黃蒙蒙，何劍波，石會(huì)玲，凌宏志，葛菁萍

（黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，微生物省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱150080）

0 引言

隨著石化資源短缺問(wèn)題的日益加劇，開(kāi)發(fā)可再生和清潔的能源已經(jīng)成為當(dāng)今世界的研究熱點(diǎn)[1]。生物柴油作為一種低成本且環(huán)境友好的新型燃料，其傳統(tǒng)生產(chǎn)主要以動(dòng)、植物源油脂為原料，經(jīng)轉(zhuǎn)酯得到長(zhǎng)鏈脂肪酸酯[2]。這些原料由于其自身特點(diǎn)產(chǎn)量受限，生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，影響糧食安全從而限制了生物柴油的廣泛應(yīng)用[3]?？僧a(chǎn)油的植物或動(dòng)物本身必須提供大多數(shù)的能量以維持其低含油率纖維組織的生長(zhǎng)，而微藻作為新一代生物質(zhì)原料，能量幾乎都能作為生物柴油生產(chǎn)的原料，其轉(zhuǎn)化效率更高，有望降低發(fā)展生物柴油糧食安全的風(fēng)險(xiǎn)[4]。目前，利用微藻油脂生產(chǎn)生物柴油已成為能源研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。美國(guó)綠色能源科技公司已經(jīng)嘗試?yán)脧U棄的CO2生產(chǎn)微藻，占地1 km2的養(yǎng)藻場(chǎng)一年可以處理5萬(wàn)t CO2[5]。

小球藻是近幾年國(guó)內(nèi)外大力培育和發(fā)展生物柴油新能源與固碳產(chǎn)業(yè)的主要藻種之一[6]，在化妝品和藥品及食品添加劑多個(gè)方面都具有廣泛的應(yīng)用前景[7-8]。盡管小球藻在應(yīng)用方面有許多優(yōu)勢(shì)，但將小球藻從小規(guī)模培養(yǎng)到投入商業(yè)化生產(chǎn)仍然有一些問(wèn)題亟待解決，如小球藻易受水中雜菌和生長(zhǎng)環(huán)境影響，致其生物量和產(chǎn)油量不能達(dá)到理想要求。王雪青等[9]在進(jìn)行微藻培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，微藻的純種培養(yǎng)和保存是其應(yīng)用的基礎(chǔ)和關(guān)鍵性環(huán)節(jié)。王悠等[10]對(duì)無(wú)菌化處理前與處理后微藻生長(zhǎng)特性的變化進(jìn)行了研究，結(jié)果表明除菌后的強(qiáng)壯前溝藻和青島大扁藻不易老化，可保持良好的懸浮狀態(tài)。因此無(wú)菌化處理和培養(yǎng)基優(yōu)化是小球藻研究者的必備工作[11]。培育生長(zhǎng)速度快與油脂產(chǎn)率高的優(yōu)良藻種，也是微藻生物柴油發(fā)展的重點(diǎn)[12]。

綜上所述，限制小球藻產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程的主要原因就是細(xì)胞生長(zhǎng)密度和脂質(zhì)含量不足等問(wèn)題[13]。這些問(wèn)題的解決，一方面需要各環(huán)節(jié)技術(shù)的突破，另一方面也要依賴(lài)于合適的無(wú)菌化處理及培養(yǎng)基的優(yōu)化[14]。C.vulgar HDA04分離自黑龍江省肇東鹽堿地湖泊地區(qū)，具有生長(zhǎng)速率快且含油量高的優(yōu)點(diǎn)。本文以該藻株作為出發(fā)藻株，考察了不同抗生素對(duì)C.vulgar HDA04生物量和油脂積累的影響，并對(duì)藻株的培養(yǎng)條件進(jìn)行單因素優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 供試藻株及培養(yǎng)方法

小球藻(Chorella vulgar)HDA04由黑龍江大學(xué)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。所用培養(yǎng)基為BG11液體培養(yǎng)基。選取長(zhǎng)勢(shì)良好的單藻落接入培養(yǎng)基中，顯微鏡下觀(guān)察藻細(xì)胞懸浮液，重復(fù)稀釋至得到單一藻細(xì)胞。純化后轉(zhuǎn)移至BG11培養(yǎng)基中進(jìn)行異養(yǎng)培養(yǎng)[15]。

1.2 C.vulgar HDA04生長(zhǎng)曲線(xiàn)的測(cè)定

取培養(yǎng)到不同時(shí)間的C.vulgar HDA04藻液8 mL，在680 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度，可以用來(lái)比較藻株的生長(zhǎng)情況[16]。

取培養(yǎng)到不同時(shí)間的C.vulgar HDA04藻懸液8 mL，低溫離心15 min(4℃，5000 r/min)后去上清，用ddH2O洗滌2次后置于烘箱中烘干并稱(chēng)重，用減重法計(jì)算其生物量(g/L)。

1.3 C.vulgar HDA04相對(duì)熒光強(qiáng)度的測(cè)定

由于C.vulgar HDA04細(xì)胞壁較厚，因此采用優(yōu)化后的尼羅紅染色方法檢測(cè)C.vulgar HDA04細(xì)胞的相對(duì)熒光強(qiáng)度并以此指征其相對(duì)含油量[17-18]。

1.4 C.vulgar HDA04對(duì)抗生素敏感性的測(cè)定

藻株在培養(yǎng)過(guò)程中，容易受到共生細(xì)菌的污染。本實(shí)驗(yàn)選用不同濃度卡那霉素(10、25、50、75、100 mg/L)、四環(huán)素(10、25、75、100 mg/L)以及青霉素(0.5、1、2、5、10 mg/L)，分別接種到微藻培養(yǎng)液中，以不添加任何抗生素作為對(duì)照（每隔1天測(cè)定C.vulgar HDA04吸光度和細(xì)胞數(shù)以及含油量）。以生長(zhǎng)曲線(xiàn)、生物量和含油量作為標(biāo)準(zhǔn)，確定最適宜的抗生素及其濃度。

1.5 對(duì)C.vulgar HDA04單因素條件優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)以C.vulgar HDA04達(dá)到穩(wěn)定期（第7天）為發(fā)酵終止點(diǎn)，發(fā)酵終止時(shí)的生物量(g/L)和相對(duì)熒光強(qiáng)度為檢測(cè)指標(biāo)，保持其他培養(yǎng)條件不變，分別考察氯化鈉濃度(0、2、4、6、8、10、15 g/L)和蛋白胨濃度(0、0.5、1.0、1.5、2、2.5 g/L)對(duì)C.vulgar HDA04生長(zhǎng)及相對(duì)含油量的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 C.vulgar HDA04藻株的形態(tài)特征及生長(zhǎng)曲線(xiàn)

C.vulgar HDA04從肇東鹽堿湖采樣分離并經(jīng)過(guò)鑒定得到。如圖1所示，在光學(xué)顯微鏡下，C.vulgar HDA04細(xì)胞多呈深綠色圓形單細(xì)胞，細(xì)胞直徑3～8μm，可以自由存活，不易沉降。在沒(méi)有加入抗生素的情況下，鏡檢時(shí)發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中主要為細(xì)菌。這是由于C.vulgar HDA04藻株自身培養(yǎng)及純化過(guò)程中，無(wú)法完全避免其他微生物的污染。所以考慮在培養(yǎng)過(guò)程中通過(guò)外源添加抗生素，來(lái)達(dá)到抑制雜菌生長(zhǎng)的目的。

圖1 C.vulgar細(xì)胞形態(tài)觀(guān)察(1000X)、染菌C.vulgar HDA04(400X)

2.2 卡那霉素，四環(huán)素和青霉素對(duì)小球藻HDA04生長(zhǎng)的影響

向培養(yǎng)基中添加各濃度卡那霉素，菌株生長(zhǎng)曲線(xiàn)如圖2所示。OD值代表細(xì)胞密度，取樣間隔為1天。所有組生長(zhǎng)趨勢(shì)相同，均呈現(xiàn)S形生長(zhǎng)模式。隨著卡那霉素濃度的增加，C.vulgar HDA04的對(duì)數(shù)期不斷縮短，在所設(shè)實(shí)驗(yàn)組中，只有10 mg/L實(shí)驗(yàn)組對(duì)其生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，其OD值在第6天時(shí)達(dá)到最大值7.30±0.17，較對(duì)照組提高14.4%。圖中還可看出，卡那霉素濃度過(guò)高，使C.vulgar HDA04的延滯期增長(zhǎng)，生長(zhǎng)受到影響。

圖2 不同濃度卡那霉素對(duì)C.vulgar HDA04藻液光密度的影響

在所有四環(huán)素實(shí)驗(yàn)組中，細(xì)胞密度與添加四環(huán)素濃度呈負(fù)相關(guān)趨勢(shì)（圖3）。在所有實(shí)驗(yàn)組中，10 mg/L實(shí)驗(yàn)組顯示的OD值最高，為5.81±0.07，較對(duì)照組(6.38±0.15)仍降低8.9%。當(dāng)四環(huán)素濃度大于50 mg/L時(shí)，生長(zhǎng)曲線(xiàn)不顯示正常小球藻的S型生長(zhǎng)模式，由此推測(cè)，C.vulgarHDA04的大部分細(xì)胞均失活。

圖3 不同濃度四環(huán)素對(duì)C.vulgar HDA04藻液光密度的影響

與四環(huán)素實(shí)驗(yàn)組不同，青霉素實(shí)驗(yàn)組濃度與OD值非負(fù)相關(guān)（圖4）。當(dāng)青霉素濃度為1.0 mg/L時(shí)，OD值最高達(dá)到6.60±0.19，較對(duì)照組提高了3.4%。從圖還可推測(cè)，青霉素濃度過(guò)高大于2.0 mg/L時(shí)，C.vulgarHDA04的生長(zhǎng)受到抑制。

圖4 不同濃度青霉素對(duì)C.vulgar HDA04藻液光密度的影響

2.3 卡那霉素，四環(huán)素和青霉素對(duì)小球藻HDA04生物量及含油量的影響

添加不同濃度卡那霉素，四環(huán)素和青霉素，C.vulgarHDA04的生物量和相對(duì)含油量見(jiàn)圖5～圖7。圖中柱式表示生物量，線(xiàn)式表示相對(duì)含油量。在本實(shí)驗(yàn)所設(shè)的濃度梯度中，卡那霉素10 mg/L實(shí)驗(yàn)組，四環(huán)素10 mg/L實(shí)驗(yàn)組和青霉素1 mg/L實(shí)驗(yàn)組的數(shù)值較為理想。卡那霉素（圖5）10 mg/L實(shí)驗(yàn)組的生物量和相對(duì)含油量較對(duì)照組的生物量(2.31±0.12 g/L)和相對(duì)含油量(3.41±0.08)分別提高15.2%和100.3%。

圖5 不同濃度卡那霉素對(duì)C.vulgar HDA04生物量和相對(duì)含油量的影響（7天）

在四環(huán)素實(shí)驗(yàn)組中（圖6），10 mg/L實(shí)驗(yàn)組的生物量最高達(dá)到2.18±0.13 g/L，但與對(duì)照組相比，生物量仍下降5.6%。相對(duì)含油量也在10 mg/L實(shí)驗(yàn)組顯示最大值，較對(duì)照組提高68.3%。當(dāng)添加四環(huán)素濃度大于10 mg/L，藻株生物量和相對(duì)含油量均降低。由此可作出合理推測(cè)，即四環(huán)素對(duì)C.vulgarHDA04的生長(zhǎng)有一定的抑制作用。這可能是由于四環(huán)素類(lèi)抗生素能夠抑制小球藻蛋白質(zhì)的合成[11]，降低藻細(xì)胞的活性，使其不能正常生長(zhǎng)，但對(duì)單位油脂積累無(wú)影響。

圖6 不同濃度四環(huán)素對(duì)C.vulgar HDA04生物量和相對(duì)含油量的影響（7天）

由圖7可知，青霉素濃度在0.5～1.0 mg/L內(nèi)可明顯提高小球藻細(xì)胞的含油量。在所設(shè)實(shí)驗(yàn)組中，1.0 mg/L實(shí)驗(yàn)組的生物量和相對(duì)含油量最高，較對(duì)照組分別提高了13.8%和138.12%，相對(duì)含油量較卡那霉素10 mg/L實(shí)驗(yàn)組高37.9%。低濃度的四環(huán)素雖然可以提高C.vulgarHDA04的相對(duì)含油量，但會(huì)抑制菌株生長(zhǎng)，使其總脂含量降低，因此不能選擇四環(huán)素。青霉素1.0 mg/L實(shí)驗(yàn)組和卡那霉素10 mg/L實(shí)驗(yàn)組均對(duì)藻株生長(zhǎng)和含油量有促進(jìn)作用，盡管青霉素1.0 mg/L實(shí)驗(yàn)組的生物量較卡那霉素10 mg/L實(shí)驗(yàn)組低1.4%，但綜合性?xún)r(jià)比和總產(chǎn)脂量分析，本實(shí)驗(yàn)選擇1.0 mg/L的青霉素作為最佳添加抗生素。

圖7 不同濃度青霉素對(duì)C.vulgar HDA04生物量和含油量的影響（7天）

2.5 C.vulgar HDA04發(fā)酵條件的優(yōu)化

由于C.vulgarHDA04是在肇東市鹽堿湖地區(qū)采樣收集得到，所以對(duì)于氯化鈉的需求含量較其他藻株要高。由圖8可知，C.vulgarHDA04生物量隨著氯化鈉濃度增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，與相對(duì)含油量趨勢(shì)一致。當(dāng)氯化鈉濃度為8g/L時(shí)，藻株生物量和含油量達(dá)到最大，分別達(dá)到3.64±0.14 g/L和19.60±0.06，較對(duì)照組提高55.3%和474.8%。在濃度大于8 g/L后，生物量和含油量有明顯下降的趨勢(shì)，當(dāng)氯化鈉濃度為15 g/L時(shí)，C.vulgarHDA04的生物量下降至對(duì)照組的55.3%左右。說(shuō)明氯化鈉濃度過(guò)高，菌株生長(zhǎng)受到抑制。

圖8 不同濃度氯化鈉對(duì)C.vulgar HDA04生物量和相對(duì)含油量的影響（7天）

氮是微藻細(xì)胞培養(yǎng)的必需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)和核酸等活性物質(zhì)的重要組成成分。不同蛋白胨濃度下C.vulgarHDA04的生物量和相對(duì)含油量見(jiàn)圖9。蛋白胨實(shí)驗(yàn)組與氯化鈉實(shí)驗(yàn)組走向相似，呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)?shù)鞍纂藵舛葹?.5 g/L時(shí)，C.vulgarHDA04的生物量和相對(duì)含油量最高，分別達(dá)到4.26±0.35 g/L和27.04±1.13，較對(duì)照組提高111%和692.3%。上述結(jié)果表明，以生物量和相對(duì)含油量為標(biāo)準(zhǔn)，氯化鈉濃度8 g/L，蛋白胨濃度1.5 g/L為最優(yōu)添加濃度。

圖9 不同濃度蛋白胨對(duì)C.vulgar HDA04生物量和相對(duì)含油量的影響（7天）

3 討論

本研究所用藻株是從肇東鹽堿湖采樣分離并經(jīng)過(guò)鑒定得到。從肇東湖泊中篩選微藻菌株的一個(gè)優(yōu)勢(shì)是，本地分離的菌株能更好地適應(yīng)室外環(huán)境的培養(yǎng)條件，從而增加了當(dāng)?shù)厥彝庖?guī)?；B(yǎng)殖成功的機(jī)會(huì)[19]。C.vulgarHDA04生長(zhǎng)速度快，脂肪含量高，是從分離的幾株藻株中篩選出的可進(jìn)一步研究的菌株。在對(duì)C.vulgarHDA04進(jìn)行鏡檢時(shí)發(fā)現(xiàn)有雜菌，是由于在異養(yǎng)條件下，與微藻共生的細(xì)菌將利用人為添加的有機(jī)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行大量繁殖[20]。一方面，它們與微藻形成營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，另一方面，它們的代謝產(chǎn)物可能對(duì)微藻具有抑制或殺傷作用，從而影響微藻的生長(zhǎng)效率，甚至使其不能生長(zhǎng)繁殖。因此需要做無(wú)菌化處理。但是，常規(guī)的無(wú)菌化處理方法往往使藻種純化工作難以進(jìn)行，而且藻種的純化與純化技術(shù)及研究經(jīng)驗(yàn)相關(guān)。由于微藻和細(xì)菌對(duì)抗生素的敏感性有很大不同，可以利用抗生素對(duì)菌株進(jìn)行無(wú)菌化處理[21]。王鈴玲等[22]研究表明，適量氨芐青霉素、頭孢呋辛和慶大霉素聯(lián)合使用，可實(shí)現(xiàn)鹽藻藻株的無(wú)菌化處理，鄭凌凌等[23]研究表明，低質(zhì)量濃度的卡那霉素、慶大霉素、鏈霉素對(duì)雨生紅球藻FACHB-712藻株的細(xì)菌具有明顯的抑制作用。

本試驗(yàn)選取了卡那霉素、四環(huán)素以及青霉素3種抗生素，通過(guò)濃度梯度試驗(yàn)研究抗生素對(duì)C.vulgar HDA04生長(zhǎng)及相對(duì)含油量的影響。試驗(yàn)結(jié)果顯示，適宜濃度的卡那霉素和青霉素均能促進(jìn)小球藻生長(zhǎng)。但考慮到工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)微藻時(shí)成本問(wèn)題，且總產(chǎn)脂量近乎相等，所以本實(shí)驗(yàn)最終選擇青霉素。在BG11異養(yǎng)培養(yǎng)基中加入濃度為1.0 mg/L的青霉素后，C.vulgar HDA04生物量和相對(duì)含油量最高達(dá)到2.63±0.03 g/L和7.77±0.16，與未添加抗生素(2.31±0.12 g/L、3.41±0.08)相比，生物量和相對(duì)含油量分別提高了13.9%和128.9%。低濃度的青霉素能夠促進(jìn)微藻的生長(zhǎng)，姜思等[24]曾在2016年進(jìn)行抗生素對(duì)萊茵衣藻生長(zhǎng)及光化學(xué)影響的研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，低于100 μg/mL的氨芐青霉素處理會(huì)使萊茵衣藻的細(xì)胞密度增加。鄭凌凌等[23]發(fā)現(xiàn)低質(zhì)量濃度的氨芐青霉素對(duì)雨生紅球藻FACHB-712的生長(zhǎng)起促進(jìn)作用，陳淑吟等[25]研究發(fā)現(xiàn)，青霉素濃度為0.5～1.0 mg/L時(shí)有利于異膠藻(Heterogloea sp.)的培養(yǎng)和保存且效果較好，但青霉素濃度≥2.0 mg/L對(duì)三角褐指藻(P.ricornurum)的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用，這與本試驗(yàn)的結(jié)論基本相符。但由于不同微藻對(duì)抗生素的敏感性以及藻液中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)特征影響不同，所以要慎重選擇抗生素。

微藻培養(yǎng)條件優(yōu)化與探索，是實(shí)現(xiàn)其快速生長(zhǎng)和脂肪酸產(chǎn)量提升的重要手段。C.vulgar HDA04是從鹽堿湖分離得到，所以鹽度需求較其他藻株要高。馮倩等[26]研究表明，鹽度對(duì)藻類(lèi)脂肪酸的積累有不同程度的影響，提高氯化鈉濃度可以促進(jìn)微藻脂肪酸的積累，但不利于生物量增加，說(shuō)明鹽度脅迫導(dǎo)致的滲透壓變化對(duì)細(xì)胞吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和胞內(nèi)生化反應(yīng)產(chǎn)生影響，不利于細(xì)胞增長(zhǎng)繁殖，但可促使細(xì)胞積累脂肪酸。這與本研究結(jié)果大致相符，即高濃度的氯化鈉對(duì)生物量有明顯抑制作用，對(duì)相對(duì)含油量無(wú)太大影響。藻類(lèi)對(duì)氮元素的吸收會(huì)引起培養(yǎng)基pH的變化，繼而會(huì)影響細(xì)菌新陳代謝，所以選擇BG11培養(yǎng)基中唯一氮源-蛋白胨為研究對(duì)象，探究C.vulgar HDA04生長(zhǎng)的最適蛋白胨濃度。當(dāng)添加氯化鈉濃度8 g/L和蛋白胨濃度1.5 g/L時(shí)，C.vulgar HDA04的生物量和相對(duì)含油量水平最高達(dá)到4.26±0.35 g/L和27.04±1.13，較對(duì)照組提高111%和692.3%。本研究?jī)H對(duì)C.vulgar HDA04的抗生素敏感性和發(fā)酵條件進(jìn)行了較為基礎(chǔ)的研究，后續(xù)還需要探究C.vulgar HDA04生長(zhǎng)速率與脂質(zhì)積累之間的關(guān)系，制定出藻株脂質(zhì)合成過(guò)程中參數(shù)的最優(yōu)控制策略。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)以實(shí)驗(yàn)室自存的小球藻(Chlorella vulgaris)HDA04作為出發(fā)藻株，利用抗生素對(duì)C.vulgar HDA04進(jìn)行分離純化，以此為基礎(chǔ)，對(duì)C.vulgar HDA04培養(yǎng)基成分進(jìn)行了優(yōu)化。在搖瓶水平下，青霉素濃度為1.0 mg/L，氯化鈉濃度為8 g/L、蛋白胨濃度為1.5 g/L時(shí)，C.vulgar HDA04的生物量和相對(duì)含油量最高，分別達(dá)到4.26±0.35 g/L和27.04±1.13。