王英 陳新君 張陽 崔秀吉

摘 要：為避免在抗鏈球菌溶血素“O”膠乳凝集試驗(yàn)（抗“O”試驗(yàn)）中使用臨床患者血清樣本以及降低實(shí)驗(yàn)教學(xué)材料成本，以硫酸鋁鉀[KAl（SO4）2]溶液、牙膏溶液制備“假”抗“O”試劑，以此模擬實(shí)際抗“O”試驗(yàn)應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)教學(xué)。結(jié)果顯示“假”抗“O”試劑可產(chǎn)生明顯的凝集顆粒，達(dá)到預(yù)期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，滿足教學(xué)目標(biāo)和任務(wù)。因此，“假”抗“O”試劑在實(shí)驗(yàn)教學(xué)中可替代商品化的抗“O”試驗(yàn)試劑盒。此外，因制備“假”抗“O”試劑的成本遠(yuǎn)低于商用化試劑盒，可實(shí)現(xiàn)大幅度節(jié)約教學(xué)實(shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi)的效果。

關(guān)鍵詞：微生物實(shí)驗(yàn)教學(xué);抗鏈球菌溶血素“O”;硫酸鋁鉀

Abstract： To avoid using the clinical serum samples in the antistreptolysin“O”test（ASO）and reduce the cost of experiment in the microbiology experimental teaching，a“Fake”ASO kit was developed to replace the commercial antistreptolysin“O”latex agglutination（ASO）kit.The“Fake”ASO kit consisted of 0.8mg/ml of KAl（SO4）2solution and 20mg/ml of toothpaste.In results，the“Fake”ASO kit showed a predicted agglutinating phenomenon similar to the commercial ASO kit.Thus，the“Fake”ASO kit can be using for the ASO experiment in microbiology experimental teaching.

Key words： Microbiology experimental teaching;Anit-streptolysin O;KAl（SO4）2

鏈球菌溶血素O（streptolysin O，SLO）是A群鏈球菌代謝產(chǎn)物中的一種，具有很強(qiáng)的抗原性，能夠刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生相應(yīng)的抗體[1-2]。感染溶血性鏈球菌的病人中，約有85%～90%病人于感染后2～3周，甚至病愈后數(shù)月到1年內(nèi)仍可以檢測出SLO抗體[3-5]?；顒有燥L(fēng)濕熱患者血清中的SLO抗體顯著高于正常人，其效價在1∶400以上，通常作為鏈球菌新近感染指標(biāo)之一或風(fēng)濕熱及其活動性的輔助診斷。抗鏈球菌溶血素“O”測定試驗(yàn)（膠乳凝集法），又稱抗“O”試驗(yàn)，因其具有方法簡便、快速等優(yōu)點(diǎn)，臨床上使用越來越廣泛[2，6]。在我校醫(yī)學(xué)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課教學(xué)中，抗“O”試驗(yàn)是醫(yī)學(xué)生必須掌握的實(shí)驗(yàn)操作項(xiàng)目。在實(shí)際實(shí)驗(yàn)教學(xué)過程中應(yīng)使用臨床病人血清標(biāo)本完成該實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目。但因臨床血清標(biāo)本來源困難以及涉及生物安全問題，現(xiàn)階段實(shí)驗(yàn)教學(xué)中以商品化抗“O”試驗(yàn)試劑盒中的陽性對照液代替病人血清標(biāo)本進(jìn)行試驗(yàn)。但試劑盒存在價格高、量少，且貨源不穩(wěn)定的情況，所以不適合長期在實(shí)際實(shí)驗(yàn)教學(xué)中使用。因此，尋找既經(jīng)濟(jì)又可靠的陽性對照液的替代物對于保證該教學(xué)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目的正常開出就顯得十分必要。

通過多次預(yù)試和反復(fù)實(shí)踐，KAl（SO4）2溶液（0.8mg/ml）和牙膏（20mg/ml）的溶液，即“假”抗“O”試劑，可替代商品化試劑盒應(yīng)用于教學(xué)實(shí)踐，并取得預(yù)期實(shí)驗(yàn)教學(xué)目的。

1 材料與方法

1.1 材料

KAl（SO4）2，分析純，購自天津市大茂化學(xué)試劑廠;牙膏，品牌黑妹，購自?？谀吵?抗鏈球菌溶血素“O”膠乳凝集試驗(yàn)試劑盒，購自上海捷門生物技術(shù)有限公司，批號190806。

1.2 方法

（1）0.8mg/mL KAl（SO4）2溶液的配制 稱取0.08g KAl（SO4）2完全溶解于100ml的蒸餾水中。

（2）20mg/mL牙膏溶液的配制稱取1g牙膏用少量蒸餾水研磨溶解，靜置1分鐘后，吸取上清液用蒸餾水定容至50ml。

（3）抗“O”試驗(yàn)代替法預(yù)試驗(yàn)按1∶1比例混合20mg/mL牙膏溶液和商品化抗“O”試劑盒中的膠乳試劑配成混合液，記為膠乳試劑R。取試劑盒中的一張反應(yīng)紙板四個格子，標(biāo)記有2，3，5，6。在每個格子中分別滴加1滴0.8mg/mL KAl（SO4）2溶液（模擬病人陽性血清標(biāo)本）、1滴生理鹽水（模擬病人陰性血清標(biāo)本）、1滴陽性對照液、1滴陰性對照液，再分別滴加1滴膠乳試劑R，然后用攪拌棒攪拌混勻，邊攪拌邊觀察實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象的變化。

2 結(jié)果與分析

完成抗“O”試驗(yàn)流程后，5號格子，即陽性對照液（商品化試劑盒）和2號格子，即模擬病人陽性血清（KAl（SO4）2溶液）均在2分鐘之內(nèi)出現(xiàn)凝集顆粒，但1號和4號格子沒有出現(xiàn)變化（如下圖）。肉眼觀察，商品化試劑盒中的陽性對照液和模擬病人陽性血清中產(chǎn)生的凝集現(xiàn)象相似，同時出現(xiàn)凝集得時間也相近。

兩種方法抗“O”試驗(yàn)結(jié)果對比圖

3 結(jié)語

在醫(yī)學(xué)微生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)教學(xué)中，抗“O”試驗(yàn)是重要的一個實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目。學(xué)生通過操作進(jìn)一步掌握抗“O”試驗(yàn)原理和臨床意義等鏈球菌的相關(guān)知識。但近年來，臨床血清標(biāo)本，商品化試劑盒中陽性對照液的來源的困難和需求的日益增大，現(xiàn)有的商品化試劑盒無論在數(shù)量上還是經(jīng)費(fèi)上無法滿足教學(xué)需求。為了解決這一難題，保證教學(xué)項(xiàng)目的順利開展，通過反復(fù)實(shí)踐，研制出商品化抗“O”試驗(yàn)試劑盒的替代方法，即采用濃度為0.8mg/ml KAl（SO4）2溶液和20mg/ml的牙膏溶液模擬商品化抗“O”試驗(yàn)試劑盒。由于0.8mg/mL KAl（SO4）2溶液不能使試劑盒中的膠乳試劑發(fā)生凝集，所以在膠乳試劑中加入等量的20mg/mL牙膏溶液，其理由是牙膏中含有的羧甲基纖維素鈉可在酸性條件下沉淀，而0.8mg/ml的KAl（SO4）2溶液呈酸性，因此能使羧甲基纖維素鈉沉淀出現(xiàn)類似凝集顆粒[7，8]。羧甲基纖維素鈉是由天然纖維素經(jīng)過化學(xué)改性得到的白色纖維狀或顆粒狀粉末，無臭、無味，為堿性的溶液。是常用于日用化學(xué)用品，如牙膏，中起到增強(qiáng)劑的作用，比較安全[9，10]。這種“假”抗“O”試劑的優(yōu)點(diǎn)是：（1）容易獲取硫酸鋁鉀和牙膏，且用量小，能滿足教學(xué)大用量的需求;（2）成本低，商品化試劑盒中陽性標(biāo)本的價格為25元/ml，每年需要要采購100～150mL，但本方法中使用的黑妹牙膏一支不足十元，而且能夠制備足夠的牙膏液供應(yīng)大量學(xué)生使用，從實(shí)驗(yàn)成本上大大節(jié)約了實(shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi)。至于其他品牌牙膏是否也可用，需要進(jìn)一步進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證;（3）安全，此法代替了血清標(biāo)本的使用，因此不涉及生物安全問題。

綜上所述，“假”抗“O”試驗(yàn)試劑可替代原有的抗“O”試劑盒，且具有經(jīng)濟(jì)、安全、實(shí)驗(yàn)結(jié)果滿足教學(xué)目標(biāo)、簡便等優(yōu)點(diǎn)，適用于國內(nèi)各醫(yī)學(xué)院校醫(yī)學(xué)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室在進(jìn)行ASO膠乳試驗(yàn)教學(xué)材料的準(zhǔn)備。

參考文獻(xiàn)：

[1]李凡，徐志凱.醫(yī)學(xué)微生物學(xué)[M].人民衛(wèi)生出版社，2018：90-94.

[2]Anita S.Edward KL.Clinical use and interpretation of group A streptococcal antibody test：a practical approach for the pediatrician or primary care physician[J].Pediatr Infect Dis J.The Pediatric Infectious Disease Journal，2002 May;21（5）：420-6;quiz 427-30.

[3]Dennis L.Kasper，Anthony S.Fauci.Harrison′s Infectious Diseases[M]，3rd ed.McGraw-Hill.2017：378-386.

[4]McCarty M.The antibody response to streptococcal infections.In：McCarty M，ed.Streptococcal infections[M].New York：Columbia University Press，1954：130-42.

[5]Kaplan E，F(xiàn)errieri P，Wannamaker L.Comparison of the antibody response to streptococcal cellular and extracellular antigens in acute pharyngitis[J].J Pediatr 1974，84：21-8.

[6]Stollerman GH，Lewis AJ，Schultz I，Angelo T.Relationship of immune response to group a streptococci to the course of acute，chronic and recurrent rheumatic fever[J].Am J Med 1956，20：163-9.

[7]吳淑茗，柯萍萍，黃俊祥，等.羧甲基纖維素鈉的研究進(jìn)展[J].化學(xué)工程與裝備，2018，1，10：246-247.

[8]詹志萍.羧甲基纖維素鈉的內(nèi)在質(zhì)量及其對酸性食品質(zhì)量的影響[J].中國食品添加劑，1997（4）：38-39.

[9]朱剛卉.羧甲基纖維素鈉和羥乙基纖維素在日化產(chǎn)品中的應(yīng)用[J].日用化學(xué)品科學(xué)，2005，28：16-20.

[10]徐斌，孫占明.高粘度牙膏級CMC的性質(zhì)及其在牙膏中的應(yīng)用[J].口腔護(hù)理用品工業(yè)，2016，12：26-27.