苗岳松，劉 杰，劉 昕，王志勇

（承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院泌尿外科，河北 承德 067000）

膀胱癌（bladder cancer）在泌尿系統(tǒng)疾病中比較常見，是嚴(yán)重影響居民生命健康的惡性腫瘤，且膀胱癌的發(fā)病率位列全球惡性腫瘤的第9 位[1]，但在我國(guó)泌尿系統(tǒng)腫瘤中發(fā)病率和死亡率排第1 位[2]。近年來，由于膀胱癌診療的技術(shù)不斷發(fā)展，膀胱癌患者的預(yù)后生存時(shí)間比過去有顯著增加，但影響膀胱癌患者無進(jìn)展生存期的重要因素仍然是腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。研究表明，原發(fā)灶腫瘤脫落的細(xì)胞能夠進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)并發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，而循環(huán)系統(tǒng)中腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞學(xué)和基因遺傳學(xué)特征與原發(fā)灶內(nèi)腫瘤的一致[3-6]，原發(fā)灶內(nèi)的腫瘤細(xì)胞進(jìn)入外周血形成循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cells，CTCs），進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤的復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移。有學(xué)者報(bào)道，影像學(xué)檢查顯示的變化較外周血中CTCs 含量的變化滯后，提示循環(huán)腫瘤細(xì)胞的存在對(duì)腫瘤早期發(fā)生微轉(zhuǎn)移具有非常重要的意義[7]。已有研究證實(shí)，外周血中CTCs 含量可有效預(yù)測(cè)結(jié)直腸癌的預(yù)后、進(jìn)展和總生存率[8]。因此，檢測(cè)膀胱癌患者外周血中CTCs 含量可輔助診斷膀胱癌。基于此，本研究通過檢測(cè)膀胱癌患者外周血中CTCs 含量，探究CTCs 陽性率與膀胱癌患者臨床特征的相關(guān)性，以期發(fā)現(xiàn)CTCs 在膀胱癌診療中的作用，為臨床診治膀胱癌提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018 年10 月～2019 年6 月河北省承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院泌尿外科研究所收治的92例膀胱腫瘤患者作為試驗(yàn)組，其中男77 例，女22例，年齡38～87 歲，平均年齡（66.10±9.67）歲，中位年齡64 歲。依據(jù)術(shù)后病理結(jié)果，將試驗(yàn)組分為低級(jí)別尿路上皮癌30 例，高級(jí)別尿路上皮癌62 例，T1+T2期40 例，T3+T4期52 例，非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌39例，肌層浸潤(rùn)性膀胱癌53 例。對(duì)照組選自我院門診同期健康體檢者20 例，其中男12 例，女8 例，年齡38～82 歲，平均年齡（65.20±10.94）歲，中位年齡68歲。兩組性別、年齡比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究已通過河北省承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審查。

1.2 納入和排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：①未接受過放療、化療、免疫治療及靶向治療；②無其他部位惡性腫瘤；③膀胱腫瘤患者的組織標(biāo)本均經(jīng)過病理確診為膀胱癌；④試驗(yàn)組均達(dá)到相同的手術(shù)標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①原發(fā)病灶非膀胱的腫瘤；②患有免疫系統(tǒng)疾?。虎塾薪Y(jié)核病史；④隨訪治療期間放棄治療或轉(zhuǎn)院者。

1.3 方法

1.3.1 富集 CTCs 采用上海寶藤醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心開發(fā)的SE-iFISH 技術(shù)富集及液染。先采用陰性富集法和免疫熒光染色技術(shù)從外周血中粗略獲取CTCs，再通過非血源性細(xì)胞分離介質(zhì)將外周血中的紅細(xì)胞和白細(xì)胞去除后洗滌，獲得CTCs。

1.3.2 液染 選用熒光原位雜交技術(shù)染色鑒定CTCs含量。

1.3.3 實(shí)驗(yàn)步驟 ①外周血采集：使用8 號(hào)采血針和EDTA 抗凝采血管采集大于7.5 ml 的外周血，將樣本搖晃混勻。②富集和液染CTCs：取7.5 ml 外周血，離心后棄去上清液，將去上清后的剩余樣本倒入A管中；把其中的血細(xì)胞堆積到分離介質(zhì)上；將洗滌A管的洗滌液沿壁倒進(jìn)帶有分離液的B 管；離心后把上清和白膜層放入C 管；將磁珠放于加有清洗液平底離心管，混勻后放在磁力架上，靜置后棄上清，重懸至原體積；將清洗后的磁珠加入C 管后，把C 管放在搖床上，搖動(dòng)；加分離液于D 管中，把C 管中的磁珠混懸液滴在分離介質(zhì)上；離心后把上清液倒入E 管中，再向E 管中加入清洗液，離心后棄上清，加入清洗液，將液體加至平底離心管中；把平底離心管放在磁力架上后用移液槍將管內(nèi)液體轉(zhuǎn)移至F 管中；向F 管中加入清洗液，離心后棄上清，混勻細(xì)胞加入離心管中，將洗滌F 管后的洗滌液也加入H 管中；加入清洗液離心后棄上清；向細(xì)胞液中加入抗原修復(fù)液，向H 管中加入配制好的血細(xì)胞分析用染色液混合液，室溫避光孵育；洗滌液染后的細(xì)胞。加入組織固定液，涂片，室溫過夜晾干玻片。

1.4 熒光顯微鏡結(jié)果判讀 對(duì)已進(jìn)行原位雜交免疫熒光染色后的iFISH CTCs 玻片使用熒光顯微鏡進(jìn)行結(jié)果判讀。熒光信號(hào)釋義：紅色：抗人白細(xì)胞單克隆抗體群CD45；橙色：8 號(hào)染色體探針CEP-8 探針；綠色：CD31；藍(lán)色：細(xì)胞核定位染色劑DAPI。

1.5 結(jié)果分析 橙色熒光點(diǎn)為染色體著絲粒探針i－FISH 檢測(cè)結(jié)果。正常非腫瘤細(xì)胞為二倍體細(xì)胞，胞內(nèi)兩個(gè)熒光點(diǎn)；腫瘤細(xì)胞為多倍體細(xì)胞，胞內(nèi)大于兩個(gè)熒光點(diǎn)。藍(lán)色為DAPI 細(xì)胞核染色，所有有核細(xì)胞均為陽性。細(xì)胞無綠色信號(hào)，有橙色亮點(diǎn)，符合DAPI+/CD45-/CD31-/CEP8+（多倍體）CTCs 判定標(biāo)準(zhǔn)，見圖1。

圖1 SE-iFISH 對(duì)患者CTCs 的鑒定

1.6 觀察指標(biāo) 所有患者每月電話隨訪1 次，每隔3個(gè)月門診隨訪1 次，每隔6 個(gè)月復(fù)查1 次腹部和盆腔CT。對(duì)患者性別、年齡、浸潤(rùn)程度、病理分級(jí)、腫瘤分期、多樣性進(jìn)行分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用Graph Pad Prism 8.0 軟件繪制統(tǒng)計(jì)圖。計(jì)數(shù)資料以（n，%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料采用[M（P25，P75）]表示，行非參數(shù)檢驗(yàn)；ROC 曲線分析CTCs 診斷膀胱癌的臨界值，并計(jì)算其靈敏度、特異度、約登指數(shù)。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 術(shù)前CTCs 在膀胱癌診斷中的作用 使用ROC曲線判定區(qū)分膀胱癌組與對(duì)照組的臨界值，臨界值為1 個(gè)CTCs 時(shí)，AUC 面積和約登指數(shù)最大（AUC=0.951；Youden index=0.868），相應(yīng)的靈敏度為91.30%，特異度為95.50%，假陽性率為4.50%，假陰性率為8.70%，準(zhǔn)確性91.30%。因此，確立CTCs=1個(gè)/7.5 ml 為診斷膀胱癌的臨界值，術(shù)前膀胱癌患者外周血中CTC 的陽性率（CTC ≥1 個(gè)/7.5ml）為91.30%，對(duì)照組外周血中CTC 的陽性率4.50%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖2。

圖2 CTCs 對(duì)膀胱癌診斷的敏感性

2.2 CTCs 與膀胱癌患者臨床特征的關(guān)系 92 例膀胱癌患者檢測(cè)出CTCs 共計(jì)515 個(gè)，CTCs 范圍0～20個(gè)/7.5ml，中位數(shù)為4 個(gè)/7.5ml。不同浸潤(rùn)程度、病理分級(jí)的膀胱癌患者CTCs 陽性率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；不同年齡、性別、腫瘤分期、多樣性的膀胱癌患者CTCs 陽性率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 CTCs 與膀胱癌患者臨床特征的關(guān)系（n）

3 討論

CTCs 主要由原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶自發(fā)脫落或因手術(shù)操作釋放進(jìn)入外周血中[9]，在腫瘤細(xì)胞改變細(xì)胞外基質(zhì)成分的情況下，促使腫瘤細(xì)胞進(jìn)入血管內(nèi)[10]，形成能提高腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的CTCs 簇，使少量腫瘤細(xì)胞逃避掉失巢凋亡機(jī)制存活的腫瘤細(xì)胞[11]，從而導(dǎo)致腫瘤的復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移。CTCs 在健康人中很少檢測(cè)到，不過卻可以在大多數(shù)實(shí)體腫瘤患者的外周血液中檢測(cè)到CTCs[12]。因此，針對(duì)血液微轉(zhuǎn)移以及膀胱癌轉(zhuǎn)移的患者，可從循環(huán)系統(tǒng)中檢測(cè)CTCs 直接證明患者存在血液微轉(zhuǎn)移和腫瘤膀胱外轉(zhuǎn)移，進(jìn)而輔助臨床的診斷和治療[13,14]。目前已有多位學(xué)者證實(shí)CTCs 可以用于結(jié)直腸癌、前列腺癌的療效監(jiān)測(cè)和預(yù)后評(píng)價(jià)[15]，且采用SE-iFISH 技術(shù)檢測(cè)膀胱癌CTCs 的研究較少。因此，本研究利用SE-iFISH 技術(shù)檢測(cè)檢測(cè)膀胱癌患者外周血中的含量，探究CTCs陽性率與膀胱癌患者臨床特征的相關(guān)性，分析其在診療方面的應(yīng)用價(jià)值。

本研究顯示，試驗(yàn)組CTCs 陽性率為91.30%，高于CellSearch 系統(tǒng)CTCs 的4.90%～47.50%[16，17]，與其他同樣采用SE-iFISH 系統(tǒng)檢測(cè)CTCs 陽性率的研究結(jié)果基本一致[18，19]，進(jìn)一步證實(shí)了SE-iFISH 檢測(cè)系統(tǒng)優(yōu)于CellSearch 檢測(cè)系統(tǒng)。本研究結(jié)果顯示，CTCs的陽性率與浸潤(rùn)程度和病理分級(jí)有相關(guān)性，與患者的性別、年齡、腫瘤分期、多樣性、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無關(guān)，原因可能有以下兩點(diǎn)：①臨床醫(yī)師對(duì)腫瘤的分期和分級(jí)具有一定程度的主觀性；②本研究采用的檢測(cè)技術(shù)和腫瘤分組不同有關(guān)，有研究采用的流式細(xì)胞術(shù)是利用熒光標(biāo)記相應(yīng)抗體檢測(cè)CTCs，該法敏感度較低[20]，只能間接反映腫瘤患者外周血液CTCs 的含量，而本研究采用的SE-iFISH 檢測(cè)系統(tǒng)是將免疫熒光染色法與原位熒光雜交法結(jié)合，可直接檢測(cè)腫瘤患者外周血的CTCs 含量。

本研究還存在一定的局限性：樣本量較少，隨訪時(shí)間較短，未能對(duì)膀胱癌患者進(jìn)行生存分析。后期計(jì)劃進(jìn)一步加大樣本量，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，延長(zhǎng)隨訪時(shí)間，探究CTCs 與膀胱癌患者預(yù)后的關(guān)系。

綜上所述，CTCs 檢測(cè)相較于傳統(tǒng)的組織學(xué)檢測(cè)具有相對(duì)無創(chuàng)，且重復(fù)性好以及節(jié)省時(shí)間和成本的優(yōu)點(diǎn)，有利于對(duì)患者的診療及預(yù)后情況觀察。CTCs有望成為膀胱癌患者治療效果的觀察指標(biāo)，檢測(cè)CTCs 能夠?qū)Π螂装┑闹委熜Ч鸬捷^為準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)作用。