李鑠，王茂葉，臧雪燕，蔣鵬程，許文榮，張徐(.江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院&江蘇省檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇鎮(zhèn)江03；.江蘇大學(xué)消化病研究所, 江蘇鎮(zhèn)江00)

胃癌是我國(guó)常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一[1]。盡管近年來胃癌的發(fā)病率有下降趨勢(shì)，但早期胃癌缺乏特異性臨床表現(xiàn)，許多患者確診時(shí)已處于進(jìn)展期，喪失了手術(shù)機(jī)會(huì)。內(nèi)鏡結(jié)合增強(qiáng)CT是目前診斷早期胃癌的金標(biāo)準(zhǔn)，但此法為有創(chuàng)操作，不易作為診斷和監(jiān)測(cè)腫瘤進(jìn)展的長(zhǎng)期方法。血清學(xué)檢測(cè)癌胚抗原CEA、糖類抗原CA-199等指標(biāo)對(duì)早期胃癌的敏感性和特異性不高。因此，尋找新的診斷標(biāo)志物和治療策略尤為重要。

circRNA是一類新型的非編碼RNA，于20世紀(jì)70年代科學(xué)家研究植物病毒時(shí)被發(fā)現(xiàn)。既往研究人員認(rèn)為circRNA是前體mRNA加工過程中的副產(chǎn)物或者錯(cuò)誤剪接的結(jié)果，不具有生物學(xué)意義，未引起足夠重視。隨著高通量RNA測(cè)序(RNA-seq)技術(shù)和生物信息學(xué)的發(fā)展，circRNA現(xiàn)已被證實(shí)廣泛存在于各種生命體內(nèi)，具有細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、蛋白質(zhì)翻譯等重要的生物學(xué)功能，其異常表達(dá)影響著肺癌、肝癌及胃癌等多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[2]。諸多研究[3-5]也已證實(shí)，circRNA可通過結(jié)合蛋白和作為miRNA的海綿吸附分子參與胃癌的發(fā)病過程，具有成為胃癌診斷、預(yù)后監(jiān)測(cè)生物學(xué)標(biāo)志物的潛能。本文分別從circRNA的結(jié)構(gòu)功能、檢測(cè)方法及其與胃癌的相關(guān)研究進(jìn)展作一綜述，以期對(duì)胃癌的診斷、療效分析等提供參考。

1 circRNA

1.1circRNA的結(jié)構(gòu)與生物學(xué)功能 circRNA是一種單鏈共價(jià)閉合環(huán)狀的RNA。相比線性RNA，因其具有抵抗核酸外切酶的水解作用，故而穩(wěn)定性更高。根據(jù)基因編碼環(huán)化方式，circRNA可分為外顯子circRNA(exonic circRNA，ecircRNA)、內(nèi)含子circRNA(intronic circRNA，ciRNA)、外顯子-內(nèi)含子circRNA(exon-intron circular RNA，EIciRNA)以及基因間circRNA(intragenic circular，icircRNA)4大類[6]。circRNA具有許多潛在生物學(xué)功能，例如，(1)作為miRNA的海綿吸附分子：circRNA能起到競(jìng)爭(zhēng)內(nèi)源性RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)的功能，通過競(jìng)爭(zhēng)具有結(jié)合位點(diǎn)的miRNA，阻滯miRNA對(duì)其靶基因的抑制作用，進(jìn)而調(diào)控相關(guān)mRNA表達(dá)[7]。(2)結(jié)合相關(guān)蛋白質(zhì)：在細(xì)胞核中某些circRNA能夠與蛋白質(zhì)結(jié)合，充當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的“分子誘餌”，影響下游靶基因表達(dá)[8]。(3)調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄：ciRNA和EIciRNA可以通過與U1核內(nèi)小核糖核蛋白(small nuclear ribo-nucleoproteins,snRNP)以及位于其親本基因啟動(dòng)子上的RNA聚合酶Ⅱ(RNA-polⅡ)相互作用促進(jìn)其親本基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)[9]。(4)翻譯蛋白質(zhì)：有學(xué)者在肝炎病毒中發(fā)現(xiàn)circRNA可直接翻譯蛋白質(zhì)[10]。2017年,Legnini等[11]發(fā)現(xiàn)，circ-ZNF609在內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)序列(internal ribosome entry site,IRES)驅(qū)動(dòng)下翻譯小鼠成肌細(xì)胞中的蛋白質(zhì)；Pamudurti等[12]發(fā)現(xiàn),circMbl3可以翻譯果蠅中的蛋白質(zhì)。以上研究證實(shí)了circRNA新的功能，為今后circRNA的研究提供了新的方向。

1.2circRNA檢測(cè)技術(shù) 隨著對(duì)circRNA醫(yī)學(xué)研究?jī)r(jià)值認(rèn)識(shí)的深入，尋求快速、敏感、高效檢測(cè)circRNA的方法愈發(fā)重要。目前常用檢測(cè)circRNA的方法包括：(1)基因芯片技術(shù)(gene chip)：應(yīng)用相對(duì)成熟的檢測(cè)技術(shù)，通過將已知序列的分子探針固定在基片上，與標(biāo)記的樣本進(jìn)行雜交，通過檢測(cè)樣本雜交信號(hào)的強(qiáng)弱及分布情況以確定RNA序列，其具有高通量、特異性高的特點(diǎn)，但相對(duì)“封閉”，只能檢測(cè)已知的序列，無法檢測(cè)未知的circRNA，使用成本較高。(2)逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測(cè)技術(shù)：逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，通過實(shí)時(shí)檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)量，最終達(dá)到間接定量檢測(cè)circRNA的目的，該法廣泛應(yīng)用于基因芯片結(jié)果的驗(yàn)證以及circRNA在組織中表達(dá)水平的測(cè)定。但circRNA在體液中的含量極低，RT-PCR的敏感性無法滿足circRNA的基因檢測(cè)要求，此外，分析circRNA結(jié)果使用的2-△△Ct法需要人體內(nèi)源性穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參進(jìn)行矯正，而目前缺乏相應(yīng)的體液內(nèi)參指標(biāo)，限制了circRNA作為非侵入性診斷工具的應(yīng)用。

鑒于上述檢測(cè)方法的局限，有學(xué)者在其原理基礎(chǔ)上進(jìn)行改良，設(shè)計(jì)出針對(duì)外周體液中circRNA具有高敏感性的檢測(cè)方法。微滴式數(shù)字PCR(droplet digital PCR，ddPCR)是近年來對(duì)微量核酸表達(dá)進(jìn)行快速、準(zhǔn)確定量檢測(cè)的技術(shù)[13]。通過將含有circRNA目的基因的樣本進(jìn)行微滴化預(yù)處理，使其形成納米直徑大小油包水的微滴，使單個(gè)微滴獨(dú)立進(jìn)行PCR反應(yīng)，通過微滴檢測(cè)器捕捉單個(gè)微滴的熒光信號(hào)，高于閾值的熒光信號(hào)判斷為陽(yáng)性信號(hào)，否則判為陰性信號(hào)。按照泊松分布原理，通過計(jì)算得出原始樣本中circRNA濃度。ddPCR可準(zhǔn)確得出目標(biāo)核苷酸的濃度，適合對(duì)血清等體液中circRNA檢測(cè)，目前主要應(yīng)用于病毒和核酸類腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)。

為進(jìn)一步提高檢測(cè)的敏感性，研究人員基于不同原理設(shè)計(jì)出新的檢測(cè)技術(shù)。例如，雙鏈特異性核酸酶(duplex-specific nuclease，DSN)是一種從勘察加蟹的肝臟胰腺中分離提取的核酸酶，其能夠?qū)﹄p鏈DNA和DNA-RNA雜交體中DNA鏈進(jìn)行專一裂解，但對(duì)RNA和單鏈DNA幾乎沒有作用。Jiao等[14]利用DSN酶的這種特性實(shí)現(xiàn)對(duì)circRNA的快速精準(zhǔn)檢測(cè)。DSN酶介導(dǎo)的核酸酶誘導(dǎo)擴(kuò)增反應(yīng)是基于核酸酶水解作用形成的信號(hào)擴(kuò)增技術(shù)，該方法直接在溶液中將DSN酶與circRNA混合進(jìn)行快速檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單，敏感性高，不需要PCR擴(kuò)增過程，相較PCR減少假陽(yáng)性結(jié)果。具體機(jī)制見圖1。

圖1 DSN酶介導(dǎo)的核酸酶誘導(dǎo)擴(kuò)增反應(yīng)對(duì)circRNA的檢測(cè)機(jī)制

滾環(huán)擴(kuò)增(rolling circle amplification，RCA)技術(shù)由于其較高的擴(kuò)增效率及相對(duì)簡(jiǎn)單的反應(yīng)條件，受到眾多研究者的關(guān)注，近年來廣泛用于生命領(lǐng)域的檢測(cè)。RCA反應(yīng)體系中剪切酶在固定溫度下保持活性，使得反應(yīng)可在恒溫條件完成，與PCR相比無需熱循環(huán)過程進(jìn)行擴(kuò)增，可減少反應(yīng)裝置體積及成本。2019年，Liu等[15]在RCA反應(yīng)原理基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)出逆轉(zhuǎn)錄-滾環(huán)擴(kuò)增(reverse transcription-rolling circle amplification，RT-RCA)技術(shù)。其首先在反應(yīng)體系中加入脫氧核糖核酸(dNTPs)、剪切酶、環(huán)狀引物，讓環(huán)狀引物與circRNA結(jié)合，在ProtoScript Ⅱ逆轉(zhuǎn)錄酶作用下，以環(huán)狀引物為模板催化dNTPs形成反復(fù)銜接的環(huán)形核酸單鏈。而線性RNA無法產(chǎn)生足夠的重復(fù)序列，因此，可將circRNA與線性RNA進(jìn)行鑒別，與傳統(tǒng)方法相比，其具有操作簡(jiǎn)化、費(fèi)用較低、敏感性高的特點(diǎn)。具體機(jī)制見圖2。

圖2 RT-RCA對(duì)circRNA的檢測(cè)機(jī)制

目前對(duì)于circRNA的功能研究還在不斷深入，創(chuàng)新的檢測(cè)方法對(duì)于促進(jìn)circRNA的研究具有重要的作用。circRNA由于其豐度低、特異性不高，在高效檢測(cè)方面仍面臨許多困難。目前對(duì)于circRNA檢測(cè)的研究主要聚焦于如何提高檢測(cè)敏感性，降低檢測(cè)成本以及簡(jiǎn)化操作等方面，未來便攜、靈敏、經(jīng)濟(jì)、高通量、具有足夠特異性的檢測(cè)技術(shù)是最終發(fā)展的趨勢(shì)。表1將常見circRNA的檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行對(duì)比，根據(jù)檢驗(yàn)?zāi)康牟⒔Y(jié)合相關(guān)檢測(cè)技術(shù)特點(diǎn)，選擇經(jīng)濟(jì)合理的檢測(cè)方法。

表1 circRNA的檢測(cè)技術(shù)

2 circRNA與胃癌

2.1circRNA在胃癌中發(fā)生、發(fā)展的作用

2.1.1具有致癌作用的circRNA RNA測(cè)序分析表明，circRNA在胃癌組織中高度特異性表達(dá)，其表達(dá)水平與胃癌的惡性生物學(xué)行為有密切關(guān)系[16]。Zhang等[17]采用qRT-PCR證實(shí)circNRIP1在胃癌細(xì)胞中相對(duì)正常胃黏膜上皮細(xì)胞呈過量表達(dá)(P<0.001)，circNRIP1可通過結(jié)合miR-149-5p激活A(yù)KT1/mTOR信號(hào)通路，提示其與胃癌的增殖、侵襲和遷移相關(guān)。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)[18]，circPDSS1通過負(fù)調(diào)控miR-186-5p在體內(nèi)外促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖及侵襲，該負(fù)調(diào)控導(dǎo)致有絲分裂相關(guān)激酶2(never in mitosis gene A-related expressed kinase2，NEK2)的表達(dá)水平升高，影響DNA損傷和衰老調(diào)控機(jī)制。Zhu等[19]研究發(fā)現(xiàn)，circNHSL1與結(jié)合波形蛋白(vimentin，VIM)在胃癌組織中均呈高表達(dá)。大量研究證實(shí)，VIM與多種腫瘤的發(fā)展密切相關(guān)，通過進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),circNHSL1與VIM之間存在靶向關(guān)系，circNHSL1結(jié)合miR-1306-3p使得同源異型盒基因(sine oculis homeobox homolog1，Six1)表達(dá)增強(qiáng)，產(chǎn)物Six1轉(zhuǎn)錄因子通過結(jié)合VIM啟動(dòng)子區(qū)域，增強(qiáng)VIM表達(dá)，促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖。

2.1.2具有抑癌作用的circRNA Liu等[20]發(fā)現(xiàn)，相較癌旁組織，circ0002320在胃癌組織中呈低表達(dá)(P<0.001)，其進(jìn)一步采用熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization, FISH)檢測(cè)結(jié)果顯示，circ-0002320和miR-367-5p共同在細(xì)胞質(zhì)中定位，circ-0002320過表達(dá)上調(diào)細(xì)胞周期蛋白激酶抑制因子(p27 Kip1)在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)，并抑制胃癌生長(zhǎng)和侵襲。Zhang等[21]通過RNA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行生物信息學(xué)預(yù)測(cè)，circRNA表達(dá)譜數(shù)據(jù)分析以及RNA免疫沉淀技術(shù)驗(yàn)證，推導(dǎo)出源自LARP4基因位點(diǎn)的circLARP4海綿吸附miR-424，其高表達(dá)抑制胃癌細(xì)胞增殖、侵襲。目前仍有大量的circRNA尚未發(fā)現(xiàn)，其影響胃癌生物學(xué)行為的具體機(jī)制仍需探索。涉及與胃癌調(diào)控相關(guān)circRNA見表2。

表2 調(diào)控胃癌相關(guān)的circRNA

2.2circRNA作為早期胃癌潛在診斷標(biāo)志物 circRNA的特殊結(jié)構(gòu)使其能在外周體液及組織中穩(wěn)定存在，方便取樣檢測(cè)；此外circRNA在正常組織及腫瘤組織中的表達(dá)存在顯著差異，具有較高的特異性及敏感性，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有較高的關(guān)聯(lián)性，這些特點(diǎn)使其具備作為非侵入性診斷標(biāo)志物的條件。研究表明，circRNA具有臨床疾病早期診斷的潛在價(jià)值[23]。Wei等[24]研究發(fā)現(xiàn)，hsa_circRNA_102958在30例健康人對(duì)照者組織中的表達(dá)水平顯著低于胃癌患者，其作為診斷標(biāo)志物的ROC曲線下面積(area under curve，AUCROC)為0.74，敏感性及特異性分別為0.61和0.86，表明hsa_circRNA_102958具有一定診斷價(jià)值。Zhao等[25]通過qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，hsa_circ_0000181在胃癌患者組織和血清中相對(duì)健康人呈低表達(dá)，且組織樣本的特異性為0.852，明顯高于血清樣本的0.206，而胃癌患者血清標(biāo)本的敏感性為0.990，顯著高于組織標(biāo)本的0.539，表明血清中的circRNA相較于組織作為早期胃癌潛在診斷標(biāo)志物具有一定的優(yōu)勢(shì)。

為進(jìn)一步提高circRNA診斷早期胃癌的敏感性及特異性，有學(xué)者將幾種具有診斷價(jià)值的circRNA進(jìn)行組合分析。例如，Li等[26]研究發(fā)現(xiàn)，hsa_circ_0061276和hsa_circ_0001017在胃癌患者血漿和組織中均呈低表達(dá)，其AUCROC分別為0.851和0.849，但將這2種標(biāo)志物聯(lián)合分析，其AUCROC提高至0.912。表明與胃癌相關(guān)circRNA進(jìn)行組合分析，其診斷精確度較單項(xiàng)結(jié)果更高。與胃癌診斷相關(guān)的circRNA見表3。

表3 與胃癌診斷和預(yù)后相關(guān)circRNA

2.3circRNA作為胃癌預(yù)后輔助標(biāo)志物 胃癌具有易轉(zhuǎn)移、易復(fù)發(fā)、預(yù)后差的特點(diǎn)，尋找相關(guān)準(zhǔn)確判斷胃癌患者預(yù)后的生物學(xué)指標(biāo)，對(duì)于胃癌患者的臨床精準(zhǔn)化治療具有重要意義。circRNA通過多種調(diào)控信號(hào)通路影響胃癌的發(fā)生、發(fā)展，調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞的遷移、侵襲、增殖和凋亡能力，目前已發(fā)現(xiàn)多種circRNA與胃癌的預(yù)后相關(guān)。Rong等[27]研究發(fā)現(xiàn)，circPSMC3在胃癌組織中下調(diào)，其進(jìn)一步分析106例胃癌患者circPSMC3的表達(dá)水平并結(jié)合臨床病理資料，結(jié)果發(fā)現(xiàn)circPSMC3表達(dá)降低患者存在TNM分期升高、總生存期(overall survival，OS)縮短等現(xiàn)象，其鑒別診斷胃癌的AUCROC為0.93(95%CI：0.886～0.979，P<0.001)，當(dāng)cut-off值為9.965時(shí)，其敏感性及特異性分別為0.85、0.95，表明circPSMC3可作為獨(dú)立預(yù)測(cè)患者預(yù)后的指標(biāo)。Pan等[28]通過對(duì)108例胃癌患者臨床病理資料分析發(fā)現(xiàn)，circUBA1在胃癌組織中顯著高表達(dá)，其高表達(dá)與腫瘤體積、TNM分期相關(guān)；進(jìn)一步進(jìn)行多元生存分析發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)circUBA1患者的生存預(yù)后明顯較差(16.7% vs 45.6%,P<0.001)。Wei等[29]研究表明，circHIPK3在胃癌細(xì)胞系及組織中表達(dá)顯著上調(diào)，通過circHIPK3/miR-107/BDNF通路調(diào)控胃癌進(jìn)展，circHIPK3表達(dá)升高與胃癌患者預(yù)后不良顯著相關(guān)，有望成為胃癌預(yù)后判斷的良好檢測(cè)指標(biāo)。

3 外泌體來源的circRNA與胃癌

外泌體是具有雙膜結(jié)構(gòu)的微小囊泡，可由體內(nèi)多種細(xì)胞(包括腫瘤細(xì)胞)分泌釋放，通過在細(xì)胞間傳遞生物活性分子進(jìn)行生物信息交換并使受體細(xì)胞重新編程，源自腫瘤細(xì)胞的外泌體攜帶(包括circRNA等)囊泡內(nèi)的生物分子釋放給其他受體細(xì)胞，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移[30]。研究發(fā)現(xiàn)，胃癌細(xì)胞以外泌體形式將cikS-133遞送至前脂肪細(xì)胞，通過激活結(jié)構(gòu)域蛋白16(PR domain-containing 16, PRDM16)和抑制miR-133,以促進(jìn)前脂肪細(xì)胞向棕色樣細(xì)胞的分化，在胃癌相關(guān)惡病質(zhì)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[31]。Xie等[32]研究發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)外泌體circSHKBP1與胃癌患者預(yù)后不良相關(guān)，而手術(shù)治療后的胃癌患者體內(nèi)外泌體circSHKBP1水平普遍下降，其進(jìn)一步研究顯示，其通過抑制miR-582-3p使RNA結(jié)合蛋白(HUR)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)呈高表達(dá)，從而促進(jìn)血管生成和誘導(dǎo)腫瘤發(fā)展。此外，外泌體circSHKBP1與輔助伴侶蛋白STUB1競(jìng)爭(zhēng)性地與熱休克蛋白90(heat shock protein 90，HSP90)結(jié)合，防止HSP90泛素化，共同促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖。外泌體的脂質(zhì)雙分子層囊泡能夠保護(hù)內(nèi)容物不受核酸酶等微環(huán)境因素影響，有利于其在外周體液中循環(huán)流動(dòng)，參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，其作為circRNA的“天然運(yùn)輸工具”為早期胃癌的診治提供一種新的思路。

4 小結(jié)及展望

circRNA作為miRNA海綿，抑制其功能，可影響下游多種信號(hào)通路調(diào)控相關(guān)癌基因的表達(dá)，促進(jìn)胃癌的發(fā)生、發(fā)展。circRNA的特殊結(jié)構(gòu)使其具備易獲取、敏感性高、特異性強(qiáng)、不易降解的特點(diǎn)，相較傳統(tǒng)檢測(cè)物更具優(yōu)勢(shì)，更加符合作為胃癌早期診斷、預(yù)后評(píng)估生物學(xué)標(biāo)志物的標(biāo)準(zhǔn)。但目前有關(guān)circRNA僅限于理論研究，缺乏進(jìn)一步的臨床應(yīng)用。究其原因主要包括：(1)已知的circRNA大部分在多種腫瘤中均有表達(dá)，缺乏在特定腫瘤中特異性表達(dá)而在其他腫瘤中正常表達(dá)的circRNA，無法做到精準(zhǔn)檢測(cè)的要求；(2)分析檢測(cè)circRNA技術(shù)雖有發(fā)展，但仍無法滿足大規(guī)模檢測(cè)要求，限制了其在臨床中的應(yīng)用；(3)缺乏大規(guī)模、系統(tǒng)規(guī)范獨(dú)立個(gè)體樣本的驗(yàn)證，缺少高質(zhì)量的臨床數(shù)據(jù)應(yīng)用支持。

目前關(guān)于circRNA的研究還處于初級(jí)階段，存在大量circRNA的功能尚不可知以及在腫瘤中具體作用機(jī)制仍不清楚等問題，但circRNA自身初步展現(xiàn)的生物學(xué)特性使其在未來腫瘤領(lǐng)域具有巨大的研究?jī)r(jià)值。此外，仍需要加強(qiáng)circRNA的基礎(chǔ)研究成果向臨床應(yīng)用方面的轉(zhuǎn)化，以期盡早實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤的精準(zhǔn)化診治。