劉興麗 彭西 吳邦元 楊菲 袁施彬

摘 要：本研究選用人工馴養(yǎng)繁殖的1、3、6和9日齡紅嘴相思鳥健雛的肝臟為材料，通過HE染色法、甲基綠派洛寧法和普魯士藍法進行染色，光鏡觀察肝臟的組織形態(tài)結(jié)構(gòu)及肝組織細胞核酸分布和鐵含量變化，電鏡觀察肝細胞的超微結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果顯示，所有日齡的肝組織內(nèi)結(jié)締組織均不豐富，肝小葉界限均不明顯;隨雛鳥日齡的增加，肝細胞索逐漸清晰，造血細胞數(shù)量減少，肝細胞的RNA含量降低，肝細胞核仁逐漸變小;1、3和6日齡的紅嘴相思鳥肝細胞內(nèi)無鐵顆粒沉積，但9日齡雛鳥肝細胞的胞漿內(nèi)見有大量呈廣泛性分布鐵顆粒;隨日齡的增加，肝細胞內(nèi)線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細胞器日益豐富。結(jié)果表明，紅嘴相思鳥雛鳥肝臟發(fā)育與其他幼齡動物肝臟發(fā)育存在一定差異，總體表現(xiàn)為隨日齡增長，肝臟結(jié)構(gòu)逐步發(fā)育成熟，功能也逐漸增強，在育雛后期表現(xiàn)出明顯的鐵富集。

關(guān)鍵詞：紅嘴相思鳥;肝臟;組織學;超微結(jié)構(gòu)

Abstract：Livers of healthy nesting red-billed Leiothrix lutea at the 1st ，3rd ，6th and 9th day of brood birds were used as materials in this study.The liver of L.lutea was stained by HE staining，methylgreen-pyronin，and prussian blue staining methods.The tissue morphology and the changes in the distribution of nucleic acid and iron content of liver cells were observed under optical microscope.Electron microscope was used to observe the changes in ultrastructure of liver cells.The results showed that the connective tissue in liver tissues of all ages was not abundant and the boundaries of liver hepatic lobule were not obvious.With the increase of the age of L.lutea，hepatic cords became clearer，the number of hematopoietic cells decreased，the concentrations of RNA in hepatocytes decreased，and the hepatocyte nucleolus gradually became smaller.There were no Fe particle depositions in the liver cells of L.lutea at 1st，3rd，and 6th days ，but there were a large number of Fe particles in the cytoplasm of the liver cells of L.lutea at 9th days.Organelles such as mitochondria and endoplasmic reticulum in liver cells became abundant with the increasing age.To sum up，there is a certain difference between the liver development of L.lutea and other young animals，and the liver structure gradually became mature and the function gradually increased.During the late brooding period，the liver showed obvious iron richness.

Keywords：Leiothrix lutea; liver; histology; ultrastructure

紅嘴相思鳥（Leiothrix lutea），又稱相思鳥、紅嘴玉、紅嘴鳥等，因嘴呈赤紅色而得名，隸屬于鳥綱雀形目鹟科畫眉亞科相思鳥屬[1]。野外紅嘴相思鳥主要棲息于海拔1200～2800 m的山地常綠闊葉林，常綠落葉混交林、竹林和林緣疏林灌叢地帶，冬季多下到海拔1000 m以下的低山、山腳、平原與河谷地帶[2]。該鳥體形小巧玲瓏，鳴聲婉轉(zhuǎn)悅耳，色彩華麗，是馳名國內(nèi)外的觀賞鳥，每年遭到大量捕捉，至使種群數(shù)量受到很大破壞，CITES2007已將其列入附錄Ⅱ。因此，人工馴繁紅嘴相思鳥是緩解野外捕捉壓力的有效途徑。在對該鳥繁殖生態(tài)[3]、消化道形態(tài)[4]，骨骼系統(tǒng)[5]和營養(yǎng)調(diào)控[6]等方面進行了研究的基礎上發(fā)現(xiàn)，雛鳥的發(fā)育狀況，尤其是肝臟的發(fā)育是影響繁殖成效的關(guān)鍵因素。因為肝臟為鳥類體內(nèi)的最大消化腺，比身體同等大小的哺乳類的肝臟更大[7]，是影響鳥體生長發(fā)育、免疫調(diào)節(jié)、物質(zhì)和能量代謝的重要器官，具有復雜的生理生化功能[8]。本文旨在通過研究育雛期紅嘴相思鳥肝臟發(fā)育過程中的組織形態(tài)變化和某些特殊化學成分的動態(tài)變化，在完善比較組織學研究內(nèi)容的同時，為雀形目鳥類的進化與適應，系統(tǒng)發(fā)育等積累基礎資料，并促進紅嘴相思鳥移地保護成效。

1 材料與方法

1.1 供試材料

選擇人工育雛的1、3、6和9日齡的紅嘴相思鳥幼鳥各2只（由西華師范大學人工馴養(yǎng)繁殖實驗室提供），頸靜脈放血處死后迅速解剖，取肝臟組織分別固定于4%多聚甲醛溶液和2.5%戊二醛（4 ℃）中。

1.2 試驗設備和儀器

Leica RM 2235輪轉(zhuǎn)式切片機（德國徠卡）;電熱恒溫鼓風干燥箱（上?，槴\）;Nikon 3 CCD顯微照相系統(tǒng)（日本尼康）;Olympus光學顯微鏡（日本奧林巴斯）;ULTRACUTE 超薄切片機（奧地利劍橋）;Hitachi H-7650型透射電子顯微鏡（日本日立）;XPS-Supra能譜儀（英國Kratos）。

1.3 試驗方法

1.3.1 紅嘴相思鳥雛鳥肝臟的組織學及組織化學觀察

采取固定于4%多聚甲醛溶液中的1、3、6和9日齡的紅嘴相思鳥肝臟組織，進行常規(guī)脫水，透明，石蠟包埋，連續(xù)冠狀切片（厚度5 μm），用于HE、核酸和鐵的染色，Olympus光學顯微鏡下觀察并拍照。

HE染色參照王伯沄[9]在《病理學技術(shù)》中描述的HE染色法，即常規(guī)脫蠟至水后，入蘇木素染液10～15 min，水洗后可用1%鹽酸酒精進行分化，再經(jīng)水洗后用0.5%的氨水溶液進行藍化，水洗后入伊紅染液染色10～15 min，水洗后由低濃度到高濃度的酒精脫水，二甲苯透明后，中性樹膠封固。

核酸染色采用甲基綠派洛寧法[10]，即常規(guī)脫蠟至水后，蒸餾水稍洗，0.2 mol/L、pH 4.8的醋酸緩沖液稍洗，甲基綠派洛寧染液室溫下作用30～60 min，醋酸緩沖液浸洗后用濾紙吸干多余水分，丙酮分化20～30 s，丙酮和二甲苯的等量混合液分化、脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。

鐵染色采用普魯士藍法[11]，即常規(guī)脫蠟至水后，入Perl's液處理，再水洗，入1%中性紅復染細胞核約3 min，無水酒精脫水、透明，封片。

1.3.2 紅嘴相思鳥雛鳥肝臟的超微結(jié)構(gòu)觀察

根據(jù)光學顯微鏡觀察結(jié)果對相關(guān)樣品進行電鏡觀察，方法參考文獻[12]。具體為采取固定于4℃的2.5%戊二醛中的3、9日齡的紅嘴相思鳥肝臟組織塊，1%鋨酸固定2 h，然后進行乙醇梯度脫水，環(huán)氧樹脂812包埋，將取材組織用雙面刀片切成細條狀后，丙酮脫水，環(huán)氧樹脂包埋，ULTRACUTE 超薄切片機切片，切片用檸檬酸鉛和醋酸雙氧鈾染色，Hitachi H-7650型透射電子顯微鏡觀察并拍照，XPS-Supra能譜儀對元素進行識別。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅嘴相思鳥雛鳥肝臟的HE染色觀察

紅嘴相思鳥1、3、6和9日齡雛鳥肝臟的HE染色觀察結(jié)果分別見圖1-A、B、C和D。如圖所示，1日齡時少數(shù)視野中肝細胞排列成較清楚的肝索形態(tài)，肝索由單排或雙排肝細胞構(gòu)成，竇皮細胞和竇狀隙清晰。在多數(shù)肝索形態(tài)不清的區(qū)域，肝竇呈狹窄閉鎖狀態(tài)，長梭形的竇皮細胞位于肝細胞之間。在肝小葉的不定區(qū)域，見有胞核深藍染、胞漿較少的造血細胞，呈小團塊狀或索狀;3日齡時肝組織形態(tài)與1日齡相近，肝細胞胞體較大，胞漿內(nèi)見有較多的近圓形小空泡，造血細胞的數(shù)量仍較多;6日齡和9日齡的肝細胞組織形態(tài)結(jié)構(gòu)相似，肝細胞較1和3日齡的胞體變小，數(shù)量增多，肝索多由兩排肝細胞構(gòu)成，沿中央靜脈放射狀排列，竇狀隙較狹窄，呈白色縫隙狀，竇壁上可見核呈長梭形的扁平狀的內(nèi)皮細胞。與1日齡和3日齡比較，6日齡和9日齡肝組織中的造血細胞數(shù)量顯著減少;1、3、6和9日齡的肝組織內(nèi)結(jié)締組織均不豐富，因此，肝小葉界限均不明顯。

2.2 紅嘴相思鳥雛鳥肝臟的核酸染色觀察

用甲基綠派洛寧法對1，3，6和9日齡紅嘴相思鳥雛鳥肝臟核酸染色觀察結(jié)果分別見圖2-A、B、C和D。RNA呈紫紅色呈彌散性分布于細胞質(zhì)中，DNA呈藍色顆粒狀分布于細胞核中。

由圖可見，1日齡和3日齡紅嘴相思鳥肝細胞的胞質(zhì)內(nèi)含有豐富的RNA，隨日齡增加，胞質(zhì)內(nèi)RNA含量逐漸減少，至9日齡時，胞質(zhì)內(nèi)僅見有極少量的RNA;1日齡時，DNA均勻彌散，至9日齡時，核膜附近聚集的DNA增多。多數(shù)肝細胞內(nèi)可見1個較大核仁，少數(shù)可見2個核仁，核仁多呈卵圓形，位于靠近核膜的位置。1、3日齡時，肝細胞的核仁較粗大，隨日齡的增加，核仁逐漸變小。

肝臟中造血細胞的DNA和RNA含量豐富，胞核呈深藍色，胞漿呈深紫紅色。甲基綠派洛寧法更清晰地顯示出，1、3日齡肝組織中造血細胞豐富，隨著日齡的增加，造血細胞逐漸減少至幾近消失。

2.3 紅嘴相思鳥雛鳥肝臟的鐵染色觀察

普魯士藍法將鐵顆粒染成藍色。顯微觀察發(fā)現(xiàn)，1、3和6日齡的紅嘴相思鳥肝細胞內(nèi)無鐵顆粒沉積，如圖3-A所示;9日齡雛鳥肝細胞的胞漿內(nèi)見有大量藍染顆粒狀的鐵顆粒，呈廣泛性分布，如圖3-B所示。

2.4 紅嘴相思鳥雛鳥肝細胞超微結(jié)構(gòu)的電鏡觀察

根據(jù)普魯士藍鐵染色觀察結(jié)果，本研究選用3日齡和9日齡雛鳥肝臟樣品進行肝細胞超微結(jié)構(gòu)的電鏡觀察，3日齡雛鳥肝細胞的超微結(jié)構(gòu)如圖4-A和4-B所示，9日齡肝細胞的超微結(jié)構(gòu)如圖4-C和4-D所示。由圖4-A和4-B可見，肝細胞胞體呈多面形，細胞核呈卵圓形或近卵圓形，核仁明顯，位于核中央或近核膜處。細胞質(zhì)中可見線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，線粒體數(shù)量眾多，呈圓形、卵圓形或長卵圓形，線粒體嵴排列整齊，單層粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)包繞線粒體的現(xiàn)象多見。胞質(zhì)中見有較多大小不一的脂質(zhì)體，呈圓形或橢圓形，電子密度較低，均質(zhì)或呈輪層狀結(jié)構(gòu)，核糖體附著在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上或游離在細胞質(zhì)中;由圖4-C和4-D所示，與3日齡比較，可見肝細胞線粒體體積增大，胞質(zhì)內(nèi)見有大小不等高電子密度的沉積物，經(jīng)輪譜分析證實為鐵顆粒。

3 結(jié)論與討論

肝臟是動物體內(nèi)最大的消化腺，且是一個極其重要的物質(zhì)代謝器官，參與機體多種物質(zhì)如糖原、膽固醇、膽鹽、脂蛋白和血漿蛋白的合成、貯存、代謝和轉(zhuǎn)化過程，同時它還解毒以及參與體內(nèi)防衛(wèi)體系，滅活和轉(zhuǎn)化內(nèi)源性及外源性的有毒物質(zhì)，吞噬細菌、異物等。因此，肝臟的發(fā)育狀況在極大程度上影響著動物，尤其是幼齡動物生長發(fā)育。

肝臟的實質(zhì)是由許多肝小葉組成，肝小葉間為被膜或肝門伸進的小葉間結(jié)締組織。已有的研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)哺乳動物如人、馬、牛、東北虎、梅花鹿、狍、馬鹿、銀黑狐、裸鼴鼠和花尾胡椒鯛等的肝小葉的結(jié)締組織不發(fā)達，肝小葉間界限不明顯[13-14];而豬和駱駝同屬于哺乳動物，但卻具有典型的結(jié)締組織包繞的肝小葉邊界，肝小葉之間的界限非常清楚[15]。關(guān)于鳥類的肝小葉的研究報道也發(fā)現(xiàn)，雞[16]、虎皮鸚鵡[17]、紅腹錦雞[18]、丹頂鶴[19]等動物的肝小葉的結(jié)締組織不發(fā)達，肝小葉間界限不明顯;而鴨的肝小葉結(jié)締組織較發(fā)達，界限較為清晰可辨。本研究發(fā)現(xiàn)，紅嘴相思鳥的肝小葉分界不明顯，是因為紅嘴相思鳥肝小葉間結(jié)締組織不發(fā)達。這表明即使同屬于鳥綱，其肝小葉之間的結(jié)締組織的多少和肝小葉的明顯程度仍存在一定的差異。

多數(shù)哺乳動物肝臟的肝細胞呈條索狀，沿中央靜脈呈放射狀排列，而家禽（如雞、鴨、鵝）的肝細胞均排列成管狀[16]。對不同日齡的紅嘴相思鳥肝臟結(jié)構(gòu)的顯微觀察發(fā)現(xiàn)，肝索多由兩排肝細胞構(gòu)成，肝索圍繞中央靜脈呈緊密的放射狀排列，隨著日齡的增長，肝索逐漸成形，肝細胞胞漿中的脂滴逐漸減少，肝臟中造血細胞的數(shù)量逐漸減少，表明隨著日齡增長，肝臟結(jié)構(gòu)逐漸發(fā)育成熟。已有資料報道，一些野鳥，如紅腹錦雞的肝臟形態(tài)結(jié)構(gòu)與紅嘴相思鳥的相似[17]，這可能與這些鳥類主要以富含蛋白質(zhì)的昆蟲為食有關(guān)。

肝細胞多為單核，但約有25%具有雙核。有的細胞核大而沉染，DNA為多倍體。一般認為雙核和多倍體肝細胞的功能比較活躍。本研究發(fā)現(xiàn)，紅嘴相思鳥在1日齡和3日齡時，肝細胞核仁較粗大，隨日齡的增加，核仁逐漸變小，但在整個育雛階段DNA含量均較豐富，表明整個育雛期肝細胞均處于較旺盛的分裂增殖階段。對新生仔豬肝組織中核酸觀察發(fā)現(xiàn)，從0日齡至3日齡，肝臟DNA濃度明顯下降之后至7日齡又增加[8];霍金富等[20]對香豬出生后肝組織的研究中則顯示，10日齡時，肝細胞核內(nèi)DNA密度較1日齡有所下降，20日齡時較10日齡有所增加。不同動物肝臟DNA的不同變化趨勢可能是由種屬差異所致。

RNA是蛋白質(zhì)合成過程中的重要參與者，能反映細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的代謝狀況。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著紅嘴相思鳥育雛期日齡的增加，肝細胞胞質(zhì)內(nèi)RNA密度有所下降且含量明顯減少。表明與育雛后期相比，育雛前期和中期的紅嘴相思鳥肝細胞合成蛋白質(zhì)的能力更旺盛。新生仔豬肝臟RNA濃度在出生后3日齡內(nèi)迅速上升，而在4～7日齡有微弱的下降趨勢[8]。新生小白鼠在出生后第7天RNA顆粒明顯多于第1天[21]。這些研究結(jié)果與幼齡紅嘴相思鳥肝組織中RNA的變化趨勢不一致，說明鳥類與哺乳動物在生長發(fā)育過程中RNA在代謝方面存在一定的差異性。

肝臟是動物體內(nèi)鐵的重要儲存部位，鐵在肝臟中以鐵蛋白或含鐵血黃素形式儲存，用于代謝和血紅蛋白的形成。本研究發(fā)現(xiàn)，1、3和6日齡紅嘴相思鳥肝細胞中幾乎不見鐵的存在，而在9日齡紅嘴相思鳥肝細胞內(nèi)出現(xiàn)鐵的廣泛性沉積。眾所周知，鐵缺乏引起動物貧血和生長受阻，在家養(yǎng)動物中，缺鐵性貧血多發(fā)于仔豬。鐵過載引發(fā)的健康問題也已受到廣泛關(guān)注，迄今為止，鐵過載現(xiàn)象在數(shù)種哺乳動物和鳥類被發(fā)現(xiàn)，包括八哥[22]、巨嘴鳥[23]、薩勒斯牛[24]、狐猴[25]、貊[26]、紅鹿[27]和犀牛[28]等。本研究中所檢測的紅嘴相思鳥雖系人工繁育，但其食物以天然飼料和昆蟲為主，因此其肝臟鐵沉積的原因應與人工飼料中鐵含量無關(guān)，育雛后期相思鳥肝臟出現(xiàn)鐵的廣泛性沉積可能是因為野生鳥類為了適應野外低鐵食物而形成的吸收鐵的活躍機制。

線粒體是細胞的“動力站”，是合成能量的場所，高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核糖體是細胞內(nèi)物質(zhì)合成和代謝的場所。肝細胞的超微結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果顯示，3、9日齡紅嘴相思鳥肝細胞內(nèi)均有豐富的細胞器，其中數(shù)量最多的是線粒體，呈板層狀，且可見單層粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)包繞線粒體;9日齡肝細胞內(nèi)的細胞器數(shù)量較3日齡多，結(jié)構(gòu)也更加清晰。已有研究表明，細胞內(nèi)線粒體的形狀和數(shù)量與細胞種類及生理狀況密切相關(guān)，耗能多的細胞不但線粒體多，而且線粒體嵴的數(shù)量也多。與已有研究相符，3、9日齡紅嘴相思鳥的肝細胞胞質(zhì)內(nèi)均含有豐富的線粒體，表明肝臟是代謝旺盛、對能量需求很大的器官。與3日齡比較，9日齡肝細胞內(nèi)線粒體體積增大、數(shù)量增多，表明紅嘴相思鳥肝細胞的物質(zhì)代謝功能隨日齡增長逐漸增強。

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