無水硫酸鈉（分析純）：天津市河?xùn)|區(qū)紅巖試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

7890A-5975C型氣質(zhì)聯(lián)用儀：美國Agilent公司；HP-5MS毛細(xì)石英管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）：安捷倫公司；2000 mL揮發(fā)油提取器及回流冷凝裝置：四川蜀玻（集團(tuán)）有限責(zé)任公司；SpectraMax MD5酶標(biāo)儀：美谷分子儀器（上海）有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 薄荷揮發(fā)油提取流程

4種薄荷藥材→除雜→清洗→陰干→粉碎→稱重→水蒸氣蒸餾法（6 h）→收集→稱量→薄荷揮發(fā)油，計(jì)算揮發(fā)油提取率。

1.3.2 GC-QTOF-MS和GC-FID分析

將4種薄荷揮發(fā)油分別用GC-QTOF-MS進(jìn)行成分分析。色譜條件：起始溫度60℃，從60℃升溫至240℃，升溫速度10℃/min，保持5 min；進(jìn)樣口溫度為250 ℃；進(jìn)樣量 0.5 μL；分流比為 20 ∶1；以超純氦為載氣，流速為0.8 mL/min；溶劑延遲5 min。MS條件：電子能量70 eV；離子源溫度230℃；四極桿溫度150℃；質(zhì)量掃描范圍為m/z 40 amu～800 amu。

GC-FID色譜條件：HP-5石英毛細(xì)管色譜柱（30m×0.32 mm×0.25 μm）；升溫程序：初始溫度 60 ℃，以10℃/min速度升溫至240℃；載氣為高純氮?dú)猓?9.999%），氮?dú)饬魉贋?.8 mL/min；進(jìn)樣口溫度250℃；進(jìn)樣量0.5 μL；分流比20∶1。氫火焰離子化檢測(cè)器溫度300℃；氫氣流量30 mL/min；空氣流量400 mL/min；尾吹（氮?dú)猓┝髁浚?5 mL/min。

1.3.3 抗氧化活性的測(cè)定

1.3.3.1 DPPH自由基清除能力測(cè)定

用梯度稀釋法進(jìn)行試驗(yàn)，先用無水乙醇配制4種薄荷揮發(fā)油溶液，樣品初始濃度為100 mg/mL，在96孔板中分別加入100 μL樣品溶液和100 μL DPPH溶液（2 mmol/L），再梯度稀釋，濃度范圍在0.390 6 mg/mL～50 mg/mL，混勻后25℃下放置于暗處30 min，測(cè)定溶液在波長(zhǎng)517 nm處的吸光度，計(jì)算清除率。陽性對(duì)照組（VC和VE）用同樣方法進(jìn)行試驗(yàn)。清除率的計(jì)算公式如下。

式中：I為清除率，%；A0為空白液的吸光度值；AI為樣品和DPPH溶液的吸光度；As為樣品的吸光度[11]。

1.3.3.2 ABTS+自由基清除能力測(cè)定

ABTS+自由基清除能力試驗(yàn)采用 Hui′s法[12]，并稍加修改。7 mmol/L ABTS溶液和2.45 mmol/L高硫酸鉀混勻，在25℃避光條件下存放12 h～16 h，然后用無水乙醇將ABTS溶液稀釋至在734 nm處吸光度為0.70±0.2。在96孔板中加入 100 μL樣品溶液和100 μL ABTS溶液，梯度稀釋，濃度范圍為0.024 4 mg/mL～1.5625mg/mL，混勻后在室溫25℃下放置于暗處10min，測(cè)定該溶液在波長(zhǎng)734 nm處的吸光度，計(jì)算清除率，計(jì)算方法同1.3.3.1公式。陽性對(duì)照組（VC和VE）用同樣方法進(jìn)行試驗(yàn)。

1.3.4 揮發(fā)油最小抑菌濃度測(cè)定

采用微孔板稀釋法[13]測(cè)定4種薄荷揮發(fā)油對(duì)細(xì)菌[金黃色葡萄球菌（ATCC 6538）和真菌白色念珠菌（ATCC 10231）]的抑菌活性。將揮發(fā)油使用二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）稀釋成16 mg/mL的儲(chǔ)備液，使用LB培養(yǎng)基將精油儲(chǔ)備液配制成濃度為0.5mg/mL～16 mg/mL的藥液，每孔100 μL，然后在每孔中加入菌懸液，并保證其終濃度為5×105CFU/mL，37℃下孵育24 h。最低抑菌濃度為裸視下抑菌的最低藥物濃度，所有試驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 4種薄荷揮發(fā)油的化學(xué)成分和相對(duì)含量

4種薄荷的揮發(fā)油成分及其相對(duì)含量如表1所示。

表1 4種薄荷揮發(fā)油化學(xué)成分及相對(duì)含量Table 1 Composition and relative content of the essential oil from the four species of Mentha L.plants

續(xù)表1 4種薄荷揮發(fā)油化學(xué)成分及相對(duì)含量Continue table 1 Composition and relative content of the essential oil from the four species of Mentha L.plants

4種薄荷屬植物地上部分提取的揮發(fā)油呈淡黃色。4種薄荷揮發(fā)油提取率分別是薄荷1.2%，亞洲薄荷0.2%，留蘭香0.3%，唇萼薄荷0.5%，薄荷揮發(fā)油提取率相對(duì)較高，亞洲薄荷揮發(fā)油提取率最低。影響揮發(fā)油提取率的因素有氣候條件、藥材采集時(shí)間等。此外，揮發(fā)油產(chǎn)量和組成與遺傳、氣候因素、土壤條件、生長(zhǎng)期（營(yíng)養(yǎng)期或開花期）等有關(guān)[14-16]。由表1可知，從薄荷揮發(fā)油中鑒定出18種成分，而從亞洲薄荷揮發(fā)油中鑒定出13種成分，分別占總揮發(fā)油成分的98.00%和96.98%。在留蘭香揮發(fā)油和唇萼薄荷揮發(fā)油中鑒定出的化學(xué)成分分別占總揮發(fā)油成分97.91%和97.97%。

4種薄荷屬植物地上部分提取的揮發(fā)油化學(xué)成分主要為含氧單萜類。留蘭香與其它薄荷屬植物的區(qū)別在于高含量的香芹酮（74.00%）、β-石竹烯（5.72%）、石竹素（1.10%）。薄荷揮發(fā)油主要成分為薄荷醇（70.51%）、薄荷酮（8.21%）和辣薄荷酮（5.45%）。亞洲薄荷揮發(fā)油主要成分為辣薄荷烯酮氧化物（62.57%）和麝香草酚（13.35%）。唇萼薄荷揮發(fā)油主要成分為胡薄荷酮（69.30%）和薄荷酮（10.73%）。

2.2 不同濃度薄荷屬植物揮發(fā)油的抗氧化性

不同濃度的薄荷屬植物揮發(fā)油的DPPH自由基清除率見表2，ABTS+自由基清除率見表3。

表2 不同濃度薄荷屬植物揮發(fā)油的DPPH自由基清除率Table 2 DPPH free radical scavenging rates of essential oils from Mentha L.plants with different concentrations

表3 不同濃度薄荷屬植物揮發(fā)油的ABTS+自由基清除率Table 3 ABTS+free radical scavenging rates of essential oils from Mentha plants with different concentrations

本研究利用IC50值表示樣品抗氧化性的強(qiáng)弱。IC50值越小，表明樣品DPPH自由基清除能力越強(qiáng)，即樣品抗氧化性越強(qiáng)。從表2可以看出，隨著4種薄荷揮發(fā)油濃度的逐漸提高，DPPH自由基清除率也逐漸提高。薄荷揮發(fā)油DPPH自由基清除效果相對(duì)較弱，IC50值為3.74 mg/mL，而亞洲薄荷與唇萼薄荷揮發(fā)油具有較好的抗氧化活性，其IC50值分別達(dá)到1.74 mg/mL與1.55 mg/mL。留蘭香揮發(fā)油的DPPH自由基清除效果較明顯，其IC50值為1.36 mg/mL，清除率最高達(dá)到（96.14±0.78）%。陽性對(duì)照VC和VE對(duì)應(yīng)的IC50值分別為 0.36 μg/mL 與 3.4 μg/mL。

從表3可見，薄荷、亞洲薄荷、留蘭香、唇萼薄荷揮發(fā)油均有較強(qiáng)的ABTS+自由基清除能力，其清除率能夠達(dá)到99%以上，其中留蘭香揮發(fā)油IC50值為0.035 9 mg/mL，其ABTS+自由基清除率達(dá)到100%，薄荷與亞洲薄荷揮發(fā)油IC50值分別為 0.0423、0.0413mg/mL，唇萼薄荷揮發(fā)油IC50值為 0.038 0 mg/mL。陽性對(duì)照為VC、VE，其 IC50值分別為 0.032、0.41 μg/mL。試驗(yàn)結(jié)果表明，不同濃度的4種薄荷揮發(fā)油均有較好的抗氧化活性，因此，4種薄荷揮發(fā)油在天然抗氧化劑的開發(fā)中具有廣闊的應(yīng)用前景。

2.3 不同濃度薄荷屬植物揮發(fā)油抑菌效果

4種薄荷揮發(fā)油的抑菌活性試驗(yàn)采用了微孔稀釋法，該方法通過測(cè)定所選白色念珠菌和金黃色葡萄球菌的OD600變化來評(píng)價(jià)其抗菌活性，結(jié)果見圖1和圖2。

圖1 不同濃度的薄荷屬植物揮發(fā)油抑菌液對(duì)白色念珠菌的抑菌效果Fig.1 Antibacterial effect of different concentrations of four species of Mentha L.plants essential oils on C.albicans

圖2 不同濃度的薄荷屬植物揮發(fā)油抑菌液對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果Fig.2 Antibacterial effect of different concentrations of four species of Mentha L.plants essential oils on S.aureus

結(jié)果表明，4種薄荷揮發(fā)油對(duì)金黃色葡萄球菌、白色念珠菌都有明顯的抑制作用，但抑制效果大小不同，OD值越低抑菌活性越好，從不同濃度的4種薄荷屬植物揮發(fā)油培養(yǎng)的培養(yǎng)基OD值變化，可以判斷出最低抑菌濃度。試驗(yàn)結(jié)果表明，留蘭香揮發(fā)油抗菌活性相對(duì)較高，對(duì)白色念珠菌和金黃色葡萄球菌的MIC值分別為6.0 mg/mL和3.0 mg/mL。

3 結(jié)論

本文通過對(duì)4種不同品種薄荷揮發(fā)油化學(xué)成分和生物活性對(duì)比研究發(fā)現(xiàn)，新疆不同地區(qū)的4種薄荷精油都富含含氧單萜類化合物。4種精油都具有抗菌和抗氧化活性，其中留蘭香揮發(fā)油具有較好的生物活性，可能與其較高的香芹酮含量有關(guān)。