胡宏志，張艷麗，李 倩，郭雷洋，王 玲，劉亞玲*

(1.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院骨科，湖北 武漢 430022;2.河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院皮膚科，河北 石家莊 050051;3.河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院骨科，河北 石家莊 050051)

惡性黑色素瘤(melanoma,MM)是一種起源于神經(jīng)嵴黑色素細(xì)胞的高度侵襲性皮膚惡性腫瘤，臨床進(jìn)展迅速，易早期發(fā)生廣泛轉(zhuǎn)移，預(yù)后差[1]。近年來，MM的發(fā)病率和致死率均明顯上升，給患者及其家庭帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)和精神負(fù)擔(dān)。對于晚期MM患者，目前仍然沒有有效的治療方式控制腫瘤的局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。因此，亟待開發(fā)一種有效的治療方式激活宿主的免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生長期免疫記憶抑制腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。聲動力治療(sonodynamic therapy，SDT)是一種類似于光動力療法(photodynamic therapy,PDT)的治療方法，利用低強(qiáng)度超聲激活富集于腫瘤部位的高濃度聲敏劑產(chǎn)生大量活性氧(reactive oxygen specie，ROS)發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)[2]。值得注意的是，超聲波可以穿透深部軟組織而不受黑色素的影響，所以SDT比PDT更適用于富含黑色素的MM。由于腫瘤細(xì)胞旺盛的代謝反應(yīng)和腫瘤血管的非正常生長，導(dǎo)致腫瘤組織局部嚴(yán)重缺氧[3]，并且SDT過程的持續(xù)耗氧也會進(jìn)一步加劇氧缺乏，而缺氧會極大地降低ROS的產(chǎn)生效率，進(jìn)而影響SDT的治療效果[4]。此外，缺氧會限制免疫細(xì)胞對腫瘤的浸潤、加速腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[5]。因此，糾正腫瘤微環(huán)境的缺氧是提高SDT治療效果的首要任務(wù)之一。線粒體是細(xì)胞內(nèi)最重要的細(xì)胞器，是細(xì)胞有氧呼吸的主要來源場所。有文獻(xiàn)報道，線粒體相關(guān)氧化磷酸化過程中產(chǎn)生三磷酸腺苷后過度消耗氧氣是造成缺氧的主要原因之一[6]。因此，通過干預(yù)氧化磷酸化可以阻止三磷酸腺苷的產(chǎn)生，抑制腫瘤細(xì)胞對氧氣的消耗，從而解決腫瘤微環(huán)境缺氧的難題[5]。二甲雙胍(metformin,Met)是一種雙胍類口服降糖藥物，具有多種藥理作用機(jī)制，因其降糖效果顯著、不良反應(yīng)小、患者依從性好而備受關(guān)注。此外，文獻(xiàn)報道Met對在多種癌癥中表現(xiàn)出具有抗腫瘤作用，包括MM[7-8]。同時，Met可以抑制線粒體氧化呼吸鏈中復(fù)合物I的活性，降低腫瘤的氧消耗[7]。因此，SDT與Met聯(lián)用一方面可以降低內(nèi)源性氧消耗，改善缺氧對SDT的抵抗作用，以提高SDT的療效，另一方面可同時發(fā)揮Met的抗腫瘤效應(yīng)來增強(qiáng)SDT的治療效果。本課題組為開發(fā)有效的策略來改善SDT的抗腫瘤免疫反應(yīng)，激發(fā)宿主產(chǎn)生長期的免疫記憶，開展了相應(yīng)的初步研究，現(xiàn)報告如下。

1 資 料 與 方 法

1.1主要試劑 氧化石墨烯(graphene oxide,GO)、葉酸氨基聚乙二醇(Folate amino polyethylene glycol,FA-PEG-NH2)、Met、Ce 6、鼠來源的MM細(xì)胞B16-F10、RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、雙抗(青霉素+鏈霉素)、PBS、胰蛋白酶。

1.2方法

1.2.1材料合成 GO和FA-PEG-NH2通過縮合反應(yīng)獲得GO-PEG-FA。

1.2.2細(xì)胞活力檢測 使用CCK8試劑盒進(jìn)行細(xì)胞增殖檢測。將3×103個B16-F10細(xì)胞接種于96孔板中，并培養(yǎng)過夜。進(jìn)行相應(yīng)處理24 h后，將培養(yǎng)基替換為100 μL含有10% CCK-8溶液的培養(yǎng)基，避光孵育2 h后，在酶標(biāo)儀450 nm讀取吸光度。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用GraphPad Prism version 6.01統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)三次。計(jì)量資料比較采用單因素方差分析和SNK-q檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

CCK8結(jié)果表明SDT聯(lián)合Met可顯著增強(qiáng)SDT對B16-F10的抗腫瘤效應(yīng)，見表1。

表1 各組細(xì)胞中細(xì)胞增殖活力比較

3 討 論

初步研究結(jié)果表明，Met能增強(qiáng)SDT的抗腫瘤效應(yīng)，后續(xù)實(shí)驗(yàn)將完善相關(guān)實(shí)驗(yàn)并驗(yàn)證Met是否能有效緩解細(xì)胞內(nèi)缺氧，改善缺氧對SDT的抵抗作用，實(shí)現(xiàn)SDT/化療聯(lián)合抗腫瘤作用，增強(qiáng)SDT的抗腫瘤免疫效果。值得注意的是，文獻(xiàn)報道由SDT引發(fā)的抗癌免疫過于短暫和脆弱，無法有效抑制腫瘤生長和復(fù)發(fā)[9]。未甲基化胞嘧啶-磷酸鳥嘌呤的寡核苷酸(cytosine-phosphate-guanine,CpG)，作為一種免疫佐劑，可與漿細(xì)胞抗原呈遞細(xì)胞(包括樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)中的Toll樣受體9特異性結(jié)合，刺激免疫反應(yīng)產(chǎn)生輔助性T細(xì)胞1和促炎細(xì)胞因子[10-11]。通過聯(lián)合免疫佐劑增強(qiáng)SDT治療后的抗原特異性反應(yīng)，進(jìn)而誘導(dǎo)宿主對殘留腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生長期的免疫記憶，是一種有前景的治療策略。

綜上所述，本課題結(jié)合前期的工作基礎(chǔ)和初步實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)一種能實(shí)現(xiàn)有效激活宿主抗腫瘤免疫的納米治療平臺，實(shí)現(xiàn)化療/SDT/免疫治療協(xié)同增效激活免疫系統(tǒng)產(chǎn)生長期免疫記憶，抑制MM的復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。這一新的免疫治療策略通過激活宿主的抗腫瘤免疫反應(yīng)獲得更好的免疫治療效果，在未來的臨床轉(zhuǎn)化中具有很大的潛力。