李顯波 楊洋 彭劍濤 吳有祥 歐明毅 劉素參

摘 要：為探討貯存時(shí)間和產(chǎn)地對(duì)煙葉中性致香物質(zhì)含量的影響，選取2012年、2013年和2014年入庫(kù)的云南楚雄、貴州黔西南及福建三明復(fù)烤片煙，采用頂空固相微萃?。℉S-SPME）結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）技術(shù)測(cè)定其主要中性致香物質(zhì)含量，采用方差分析、熱力圖、主成分分析及判別因子分析等手段分析香氣物質(zhì)特征，研究不同貯存時(shí)間和產(chǎn)地?zé)熑~中性致香物質(zhì)的含量差異和特征差異。研究結(jié)果表明，類(lèi)胡羅卜素降解產(chǎn)物、揮發(fā)性醇類(lèi)、揮發(fā)性酮類(lèi)、新植二烯、西柏烷衍生物、其它類(lèi)和中性致香物質(zhì)總含量隨著貯存時(shí)間的延長(zhǎng)均呈現(xiàn)先升高而后顯著降低的變化趨勢(shì)，不同產(chǎn)地間各中性致香物質(zhì)含量也存在著較大差異，以直鏈脂肪酸酯、烴類(lèi)和揮發(fā)性醇類(lèi)的含量差異最為明顯。通過(guò)對(duì)中性致香物質(zhì)的特征分析發(fā)現(xiàn)，可將中性致香物質(zhì)作為判定不同產(chǎn)地和醇化程度的相關(guān)指標(biāo)，判定方法則以判別因子分析最為適宜。

關(guān)鍵詞：煙葉;貯存時(shí)間;產(chǎn)地;中性致香物質(zhì);判別因子分析

Abstract：In order to explore the effects of storage time and place of origin on the content of neutral aroma substances in tobacco leaves，flue-cured tobacco from Chuxiong of Yunnan province，Qianxinan of Guizhou province and Sanming of Fujian province，which were put into storage in 2012，2013 and 2014，were selected to determine the content of neutral aroma substances by headspace solid phase microextraction （HS-SPME） combined with gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS）.The characteristics of aroma compounds were analyzed by variance analysis，thermodynamic diagram，principal component analysis and discriminant factor analysis，and the differences and characteristic changes of neutral aroma compounds in tobacco leaves in different storage time and producing areas were studied.The results showed that the total contents of carotene degradation products，volatile alcohols，volatile ketones，neophytadienes，cypressene derivatives，other types and total content of neutral aroma compounds showed a trend of first increase and then significant decrease with the extension of storage time.There were also significant differences in the contents of neutral aroma compounds among different production areas，with the most obvious differences in the content of straight-chain fatty acid esters，hydrocarbons and volatile alcohols.Through the analysis of the characteristics of neutral aroma compounds，it is found that neutral aroma substances can be used as the relevant indicators to determine different producing areas and storage time，The determination method is the most appropriate discriminant factor analysis.

Keywords：tobacco leaf; storage duration; producing area; neutral aroma substance; discriminant factor analysis

煙葉經(jīng)過(guò)采收、初烤、復(fù)烤后，往往還存在青雜氣較重、刺激性較大、吃味不夠醇和等品質(zhì)缺陷，不能直接用于卷煙生產(chǎn)[1-3]，為了減小煙葉品質(zhì)上的不足，工業(yè)上往往將復(fù)烤后的煙葉進(jìn)行醇化，以達(dá)到消除青雜氣、減輕刺激性、改善余味及提高煙葉燃燒性等目的，減少煙葉品質(zhì)的固有缺陷，滿(mǎn)足工業(yè)生產(chǎn)的需求[3-6]。醇化是卷煙生產(chǎn)過(guò)程中改善煙葉品質(zhì)和提高煙葉可用性必不可少的重要環(huán)節(jié)，也是改善煙葉質(zhì)量必不可少的環(huán)節(jié)之一[7-9]。煙葉醇化可促進(jìn)煙葉內(nèi)在化學(xué)成分的轉(zhuǎn)化，通過(guò)一系列的化學(xué)及生物反應(yīng)將不利于煙葉品質(zhì)的組分轉(zhuǎn)換成有利于提升煙葉品質(zhì)組分的過(guò)程[10-12]。致香物質(zhì)指分子量小、具有揮發(fā)性、可以作用于人的嗅覺(jué)器官、使人產(chǎn)生愉悅感覺(jué)的化學(xué)成分，直接影響了煙葉的品質(zhì)，很大程度上決定了煙葉品質(zhì)的優(yōu)與劣，是評(píng)定煙草及其制品的重要因素之一[13-14]。

國(guó)內(nèi)外對(duì)煙葉醇化過(guò)程中致香物質(zhì)和感官質(zhì)量的變化展開(kāi)了大量研究[15-19]，但大多都局限于分析煙葉醇化過(guò)程中煙葉致香物質(zhì)和感官質(zhì)量的變化趨勢(shì)，沒(méi)有對(duì)致香物質(zhì)相關(guān)特征進(jìn)行分析，也未系統(tǒng)闡明致香物質(zhì)含量差異與煙葉醇化時(shí)間和產(chǎn)地的關(guān)系。因此，本文采用方差分析、熱力圖、主成分分析、判別因子分析探討產(chǎn)地及貯存時(shí)間對(duì)煙葉中性致香物質(zhì)含量的影響，并通過(guò)分析不同產(chǎn)地?zé)熑~在醇化過(guò)程中中性致香物質(zhì)特征差異，為更好地闡釋中性致香物質(zhì)含量在不同產(chǎn)地和貯存時(shí)間的變化及其特征差異提供一定的依據(jù)，為評(píng)判煙葉醇化程度提供相關(guān)指標(biāo)和鑒定方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選取2012年、2013年和2014年入庫(kù)的云南楚雄、貴州黔西南及福建三明復(fù)烤片煙，于2017年9月取樣，2018年10月測(cè)定煙葉中性致香物質(zhì)含量，樣品由貴州中煙工業(yè)有限公司技術(shù)中心提供并進(jìn)行感官質(zhì)量評(píng)價(jià)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 取樣方法

取樣時(shí)采用五點(diǎn)取樣法，從煙葉醇化庫(kù)中選取對(duì)應(yīng)醇化時(shí)間和產(chǎn)地的醇化煙葉，抓取共計(jì)0.5 kg的煙葉樣品。

1.2.2 樣品制備

將煙葉在烘箱中于45℃條件下烘干5 h后研磨（粉碎時(shí)間為20 s），過(guò)40目篩后裝在自封袋中，于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 測(cè)定項(xiàng)目與方法

中性致香物質(zhì)的測(cè)定：稱(chēng)取3 g（準(zhǔn)確至0.01 g）樣品，放入20 mL頂空瓶中，加入20 μL濃度為3.059 mg/mL乙酸苯乙酯的二氯甲烷溶液作為內(nèi)標(biāo)，加蓋密封。采用DVB/CAR/PDMS萃取頭和CTC/Combo/PAL自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)行頂空萃取，萃取溫度80℃，平衡時(shí)間30 min，萃取時(shí)間1200 s。萃取結(jié)束后纖維頭插入進(jìn)樣口，于250℃不分流進(jìn)樣模式下解析5 min。NIST08和WILEY275譜庫(kù)檢索定性，內(nèi)標(biāo)法定量，重復(fù)稱(chēng)量測(cè)定3次。

色譜條件：DB-5MS毛細(xì)管氣相色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）;程序升溫：初始溫度60℃，以5℃/min升至130℃，然后以1℃/min升至140℃，最后以5℃/min升至240℃，保持10 min;進(jìn)樣口溫度：270℃;傳輸線溫度：270℃;不分流進(jìn)樣;載氣：氦氣，流速為1.0 mL/min。

質(zhì)譜條件：EI源;電子轟擊能量：70 eV;離子源溫度：230℃;質(zhì)量掃描范圍33～350 u。

感官質(zhì)量評(píng)價(jià)：由貴州中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心組織感官質(zhì)量的評(píng)吸，將各貯存時(shí)間和產(chǎn)地的煙葉卷制成卷煙成品，分發(fā)于各評(píng)吸專(zhuān)家（7人以上），對(duì)其香氣質(zhì)、香氣量、吃味、雜氣、刺激性進(jìn)行打分，計(jì)算各專(zhuān)家打分平均分作為感官質(zhì)量評(píng)分。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理方法

采用Excel 2007對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理與制圖，SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)的方差分析，Origin 2019實(shí)現(xiàn)對(duì)數(shù)據(jù)的主成分分析、判別因子分析和熱力圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 貯存時(shí)間和產(chǎn)地對(duì)煙葉中性致香物質(zhì)和感觀質(zhì)量的影響

2.1.1 醇化年限和產(chǎn)地對(duì)煙葉感官質(zhì)量的影響

由表1可知，隨著煙葉貯存時(shí)間的增加，三明煙葉的香氣質(zhì)無(wú)變化，香氣量和吃味呈現(xiàn)先增后穩(wěn)定不變，雜氣先減后增，刺激性先增后穩(wěn)定不變，總得分逐漸升高的趨勢(shì);黔西南煙葉的香氣質(zhì)、香氣量、吃味、雜氣呈現(xiàn)先增后減，刺激性先減后穩(wěn)定不變，總得分逐漸升高的趨勢(shì);楚雄煙葉香氣質(zhì)和吃味無(wú)變化，香氣量、刺激性、總得分先減后增，雜氣逐漸降低的趨勢(shì)。不同產(chǎn)地間，香氣質(zhì)在各產(chǎn)地間無(wú)明顯差異，三明和黔西南煙葉的香氣量和總得分高于楚雄，刺激性低于楚雄，三明煙葉雜氣較高，黔西南煙葉吃味較低，楚雄煙葉刺激性較高。但在不同貯存時(shí)間和不同產(chǎn)地間煙葉各感官質(zhì)量得分的變化并不大。

2.1.2 醇化年限和產(chǎn)地對(duì)煙葉中性致香物質(zhì)的影響

表2為不同貯存時(shí)間和不同產(chǎn)地間煙葉中性致香物質(zhì)含量的方差分析，從中可知，新植二烯和西柏烷衍生物茄酮的含量最高，在16.65～41.50 μg/g間，類(lèi)胡羅卜素降解產(chǎn)物和、揮發(fā)性酮類(lèi)和其他類(lèi)次之，含量在0.58～1.58 μg/g間，直鏈脂肪酸酯和烴類(lèi)最低，為0.10～0.47 μg/g間，中性致香物質(zhì)的含量呈現(xiàn)新植二烯、西柏烷衍生物>類(lèi)胡羅卜素降解產(chǎn)物、揮發(fā)性酮類(lèi)>揮發(fā)性醇類(lèi)>直鏈脂肪酸酯、烴類(lèi)。隨著貯存時(shí)間的延長(zhǎng)，煙葉中性致香物質(zhì)含量總體呈現(xiàn)先顯著升高后顯著降低的變化趨勢(shì)，2013年入庫(kù)的煙葉中性致香物質(zhì)含量最高，2012年的最低，其中以新植二烯、揮發(fā)性酮類(lèi)、西柏烷衍生物和類(lèi)胡羅卜素降解產(chǎn)物的變化差異最為明顯;不同產(chǎn)地?zé)熚吨行灾孪阄镔|(zhì)含量呈現(xiàn)岀部分的顯著差異，其中直鏈脂肪酸酯含量在不同產(chǎn)地和不同貯存時(shí)間均達(dá)到顯著差異，烴類(lèi)物質(zhì)含量在2012年和2014年三明煙葉顯著低于黔西南和楚雄，揮發(fā)性醇類(lèi)黔西南煙葉在2013年顯著低于三明和楚雄，三明煙葉揮發(fā)性酮類(lèi)和新植二稀含量在2014年顯著高于楚雄，黔西南煙葉西柏烷衍生物含量在2012年顯著高于三明。

2.2 中性致香物質(zhì)的特征分析

2.2.1 中性致香物質(zhì)的熱力圖

圖1是對(duì)煙葉中性致香物質(zhì)含量進(jìn)行歸一化處理后的熱力圖。在不同貯存時(shí)間煙葉中性致香物質(zhì)含量隨貯存時(shí)間呈現(xiàn)先增加后降低的變化，但其含量總體呈降低的趨勢(shì)，2013年入庫(kù)煙葉的含量明顯高于2012年和2014年;不同產(chǎn)地?zé)熑~2014年入庫(kù)的三明煙葉除烴類(lèi)、其它類(lèi)和揮發(fā)性醇類(lèi)明顯低于黔西南和楚雄，其余中性致香物質(zhì)含量明顯高于黔西南和楚雄，2012年和2013年三明煙葉直鏈脂肪酸酯含量明顯高于黔西南和楚雄，烴類(lèi)明顯低于黔西南和楚雄，三明煙葉西柏烷衍生物在2012年明顯低于黔西南和楚雄，揮發(fā)性酮類(lèi)高于黔西南和楚雄。表明通過(guò)熱力圖可以明顯的看出不同貯存時(shí)間中性致香物質(zhì)的含量差異，不同產(chǎn)地間揮發(fā)性酮類(lèi)、直鏈脂肪酸酯、烴類(lèi)含量有著明顯差異。

2.2.2 中性致香物質(zhì)的主成分分析

圖2為基于中性致香物質(zhì)含量的3個(gè)貯存時(shí)間和3個(gè)產(chǎn)地的煙葉樣品PCA第1、2主成分得分圖。通過(guò)主成分分析的橫坐標(biāo)（第一主成分得分）可將2013年入庫(kù)煙葉與2012年和2014年入庫(kù)的煙葉很好地區(qū)分開(kāi)，但不能區(qū)分2012年和2014年入庫(kù)的煙葉;縱坐標(biāo)（第二主成分得分）可將福建三明煙葉與貴州黔西南和云南楚雄煙葉區(qū)分開(kāi)，不能區(qū)分貴州黔西南和云南楚雄煙葉。表明貴州黔西南和云南楚雄煙葉中性致香物質(zhì)特征較為接近，均與福建三明煙葉存在明顯區(qū)別;2013年入庫(kù)煙葉中性致香物質(zhì)特征與2012年和2014年煙葉差異較大。

2.2.3 中性致香物質(zhì)的判別因子分析

圖3為基于中性致香物質(zhì)含量的3個(gè)產(chǎn)地和3個(gè)貯存時(shí)間的判別因子分析圖。通過(guò)判別因子分析可將不同貯存時(shí)間和不同產(chǎn)地的煙葉區(qū)分開(kāi)。A為3個(gè)產(chǎn)地的判別因子分析，其中貴州黔西南和云南楚雄有部分重疊，但總體能夠?qū)?個(gè)產(chǎn)地的煙葉區(qū)分開(kāi)來(lái);B為3個(gè)貯存時(shí)間的判別因子分析，圖中各不同貯存時(shí)間能較好的聚集并分散開(kāi)，沒(méi)有重疊的現(xiàn)象，說(shuō)明能將不同貯存時(shí)間的煙葉很好地區(qū)分開(kāi)。表明貴州黔西南和云南楚雄煙葉中性致香物質(zhì)特征存在相似之處，而福建三明煙葉則與二者區(qū)別明顯;不同貯存年限煙葉中性致香物質(zhì)特征差異明顯。

3 結(jié)論與討論

煙葉在醇化過(guò)程中，隨著醇化時(shí)間的增加，中性致香物質(zhì)含量呈先升高后降低的變化趨勢(shì)，這與胡有持[20]、鄭峰洋[21]等通過(guò)對(duì)復(fù)烤片煙進(jìn)行醇化研究發(fā)現(xiàn)，煙葉中多數(shù)致香物質(zhì)的含量隨醇化時(shí)間的增加呈先升后降趨勢(shì)，其研究結(jié)果相一致;不同產(chǎn)地間煙葉中性致香物質(zhì)含量有著部分差異，煙葉感官質(zhì)量在不同醇化時(shí)間和不同產(chǎn)地均無(wú)明顯的差異，感官質(zhì)量主要是依靠評(píng)吸人員對(duì)其進(jìn)行抽吸，并對(duì)主要評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行評(píng)分來(lái)鑒定，但每個(gè)人對(duì)其特定評(píng)價(jià)指標(biāo)的感覺(jué)均不相同，帶有很大的主觀性，且煙葉達(dá)到醇化已達(dá)的狀態(tài)，品質(zhì)穩(wěn)定，人的感官靈敏度很難區(qū)分不同產(chǎn)地和醇化時(shí)間各指標(biāo)的差異，導(dǎo)致感官質(zhì)量沒(méi)有明顯差異。歸一化處理的熱力圖能夠明顯地看岀不同醇化時(shí)間煙葉致香物質(zhì)含量的動(dòng)態(tài)變化差異，但不同產(chǎn)地間部分致香物質(zhì)含量差異不明顯，其致香物質(zhì)含量相對(duì)一致，歸一化時(shí)數(shù)值較為接近，導(dǎo)致其差異不太明顯。

主成分分析能較好區(qū)分岀不同香型香韻煙葉，判別因子分析能很好判別不同產(chǎn)地和貯存時(shí)間的煙葉，且兩個(gè)分析方法都有著明顯特征差異。研究表明致香物質(zhì)大多是煙葉次生代謝的產(chǎn)物，煙葉致香物質(zhì)前體物是煙葉在生長(zhǎng)發(fā)育中形成的[22];烤煙香型香韻的不同是由于煙葉內(nèi)各種致香物質(zhì)的比例不同造成[23]，不同產(chǎn)地的煙株生長(zhǎng)發(fā)育條件有著或多或少的不同，導(dǎo)致煙葉致香物質(zhì)含量有著部分差異;醇化過(guò)程中煙葉致香物質(zhì)前體物發(fā)生降解和轉(zhuǎn)變，使其進(jìn)入次生代謝途徑[24]，間接影響煙葉致香物質(zhì)的含量，從而導(dǎo)致煙葉在不同貯存時(shí)間致香物質(zhì)含量有著明顯差異。主成分分析能區(qū)分岀部分貯存時(shí)間和產(chǎn)地的煙葉，2013年入庫(kù)的煙葉致香物質(zhì)含量顯著高于2012年和2014年，同時(shí)貴州黔西南和云南楚雄的煙葉同屬于西南高原生態(tài)區(qū)—清甜香型，福建三明的煙葉則屬于武夷陵區(qū)生態(tài)區(qū)—清甜蜜甜香型[25-26]，導(dǎo)致其不能很好地區(qū)分開(kāi)貴州黔西南和云南楚雄的煙葉。判別因子分析能很好地區(qū)分開(kāi)不同醇化時(shí)間的煙葉，而產(chǎn)地間貴州黔西南和云南楚雄有著部分重疊，且兩個(gè)產(chǎn)地同屬于一個(gè)香型香韻，說(shuō)明其致香物質(zhì)特征有著相似之處，應(yīng)用判別因子分析可以較為明顯的將兩個(gè)產(chǎn)地的煙葉區(qū)分。

在不同貯存時(shí)間和不同產(chǎn)地?zé)熑~中，通過(guò)對(duì)中性致香物質(zhì)含量進(jìn)行歸一化處理的熱力圖可視化分析，能直觀地看出各中性致香物質(zhì)含量間的差異?；谥行灾孪阄镔|(zhì)含量的主成分分析能區(qū)分2013年入庫(kù)的煙葉和福建三明的煙葉，2012年和2014年入庫(kù)的煙葉，其物質(zhì)含量的差異較小，通過(guò)對(duì)中性致香物質(zhì)含量的判別因子分析，其結(jié)果能夠很好地判別出不同貯存時(shí)間和不同產(chǎn)地的煙葉，尤其是不同醇化時(shí)間的效果。中煙公司常將煙葉的感官質(zhì)量作為評(píng)價(jià)醇化程度的標(biāo)準(zhǔn)，而致香物質(zhì)又直接作用于人的感官，影響著煙葉的感官質(zhì)量，因此煙葉致香物質(zhì)含量作為評(píng)價(jià)醇化程度的指標(biāo)具有一定的可行性，同時(shí)中性致香物質(zhì)判別因子分析能夠判別不同產(chǎn)地和貯存時(shí)間煙葉，就算產(chǎn)地間屬于同一個(gè)香型香韻的煙葉，也能較好區(qū)分不同產(chǎn)地，為此可將判別因子分析作為適宜的分析方法。

煙葉感官質(zhì)量在不同貯存時(shí)間和產(chǎn)地間均無(wú)明顯變化;類(lèi)胡羅卜素降解產(chǎn)物、揮發(fā)性醇類(lèi)、揮發(fā)性酮類(lèi)、新植二烯、西柏烷衍生物、其他類(lèi)和中性致香物質(zhì)總含量隨著貯存時(shí)間的延長(zhǎng)均呈現(xiàn)先顯著升高后顯著降低的變化趨勢(shì)，不同產(chǎn)地間各中性致香物質(zhì)含量也存在著較大差異，其中以直鏈脂肪酸酯、烴類(lèi)和揮發(fā)性醇類(lèi)的含量差異最為明顯。通過(guò)對(duì)中性致香物質(zhì)的特征分析發(fā)現(xiàn)，熱力圖能直觀的看出不同貯存時(shí)間含量的差異，判別因子分析能明顯的區(qū)分不同產(chǎn)地和醇化時(shí)間的煙葉，主成分分析能區(qū)分不同香型香韻和致香物質(zhì)含量差異較大的煙葉;為此可將中性致香物質(zhì)作為判定不同產(chǎn)地和醇化程度的相關(guān)指標(biāo)，判定方法則以判別因子分析最為適宜。

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