黃 城，姚 娟，燕建鋒，方 舒，宋遷甲

（石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院，新疆 石河子 832000）

心房顫動(dòng)（atrial fibrillation，AF）是最常見(jiàn)的持續(xù)性心律不齊，其發(fā)病率及死亡率均較高。據(jù)統(tǒng)計(jì)[1]，約1/3 的正常人有發(fā)生房顫的風(fēng)險(xiǎn)，與非房顫患者相比，其死亡風(fēng)險(xiǎn)增加了1.5～3.5 倍，中風(fēng)風(fēng)險(xiǎn)增加了5 倍，認(rèn)知功能下降風(fēng)險(xiǎn)增加了1.4～1.6 倍；20%～30%的房顫患者會(huì)出現(xiàn)心衰，16%～20%的出現(xiàn)抑郁，超過(guò)60%的患者存在生活質(zhì)量下降，年住院率達(dá)10%～40%。目前關(guān)于房顫的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，進(jìn)一步研究房顫的潛在機(jī)制可能為房顫的提供新的治療方法[2]。近年來(lái)，有關(guān)miRNA 對(duì)房顫的研究越來(lái)越多[3-5]。有人提出了幾種miRNAs 作為房顫的生物標(biāo)志物，但目前尚無(wú)可用于診斷目的[6]。目前關(guān)于miRNA 與房顫消融結(jié)果的研究較少。其他研究顯示，房顫患者的血漿miR-21 水平較對(duì)照組低，導(dǎo)管消融后1 個(gè)月miR-21 表達(dá)增加[7]。持續(xù)性房顫患者接受消融后，循環(huán)miR-21 水平也與房顫消融結(jié)果相關(guān)[8]?；诖?，本研究主要觀察房顫患者外周血中miRNAs 的變化情況，探討其對(duì)超速激活延遲整流鉀通道的影響，進(jìn)一步分析房顫可能的基因靶向治療機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2017 年1 月～2019 年10 月新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院經(jīng)病史、心電圖或動(dòng)態(tài)心電圖資料明確診斷為房顫，符合冷凍球囊消融術(shù)適應(yīng)癥并接受冷凍球囊消融術(shù)后隨訪3 個(gè)月無(wú)復(fù)發(fā)患者作為研究對(duì)象，共45 例，男35 例，女10 例。將術(shù)前全基因組測(cè)序作為對(duì)照組，術(shù)后測(cè)序作為試驗(yàn)組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①依據(jù)國(guó)際通用的診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]，房顫的診斷結(jié)合既往病史、房顫時(shí)癥狀、體征、心電圖或動(dòng)態(tài)心電圖明確；②左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）≥50%。排除標(biāo)準(zhǔn)：①年齡＞75 歲；②合并甲亢，糖尿病，高血壓，左室功能減低（EF＜40%），嚴(yán)重冠狀動(dòng)脈疾病，肝、腎功能障礙，急、慢性感染疾病以及心肌結(jié)構(gòu)性病變。所有患者均給予相同的藥物調(diào)節(jié)血壓、血脂，停用β-受體阻滯劑和其他抗心律失常藥物。本研究已經(jīng)新疆維吾爾族自治區(qū)人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)通過(guò)，所有研究對(duì)象均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器 Illumina NextSeq 500 測(cè)序儀（美國(guó)Illumina 公司），anoDrop ND-1000 分光光度計(jì)（美國(guó)Nanodrop 公司），總RNA 提取試劑盒（上海羽朵生物科技有限公司），DEPC 處理水（無(wú)錫菩禾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司），氯仿（上海蘇懿化學(xué)試劑有限公司20170415），無(wú)水乙醇（常熟市鴻盛精細(xì)化工有限公司20200910），SYBRGreen PCR 試劑盒（Thermo F -415XL），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Thermo#K1622），紅細(xì)胞裂解液（無(wú)錫菩禾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司），低溫冷凍離心機(jī)（eppendorf 德國(guó)艾本德股份公司5417R），Real-time 檢測(cè)儀（ThermoFisher Scientific 賽默飛世爾科技＜中國(guó)＞有限公司ABI-7500）。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)步驟 分別抽取試驗(yàn)組、對(duì)照組清晨空腹外周靜脈血4 ml，置于EDTA 抗凝管中，2 h 內(nèi)分離血漿，離心后吸取上清液置凍存管中，-80 ℃冰箱保存。提取總RNA 均采用標(biāo)準(zhǔn)試劑盒，經(jīng)瓊脂糖電泳和Nanodrop 質(zhì)檢和定量后，構(gòu)建好文庫(kù)，Agient 2100 Bioanalyzr 進(jìn)行文庫(kù)質(zhì)量測(cè)定，混合好的不同樣品的測(cè)序文庫(kù)，通過(guò)0.1 mol/L NaOH 變性生成單鏈DNA 分子，在Iumina flow cell 上捕獲，原位擴(kuò)增為簇（cluster），根據(jù)說(shuō)明，在Ilumina NextSeq 500 測(cè)序儀上進(jìn)行51 個(gè)cycle 測(cè)序。測(cè)序完成后，使用Solexa CHASTITY 質(zhì)控篩選原始reads 得到Clean Reads。用cutadapt 以對(duì)Clean Reads 去接頭，并留下長(zhǎng)度≥15 nt 的tag 得到trimmed reads。利用miRDeep2 軟件使用所有trimmed reads 進(jìn)行已知miRNA 定量和新miRNA 預(yù)測(cè)。最后用實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)驗(yàn)證和蛋白定量分析差異表達(dá)顯著的基因來(lái)確保實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。其中，實(shí)驗(yàn)中所有研究對(duì)象血液樣品中總RNA 的提取均使用總RNA抽提試劑盒，cDNA 的反轉(zhuǎn)錄使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Thermo #K1622）。以GAPDH 為內(nèi)對(duì)照基因，采用2-△△CT法計(jì)算各組中基因的相對(duì)表達(dá)量。引物序列見(jiàn)表1。

表1 mcirRNA 水平實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)引物序列

1.3 觀察指標(biāo) 比較兩組miRNA 表達(dá)差異，并通過(guò)mirbase、miranda、targetscan3 個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行靶基因分析，對(duì)存在差異的miRNA 進(jìn)行實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和蛋白質(zhì)印跡法驗(yàn)證。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)錄入Excel 表格，應(yīng)用SPSS 23.0 軟件包和ABI Prism 7500 SDS Software軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以（）表示，比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以（n）表示，比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組miRNA 表達(dá)比較 全基因組測(cè)序顯示，兩組miRNA 表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中has-miR-134-5p 等15 個(gè)miRNAs 術(shù)后下調(diào)，has-miR-1255a 等6 個(gè)miRNAs 術(shù)后上調(diào)，見(jiàn)表2。

2.2 兩組miRNA 靶基因預(yù)測(cè) 通過(guò)設(shè)定閾值為1.5倍差異，P≤0.05 且組內(nèi)CPM 均值≥1 來(lái)篩選差異表達(dá)的miRNAs，結(jié)果顯示，代表KCNA5 的hsamiR-4433b-3p miRNA 與房顫密切相關(guān)，術(shù)前定量表達(dá)的CPM 值為0.741，術(shù)后CPM 值為-1.643，術(shù)前與術(shù)后相比表達(dá)下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 兩組KCNA5 蛋白表達(dá)量比較 RT-PCR 結(jié)果顯示，試驗(yàn)組血清中KCNA5 表達(dá)水平較對(duì)照組下調(diào)[（0.398±0.060）vs（1.000±0.035）]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=15.996，P=0.004）。Western Blot 檢測(cè)顯示，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組KCNA5 的表達(dá)水平降低，見(jiàn)圖1、圖2。

3 討論

心臟細(xì)胞中的超快速延遲整流器（IKur）電流由電壓門控鉀離子通道Kv1.5 介導(dǎo)，它通過(guò)影響心房肌細(xì)胞動(dòng)作電位時(shí)程（APD）和有效不應(yīng)期（ERP）影響心房的正常節(jié)律和頻率，房顫的發(fā)生發(fā)展與電壓門控鉀離子通道有著千絲萬(wàn)縷的關(guān)系。而Kv1.5 蛋白由KCNA5 基因編碼，已有研究[10]表明KCNA5 基因單核苷酸多態(tài)性rs3741930 位點(diǎn)與特發(fā)性房顫（IA）發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)，特發(fā)性房顫患者KCNA5 基因通常攜帶C 等位基因。Ni H 等[11]通過(guò)使用多尺度機(jī)電模型強(qiáng)調(diào)了IKur 在調(diào)節(jié)人心房收縮性中的重要作用，功能獲得性KCNA5 突變對(duì)心房收縮力有嚴(yán)重?fù)p害。王汝朋等[12]發(fā)現(xiàn)房顫患者超快激活的延遲整流鉀電流通道表達(dá)下調(diào)顯著的是KCNA5 基因，較為顯著的更多的是鉀離子通道，預(yù)示房顫電重構(gòu)與鉀離子通道重構(gòu)有著密切聯(lián)系。

表2 兩組miRNA 表達(dá)比較

圖1 KCNA5 蛋白表達(dá)量條形圖

圖2 KCNA5 蛋白表達(dá)的Western Blot 圖

本次研究發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)組患者外周血中miRNA 水平與對(duì)照組完全不同，手術(shù)可能作為外在因素通過(guò)逆轉(zhuǎn)KCNA5 的電重構(gòu)，從而影響miRNA 的表達(dá)使房顫離子通道離子流失調(diào)，提示miRNA 可能通過(guò)改變心房細(xì)胞的電生理特性而參與了房顫的發(fā)病過(guò)程。miRNA 是一類保守非編碼分子，長(zhǎng)度約為18～25 個(gè)核苷酸，它能夠抑制mRNA 翻譯或者沉默目的基因，抑制轉(zhuǎn)錄后水平上靶基因表達(dá)[13]，其原理是通過(guò)與其靶基因mRNA 的3' 非翻譯區(qū)堿基配對(duì)結(jié)合。據(jù)報(bào)道，miR 122、miR-155-5p、miR-24-3p、miR-223 與房顫的進(jìn)展有關(guān)[14，15]。在由miRNA 的致病性上調(diào)引起的疾病中，敲除方法（如miRNA 海綿）可用于將上調(diào)的致病性miRNA 恢復(fù)到正常水平[16]。Lu Y 等[17]采用微陣列分析方法評(píng)估了犬模型和房顫患者心房樣本的miRNA 表達(dá)譜，通過(guò)實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-223、miR-328 和miR-664 隨房顫發(fā)生顯著上調(diào)，而miR-101、miR-320 和miR-499 表達(dá)下調(diào)。早期研究表明[18]，射頻消融術(shù)通過(guò)影響房顫患者離子通道蛋白表達(dá)，從而促進(jìn)離子通道電流再平衡，miRNA-1266 等miRNAs 有可能是房顫未來(lái)新的干預(yù)靶點(diǎn)。本次研究發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)組hsa-miR-4433b-3p 表示上調(diào)，RT-PCR 驗(yàn)證和蛋白定量分析顯示作為調(diào)控超速延遲整流鉀通道上動(dòng)作電位平臺(tái)期鉀離子外流的通道蛋白KCNA5 基因表達(dá)較對(duì)照組增加，鉀離子在平臺(tái)期外流增加，而試驗(yàn)組則相反?？紤]房顫的電重構(gòu)可能與超速延遲整流鉀通道的離子通道蛋白重構(gòu)和離子流改變有關(guān)，冷凍球囊手術(shù)改變了房顫的離子通道蛋白重構(gòu)，使表達(dá)調(diào)控的miRNAs 增加。Colman MA 等[19]研究明確了KCNA5 基因的6 個(gè)新突變，這些突變體同時(shí)表現(xiàn)出心房特異性超速延遲整流鉀通道電流的功能獲得和功能喪失，并闡明和量化這些KCNA5 突變對(duì)心房電活動(dòng)的功能影響，與本研究結(jié)果一致。

本研究選擇了代表調(diào)控超速激活延遲整流鉀通道蛋白miRNA 的KCNA5 基因進(jìn)行了RT-PCR 驗(yàn)證，校正用內(nèi)對(duì)照基因（管家基因GAPDH）。兩組表達(dá)差異結(jié)果與測(cè)序結(jié)果大致相同，上調(diào)或下調(diào)的趨勢(shì)相同，RT-PCR 驗(yàn)證與蛋白定量分析結(jié)果一致，提示冷凍球囊手術(shù)改變了超速延遲整流鉀通道離子流原始平衡狀態(tài)，起到了再平衡作用，對(duì)調(diào)控心臟超速激活延遲整流鉀通道蛋白的miRNA 存在一定影響，提示hsa-miR-4433b-3p 可能為房顫的潛在生物標(biāo)志物。

綜上所述，冷凍球囊消融術(shù)影響了房顫離子流的動(dòng)態(tài)平衡，調(diào)控編碼超速激活延遲整流鉀通道蛋白的hsa-miR-4433b-3p 等miRNAs 有可能為房顫新的生物標(biāo)識(shí)物和潛在的治療靶標(biāo)。