車欣 朱婷 伍瓏 胡蓉菲

(復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院北院寶山分院超聲科, 上海 200431)

乳腺癌是常見的女性惡性腫瘤，近年來我國(guó)的發(fā)病率居高不下[1]。隨著分子生物學(xué)的迅猛發(fā)展，許多與乳腺癌病理及預(yù)后有關(guān)的分子標(biāo)志物成為了眾多學(xué)者研究的重點(diǎn)，如普遍被認(rèn)知的雌激素受體(Estrogen Receptor，ER)、孕激素受體(Progesterone Receptor，PR)、人表皮生長(zhǎng)因子受體2(Human Epidermal Growth Factor Receptor-2，HER-2)和Ki67等[2-5]。由于乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制非常復(fù)雜，近年來許多研究者也報(bào)道了包括血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF)、特異AT序列結(jié)合蛋白1(Special-At Rich Sequence Binding Protein 1，SATB1)和CK5/6等在內(nèi)的其他分子標(biāo)志物與乳腺癌病理和預(yù)后密切相關(guān)[6-8]。然而，目前這些分子標(biāo)志物的檢測(cè)都是有創(chuàng)性的，需通過獲得活體組織標(biāo)本，結(jié)合病理診斷結(jié)果才能完成。常規(guī)超聲、剪切波彈性成像(Shear Wave Elastography，SWE)和超聲造影(Contrast-Enhanced Ultrasonography，CEUS)都是常用的乳腺病變臨床檢測(cè)方式。已有研究報(bào)道，常規(guī)超聲、SWE和CEUS特征與乳腺癌ER、PR、HER-2和Ki67表達(dá)有關(guān)[9-10]，而目前還未有研究探討多模態(tài)超聲特征與VEGF、SATB1和CK5/6這些已被報(bào)道的乳腺癌相關(guān)分子標(biāo)志物的相關(guān)性。因此，本研究旨在通過描述不同VEGF、SATB1和CK5/6表達(dá)狀態(tài)乳腺癌的多模態(tài)超聲特征，探討兩者的的相關(guān)性，以期術(shù)前無創(chuàng)評(píng)估乳腺癌預(yù)后，從而為疾病的臨床診治提供影像學(xué)新思路。

1 材料與方法

1.1 一般資料 選取2018年8月～2020年8月于復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院寶山分院和西北婦女兒童醫(yī)院行手術(shù)治療的216例女性乳腺癌患者為研究對(duì)象，共216個(gè)病灶?；颊吣挲g21～79歲，平均(46.33±7.48)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)前均行常規(guī)超聲、SWE和超聲造影檢查，檢查前未行穿刺及切檢操作。②檢查前未進(jìn)行放、化療和內(nèi)分泌治療。③術(shù)后切除標(biāo)本組織行病理和免疫組化分析，檢測(cè)VEGF、SATB1和CK5/6表達(dá)情況。④自愿參加研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：①?gòu)?fù)發(fā)、多灶及雙側(cè)乳腺病灶。②超聲特征或免疫組化資料不完整。本研究獲得了醫(yī)院倫理委員會(huì)審核并通過，并且患者簽署了知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 儀器和檢查方法 采用超聲科Supersonic Imagine Aixplorer型超聲診斷儀，常規(guī)超聲及SWE成像使用L15-4線陣探頭，頻率4～15 MHz; CEUS使用L10-2線陣探頭，頻率2～10 MHz。根據(jù)ACR第五版BI-RADS分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)病灶大小、內(nèi)部回聲、后方回聲、腫塊邊緣、有無微鈣化以及血流程度等常規(guī)超聲特征進(jìn)行觀察描述。然后切換至SWE模式，當(dāng)發(fā)現(xiàn)病灶周圍高彈性模量的“硬環(huán)征”或病灶中心彈性模量缺失的“黑洞征”時(shí)，進(jìn)行記錄。更換探頭，調(diào)至造影模式，選擇病灶區(qū)與周圍正常乳腺組織為感興趣區(qū)，得到時(shí)間強(qiáng)度曲線，分析病灶的增強(qiáng)強(qiáng)度、以及是否早于周邊正常組織增強(qiáng)或消退。

1.2.2 免疫組織化學(xué)方法及判定標(biāo)準(zhǔn) 取手術(shù)切除乳腺癌標(biāo)本，采用免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)乳腺癌組織中的VEGF、SATB1和CK5/6。評(píng)估時(shí)采用雙盲法，當(dāng)結(jié)果不一致時(shí)，可由2名以上主任醫(yī)師進(jìn)行商討，最終確定評(píng)定結(jié)果。判定標(biāo)準(zhǔn)為：VEGF主要定位在細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色，陽性細(xì)胞百分比計(jì)分如下：無陽性細(xì)胞為0分，1%～10%為1分，11%～25%為2分，26%～50%為3分，51%～75%為4分，≥76%為5分；染色強(qiáng)度計(jì)分如下：無著色為0分，淡黃色或黃色為1 分，棕黃色為2分，棕褐色為3分，取兩項(xiàng)乘積作為最終得分，其中分?jǐn)?shù)>3分為陽性，≤3分為陰性[11]。SATB1定位于細(xì)胞核，顆粒為棕黃色且陽性細(xì)胞百分比≥50%，或顆粒為棕褐色且陽性細(xì)胞百分比≥25% 即為表達(dá)陽性，否則認(rèn)為表達(dá)陰性[12]。CK5/6 定位于細(xì)胞質(zhì)，有棕黃色顆粒出現(xiàn)即為陽性細(xì)胞，若陽性細(xì)胞百分比<10%，則為CK5/6陰性；若≥10%，則為 CK5/6 陽性[13]。

2 結(jié)果

2.1 病理及免疫組化結(jié)果 216例乳腺癌中，浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌176例、導(dǎo)管內(nèi)原位癌20例、黏液腺癌12例、髓樣癌4例、2例惡性葉狀腫瘤、2例多形性癌。腫瘤直徑0.5～4.0 cm，平均(2.19±0.88) cm。VEGF陽性128例(59.3%)，陰性88例(40.7%)；SATB1陽性144例(66.7%)，陰性72例(33.3%)；CK5/6陽性156例(72.2%)，陰性60例(27.8%)。

2.2 常規(guī)超聲特征與VEGF、SATB1和CK5/6表達(dá)水平的關(guān)系 常規(guī)超聲特征中有無微鈣化與VEGF表達(dá)水平有關(guān)，VEGF陽性者出現(xiàn)微鈣化的比例均顯著高于陰性者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。腫塊邊緣狀態(tài)和有無微鈣化與SATB1表達(dá)水平有關(guān)，SATB1陽性者出現(xiàn)腫塊邊緣不光整和鈣化的比例均顯著高于陰性者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。有無微鈣化與CK5/6表達(dá)水平有關(guān)，CK5/6陽性者出現(xiàn)微鈣化鈣化的比例顯著高于陰性者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

VEGF、SATB1和CK5/6表達(dá)陽性的患者常規(guī)超聲多表現(xiàn)為邊緣不光整和微鈣化，見圖1A; VEGF、SATB1和CK5/6表達(dá)陰性的患者常規(guī)超聲多表現(xiàn)為邊緣光整和無微鈣化，見圖1B。

表1 常規(guī)超聲特征與VEGF表達(dá)水平的關(guān)系

表2 常規(guī)超聲特征與SATB1表達(dá)水平的關(guān)系

表3 常規(guī)超聲特征與CK5/6表達(dá)水平的關(guān)系

2.3 SWE征象與VEGF、SATB1和CK5/6表達(dá)水平的關(guān)系 VEGF陽性和陰性者出現(xiàn)硬環(huán)征、黑洞征的比例比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；SATB1和CK5/6陽性者出現(xiàn)硬環(huán)征的比例均顯著高于陰性者(P<0.05)，而出現(xiàn)黑洞征的比例在各組陽性和陰性者間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表4。SWE典型征象硬環(huán)征和黑洞征，見圖2。

圖1 乳腺癌常規(guī)超聲典型特征

表4 SWE征象與VEGF、SATB1和CK5/6表達(dá)水平的關(guān)系

圖2 乳腺癌SWE典型特征

2.4 CEUS特征與VEGF、SATB1和CK5/6表達(dá)水平的關(guān)系 CEUS的增強(qiáng)程度、增強(qiáng)方式和消退方式均與VEGF表達(dá)水平有關(guān)，VEGF陽性表達(dá)者出現(xiàn)高增強(qiáng)、晚增強(qiáng)和晚消退的比例顯著高于陰性者(均P<0.05)，見表5。消退方式與SATB1表達(dá)水平有關(guān)，SATB1陽性者出現(xiàn)晚消退的比例顯著高于陰性者(P<0.05)，見表6。增強(qiáng)程度和消退方式均與CK5/6表達(dá)水平有關(guān)，CK5/6陽性表達(dá)者出現(xiàn)高增強(qiáng)和晚消退的比例均顯著高于陰性者(P<0.05)，見表7。

VEGF、SATB1和CK5/6表達(dá)陽性的患者CEUS多表現(xiàn)為高增強(qiáng)，見圖3A。VEGF、SATB1和CK5/6表達(dá)陰性的患者CEUS多表現(xiàn)為無增強(qiáng)，見圖3B。

表5 CEUS特征與VEGF表達(dá)水平的關(guān)系

表6 CEUS特征與SATB1表達(dá)水平的關(guān)系

表7 CEUS特征與CK5/6表達(dá)水平的關(guān)系

2.5 二元Logistic回歸分析 對(duì)單因素分析中的變量賦值，見表8。分別以VEGF、SATB1和CK5/6表達(dá)水平為因變量(陰性=0；陽性=1)，以各自單因素分析結(jié)果中有意義的變量作為自變量，進(jìn)行二元Logistic分析。結(jié)果顯示，CEUS表現(xiàn)高增強(qiáng)、晚消退是乳腺癌VEGF表達(dá)陽性的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)；出現(xiàn)微鈣化、硬環(huán)征和CEUS表現(xiàn)晚消退是SATB1表達(dá)陽性的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)；出現(xiàn)微鈣化，CEUS表現(xiàn)高增強(qiáng)、晚消退是乳腺癌CK5/6表達(dá)陽性的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)，見表9。

圖3 乳腺癌CEUS典型特征

表8 多模態(tài)超聲特征各變量的賦值

表9 Logistic回歸分析結(jié)果

3 討論

目前乳腺癌位居我國(guó)女性主要癌癥發(fā)病率的首位，嚴(yán)重影響患者身心健康。由于乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制十分復(fù)雜，并且尚不明確，隨著分子生物學(xué)的發(fā)生，近年來許多學(xué)者都致力于對(duì)乳腺癌分子標(biāo)志物的研究，以期找到分子靶向乳腺癌治療的突破點(diǎn)[14-15]。VEGF在腫瘤血管形成及轉(zhuǎn)移中起重要作用，VEGF對(duì)乳腺癌的預(yù)后有明顯影響，VEGF表達(dá)陽性的乳腺癌患者的無進(jìn)展生存期及生存率往往較短，且對(duì)放、化療及內(nèi)分泌治療等敏感性下降[16]。SATB1是一種組織特異性表達(dá)的核基質(zhì)結(jié)合區(qū)結(jié)合蛋白，可參與T細(xì)胞的發(fā)育和成熟，研究顯示SATB1與乳腺癌發(fā)展的惡性進(jìn)程有關(guān)，其高表達(dá)可能提示乳腺癌的預(yù)后不良[7]。CK5/6屬于細(xì)胞角蛋白家族中的一員，主要表達(dá)于上皮組織的基底細(xì)胞層，CK5/6陽性是三陰性乳腺癌患者預(yù)后的重要危險(xiǎn)因素，與CK5/6 陰性患者相比，CK5/6陽性的患者可以更多地從蒽環(huán)聯(lián)合紫杉類化療中獲益[17]。因此，這些分子標(biāo)志物都是乳腺癌相關(guān)的預(yù)后分子標(biāo)志，術(shù)前通過無創(chuàng)的超聲檢測(cè)方式鑒別其在乳腺癌中的表達(dá)狀態(tài)對(duì)臨床診治可提供一定參考價(jià)值。

超聲檢查是目前乳腺檢查中應(yīng)用最廣泛的一種檢查手段，可用來判斷腫塊部位、大小及性質(zhì)[18]。本研究結(jié)果顯示，常規(guī)超聲特征中是否有微鈣化與VEGF、CK5/6表達(dá)水平有關(guān)，腫塊邊緣狀態(tài)和是否有微鈣化與SATB1表達(dá)水平有關(guān)，可見微鈣化的發(fā)生對(duì)判斷乳腺癌預(yù)后因子的表達(dá)至關(guān)重要。微鈣化是由于腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)過快，癌細(xì)胞氧耗增加導(dǎo)致營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)不足，從而發(fā)生變性溶解，引起鈣鹽沉積而形成的。腫瘤的惡性程度越高越容易發(fā)生微鈣化，而惡性程度高的腫瘤往往也預(yù)后較差[19]。此外，腫塊邊緣狀態(tài)也可能是乳腺癌預(yù)后因子SATB1陽性表達(dá)的預(yù)測(cè)因素，相對(duì)于SATB1陰性者，陽性者可能更成“侵襲性”生長(zhǎng)，對(duì)周圍組織有浸潤(rùn)，并且存在炎性反應(yīng)，故具有上述邊緣不規(guī)整的征象出現(xiàn)[10]。

SWE能實(shí)時(shí)采集乳腺正常組織和病灶成像速度方面的變化，亦能通過實(shí)時(shí)獲取局部組織的定性表現(xiàn)來直觀反映病變組織的空間分布，為乳腺良惡性病變的鑒別診斷提供了新的依據(jù)[20]。本研究中探討了乳腺癌典型SWE征象 “硬環(huán)征”和“黑洞征”與預(yù)后分子標(biāo)志物的相關(guān)性，結(jié)果顯示，SATB1和CK5/6陽性者出現(xiàn)“硬環(huán)征”的比例均顯著高于陰性者，而出現(xiàn)黑洞征的比例在各組陽性和陰性者中的比例無顯著差異。對(duì)于“硬環(huán)征”的出現(xiàn)，有研究[20]提出了兩種解釋，一種是促纖維結(jié)締組織增生導(dǎo)致間質(zhì)組織致密纖維化，或癌細(xì)胞浸潤(rùn)間質(zhì)組織，導(dǎo)致病灶周緣硬度增加，第二種是剪切波在經(jīng)過乳腺惡性病灶周緣時(shí)，能量發(fā)生衰減，以致進(jìn)入病灶內(nèi)部時(shí)振幅和/或噪聲減少，而導(dǎo)致硬環(huán)征的產(chǎn)生。張美戀[20]的研究顯示，“硬環(huán)征”對(duì)乳腺癌的惡性病灶具有預(yù)測(cè)作用，也在一定程度上反映了疾病的預(yù)后不良，因此是乳腺癌預(yù)后因子陽性表達(dá)的危險(xiǎn)因素。

CEUS能夠充分顯示腫瘤新生血管，從而為評(píng)價(jià)乳腺腫瘤的微血管灌注提供了可能。本研究中只分析了病灶的CEUS增強(qiáng)強(qiáng)度以及病灶是否早于周邊正常組織增強(qiáng)或消退。結(jié)果顯示，CEUS表現(xiàn)高增強(qiáng)、晚消退與VEGF和CK5/6陽性表達(dá)有關(guān)，晚消退與SATB1陽性表達(dá)有關(guān)。乳腺癌是一種血管依賴性病變，新生血管由于缺乏肌層，管壁較薄且走形扭曲，容易形成動(dòng)靜脈瘺，這可能會(huì)導(dǎo)致乳腺癌CEUS的高增強(qiáng)，此外，而新生血管扭曲，狹窄，并且內(nèi)部易有癌栓形成，阻塞出路，這可能是出現(xiàn)晚消退的原因。本研究結(jié)果提示，CEUS表現(xiàn)高增強(qiáng)和晚消退可以預(yù)測(cè)乳腺癌預(yù)后因子的表達(dá)。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果顯示，乳腺癌多模態(tài)超聲特征可用于預(yù)測(cè)VEGF、SATB1和CK5/6的表達(dá)狀態(tài)，從而為疾病的臨床診治提供重要參考依據(jù)。