許 睿，錢 軍，張明亮，張立功，郭晨旭，謝 強

（蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院腫瘤外科-中德乳腺VIP病區(qū)，安徽 蚌埠 233000）

最新調查顯示，乳腺癌的發(fā)病率在女性癌癥中逐年上升，成為世界上最常見的癌癥之一［1］。雖然近年來乳腺癌患者的總體生存和預后有所改善，但轉移仍是患者死亡的首要原因。乳腺癌轉移患者5年生存率僅26%，而非轉移患者通過治療后總生存率可以達到90%［2-3］。因此，確定乳腺癌轉移的潛在分子機制和開發(fā)新的治療靶點成為乳腺癌治療的必要途徑。

長鏈非編碼RNA（Long non-coding RNA，lncRNA）是一組長度超過200 個核苷酸的非編碼RNA［4］。在最近的研究中證實，lncRNA 在基因表達調控方面發(fā)揮著極其重要的作用，并參與了腫瘤的形成、增殖、侵襲、轉移、耐藥性等［5］。LncRNA MEG3 定位于人類染色體14q32，屬于DLK1-MEG3 基因座［6］。最近幾年引起了人們的廣泛關注，已有學者表明lncRNA MEG3可作為抑癌基因調控癌細胞的增殖和轉移［7］，但在侵襲和遷移方面的機制并無具體研究。因此，本研究主要在細胞水平上通過在乳腺癌細胞系中過表達lncRNA MEG3，檢測細胞遷移及侵襲能力的改變，并探討其潛在機制。

1 材料與方法

1.1 細胞及主要試劑乳腺癌細胞MDA-MB-231、MCF-7、SKBR-3 均由中國科學院上海細胞庫提供；pcDNA3.1-vector和pcDNA3.1-MEG3由上海吉凱基因公司合成；RPMI-1640 培養(yǎng)基及胎牛血清由美國Gibco 公 司 提 供；Lipofectamine 2000 轉 染 試 劑、TRIzol?Plus RNA Purification Kit 和Revert Aid First Strand cDNA short kit 由美國Invitrogen 公司生產；Power SYBR?Green PCR Master Mix 由瑞士Roche 公司提供；兔抗人E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin 及β-actin 單克隆抗體及鼠抗兔IgG 二抗均購自英國Abcam 公司；結晶紫溶液及BCA 蛋白濃度測定試劑盒由上海碧云天公司生產；Transwell 小室購于美國Corning 公 司；matrigel 基 質膠 由 美 國Sigma 公 司 生產；LncRNA MEG3 引物序列由上海吉凱基因提供，引 物 序 列 如 下 ： MEG3-F： 5'-ATCATCCGTCCACCTCCTTGTCTTC-3'，MEG3-R：5'-GTATGAGCATAGCAAAGGTCAGGGC-3'miRNA-21-F：5'-TTTTGTTTTTGCTGGTCTTAG-3'；miRNA-21-R：5'-AGCAGACAGTCAGGCAGGAT-3'；GAPDH-F：5'-TGGTATCGTGGAAGGACTCAT-3'，GAPDH-R：5'-GTGGGTGTCGCTGTTGAAGTC-3'。

1.2 乳腺癌細胞株RNA 提取及qRT-PCR 反應取相應的對數(shù)生長期乳腺癌細胞株，通過Trizol?氯仿?異丙醇法提取總RNA，繼而逆轉錄成合成cDNA。以cDNA 為模板，進行PCR 擴增，GAPDH 為內參，采用2-△△Ct方法計算LncRNA MEG3的表達量。反應條件：①變性95 ℃25 s；②退火60 ℃25 s；③延伸72 ℃30 s。共40個循環(huán)。

1.3 細胞培養(yǎng)與轉染人乳腺癌細胞株由10%胎牛血清及1%青鏈霉素溶液配置成的RPMI-1640 培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，置于37 ℃，5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中。當細胞處于對數(shù)生長期時，取適量細胞接種于六孔板中，按10 μL的Lipo2000?混合4 μg質粒置入500 μL不含血清的培養(yǎng)基中，細胞培養(yǎng)6 h 后更換不含雙抗的10%胎牛血清培養(yǎng)基，48 h后繼續(xù)進行實驗。

1.4 Western blot 檢測乳腺癌細胞中EMT 相關蛋白表達變化取對數(shù)生長期乳腺癌細胞，加入裂解液，提取總蛋白，BCA 試劑盒進行蛋白定量。以每孔15～20 μg 總蛋白量進行SDS-PAGE 凝膠電泳，轉膜后以5%脫脂牛奶封閉2 h，T-TBS漂洗。E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin（英國Abcam 公司；ab231303，ab76011，ab16700）一抗以1∶1 000稀釋，β-actin一抗以1∶2 000稀釋，冰箱4 ℃孵育過夜。二抗以1∶5 000稀釋，室溫搖床孵育1 h，T-TBS 漂洗，ECL 顯色。以β-actin（英國Abcam；ab6276）為內參，用Image J 分析目的條帶與內參條帶灰度值的比值來計算目的蛋白相對表達量。

1.5 劃痕實驗取對數(shù)生長期細胞，以細胞數(shù)4×105個/孔接種于六孔板中。待細胞鋪滿板底后，使用10 μL體積的移液器吸頭在板底中心進行筆直刮擦。用PBS（磷酸鹽緩沖鹽溶液，HyClone，美國）洗滌后，添加無血清培養(yǎng)基，24 h后進行顯微鏡觀察和成像。

1.6 Transwell 實驗提前24 h 配置matrigel 基質膠，均勻鋪于transwell 小室底部。取對數(shù)生長期細胞，胰酶消化后，將每組細胞懸浮在無血清培養(yǎng)基中，配置成2×105個·mL-1細胞濃度，取200 μL位于上室，將完全培養(yǎng)基（700 μL）置于下室，培養(yǎng)24 h。然后用甲醇處理20 min，結晶紫染色。最后，使用倒置顯微鏡任意捕獲5個視野，在20倍鏡下進行細胞計數(shù)。

1.7 統(tǒng)計學分析采用SPSS 21.0 及Graph Prism 7.0 軟件進行分析及統(tǒng)計繪圖，配對t檢驗用于兩組間比較，實驗數(shù)據(jù)以均值±標準差進行表示。所有實驗均重復3次，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 qRT-PCR 檢測三種乳腺癌細胞株LncRNA MEG3 表達水平通過qRT-PCR 檢測得出，三種乳腺癌細胞株中，MCF-7細胞中LncRNA MEG3（0.49±0.037）表達水平較MDA-MB-231（0.92±0.049）與SKBR-3（0.67±0.023）表達更低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。因此選取細胞株MCF-7 進行質粒轉染，并進行接下來的實驗，見圖1。

圖1 qRT?PCR檢測三種乳腺癌細胞中LncRNA MEG3基因相對表達水平（P＜0.05）

2.2 qRT-PCR 驗 證pcDNA3.1-MEG3 重組質 粒轉染效率通過qRT-PCR 檢測得出，經過pcDNA3.1-MEG3 轉染的MCF-7 乳腺癌細胞株（12.7±0.750）與轉染空載體（1.19±0.096）和未轉染（1.3±0.202）的細胞株相比，LncRNA MEG3 表達水平升高（P＜0.05），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖2。

2.3 qRT-PCR 檢測轉染后乳腺癌細胞中miRNA-21 的表達量變化通過qRT-PCR 檢測得出，經過pcDNA3.1-MEG3轉染的MCF-7乳腺癌細胞（2.947±0.436 3）與轉染空載體（5.663±0.331 9）和未轉染（6.617±0.291 6）的細胞株相比，miRNA-21的表達量降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖3。

圖2 轉染后檢測LncRNA MEG3在MCF?7細胞中表達水平（P＜0.05）

圖3 LncRNA MEG3 過表達抑制MCF?7 細胞miRNA?21 的表達量（P＜0.05）

2.4 LncRNA MEG3 過表達抑制乳腺癌細胞MCF-7 遷移劃痕實驗結果顯示，過表達組細胞遷移率為（17.6±1.323），而轉染空載體組與未轉染組遷移率分別為（35.7±1.572）與（31.27±2.085），過表達組遷移率低于空載體與未轉染組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖4。

圖4 LncRNA MEG3過表達抑制MCF?7細胞遷移能力

2.5 LncRNA MEG3 過表達抑制乳腺癌細胞MCF-7 侵襲Transwell 實驗結果得出，過表達組細胞穿膜率為（40.73±4.087），而轉染空載體組與未轉染組遷移率分別為（72.12±1.898）與（71.67±1.846），過表達組侵襲能力低于空載體與未轉染組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖5。

2.6 LncRNA MEG3 影響MCF-7 乳腺癌細胞EMT相關蛋白表達Western blot實驗結果顯示，相較于空載體組與未轉染組，過表達組中E-Cadherin相對表達量升高，而N-Cadherin 與Vimentin 相對表達量則降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P 均＜0.05），見圖6。

圖5 LncRNA MEG3過表達抑制MCF?7細胞侵襲能力

圖6 LncRNA MEG3過表達的MCF?7細胞EMT相關蛋白的變化情況

3 討 論

乳腺癌是全世界婦女最常見的惡性腫瘤之一，近年來，我國乳腺癌發(fā)生率及死亡率逐年上升，并呈年輕化發(fā)展趨勢［8］。乳腺癌的根本治療手段為手術治療，但手術治療對于晚期轉移患者的治療效果并不理想。所以乳腺癌患者的早發(fā)現(xiàn)，早診斷，早治療對于病情的控制非常重要。因此，尋找乳腺癌相關標志物及獲取相關生物學指標對于早期的癌癥篩查工作具有重要意義。

已有研究證實，LncRNA在基因表達調控方面發(fā)揮著極其重要的作用，WANG 的研究表明lncRNA SNHG7 促進胃癌細胞增殖，抑制胃癌細胞凋亡［9］。ZHANG 等發(fā)現(xiàn)lncRNA Linp1 在人類三陰性乳腺癌中被過度表達，并加強細胞DNA 的修復［10］。這些研究表明，LncRNA 可能成為惡性腫瘤早期診斷篩查的特異性標志物。且最新研究發(fā)現(xiàn)LncRNA MEG3可通過多種機制參與細胞蛋白表達的調控，DAN 等學者研究發(fā)現(xiàn)LncRNA-MEG3 在胃癌中通過調節(jié)miRNA-21 抑制增殖和轉移［11］。LING 等學者指出LncRNA-MEG3 抑制細胞生長并以miR-93 為靶點，抑制PI3K/AKT信號傳導通路［12］。但LncRNA-MEG3在乳腺癌中的作用尚不清楚，本研究通過過表達MCF-7細胞中LncRNA-MEG3，檢測MCF-7細胞侵襲及遷移的變化情況，并聯(lián)系EMT 相關蛋白變化情況，探討相關機制研究。

本研究發(fā)現(xiàn)，通過pcDNA3.1-MEG3 重組質粒成功過表達MCF-7 細胞中LncRNA-MEG3，并通過qRT-PCR 發(fā)現(xiàn)miRNA-21 的表達明顯受到抑制。我們采用劃痕實驗及Transwell 實驗，分別檢測了MCF-7 細胞遷移及侵襲能力的改變情況，發(fā)現(xiàn)LncRNA-MEG3 能夠有效的抑制MCF-7 細胞的遷移及侵襲能力。并通過Western blot實驗，檢測了EMT相關蛋白表達情況，過表達后的MCF-7細胞E-Cadherin蛋白表達量上調而N-Cadherin及Vimentin蛋白表達量下調。

綜上所述，LncRNA-MEG3 的表達能夠調控miRNA-21的表達變化，進而改變乳腺癌細胞MCF-7侵襲及遷移能力，且LncRNA-MEG3 表達水平越高，miRNA-21 表達水平越低，細胞侵襲及遷移能力就越弱，且這種調節(jié)機制可能與EMT 相關蛋白調控有關。但本文只是對細胞學方面做了一部分探討，沒有真正調查臨床患者的實際情況，存在一定的局限性，下一步準備收集病患資料，研究LncRNA-MEG3 是否會影響患者生存率?？傊?，本研究是首次報道LncRNA-MEG3 與乳腺癌細胞之間的相關性，我們希望能夠作為一個新的思路運用到乳腺癌的相關生物學指標及靶向治療當中去。