王琰 易翅翔 邱勛永 陳鵬 明光福

(海南省人民醫(yī)院·海南醫(yī)學(xué)院附屬海南醫(yī)院顯微手外科，海南 ?？?570100)

骨愈合延遲或失敗是困擾骨科醫(yī)生的一個(gè)嚴(yán)重問題，70%以上的高能骨折患者至少需要進(jìn)行一次骨外科手術(shù)。約5%～10%的高能骨折患者在接受常規(guī)治療后會出現(xiàn)愈合延遲或骨不連現(xiàn)象[1]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells，BMSCs)為促進(jìn)骨折愈合提供了一種新的治療策略，可以促進(jìn)骨折愈合[2]。BMSCs遷移到骨折部位、提供抗氧化保護(hù)和分化為成骨細(xì)胞，在骨折愈合中具有重要作用[3]。骨折后，內(nèi)源性BMSCs向骨折部位遷移是成骨細(xì)胞成熟和礦化組織形成的關(guān)鍵步驟。BMSCs向骨折部位遷移并分化為成骨細(xì)胞和軟骨母細(xì)胞，通過膜內(nèi)骨化或軟骨內(nèi)骨化促進(jìn)骨折愈合[4]。異槲皮苷(槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷)是天然黃酮醇槲皮素的主要糖苷形式之一，廣泛存在于水果、蔬菜、藥材和植物源性食品中[5]。有研究表明，異槲皮苷可通過多種途徑發(fā)揮增殖、凋亡、抗氧化和抗炎作用[6]。此外，有證據(jù)顯示，異槲皮苷可通過促進(jìn)BMSCs增殖、ALP活性和鈣沉積，上調(diào)runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runt-Related Transcription Factor 2，Runx2)表達(dá)促進(jìn)上頜快速擴(kuò)弓中腭中縫骨形成[7]。因此，本研究旨在探討異槲皮苷通過促進(jìn)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞遷移和成骨分化對大鼠骨折愈合的影響，以期為進(jìn)一步了解異槲皮苷在骨折中的作用機(jī)制及開發(fā)更有效的骨折治療策略提供新的科學(xué)資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級，雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠45只，6～8周齡，體質(zhì)量200～250 g，購自海南省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[生產(chǎn)許可證號SCXK(瓊)2018-0007]。大鼠飼養(yǎng)于我院標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物房，使用許可證號：SYXK(瓊)2018-0006，環(huán)境溫度19～24 ℃，相對濕度45%～55%。大鼠用普通飼料喂養(yǎng)，自由進(jìn)食及飲水。本實(shí)驗(yàn)獲得我院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理委員會批準(zhǔn)，編號HNZC. No20180930c0501210。

1.2 主要試劑 異槲皮苷粉劑，產(chǎn)品純度：HPLC≥98%，產(chǎn)品批號：JOT-10129(成都普菲德生物技術(shù)有限公司)；FITC-CD29抗體(英國Abcam公司)；PE-CD90抗體(英國Abcam公司)；FITC-CD45抗體(英國Abcam公司)；PE-CD31抗體(英國Abcam公司)；CCK-8檢測試劑盒(日本同仁化學(xué)研究所)；堿性磷酸酶(ALP)檢測試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；Transwell小室(美國康寧公司)；茜素紅S染液(北京索萊寶科技有限公司)；Runx2抗體(英國Abcam公司)；OCN抗體(英國Abcam公司)；Ⅰ型膠原抗體(英國Abcam公司)；GAPDH抗體(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)；HRP標(biāo)記二抗(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)；胎牛血清(美國賽默飛世爾科技公司)；DMEM培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)；Percoll細(xì)胞分離液(北京華越洋生物科技有限公司)；間充質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基(深圳市百恩維生物科技有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 BMSCs分離與培養(yǎng)[8]取5只6周齡SD大鼠，處死大鼠。大鼠經(jīng)75%酒精消毒后，剖取大鼠股骨，用DMEM培養(yǎng)基沖洗股骨髓腔，收集沖洗液，過尼龍網(wǎng)。隨后加入等體積Percoll細(xì)胞分離液，2400 r/min離心20 min。收集離心管中間的白色層，PBS清洗2次后，用含10%FBS的DMEM重懸細(xì)胞，然后以2×105/cm2的細(xì)胞密度接種于培養(yǎng)皿，72 h后更換培養(yǎng)液，棄掉未貼壁細(xì)胞，以后每3 d換液一次。細(xì)胞傳3代后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 流式細(xì)胞術(shù) 對數(shù)期生長的BMSCs經(jīng)0.25%胰酶消化后，取1×106個(gè)/孔BMSCs，PBS重懸細(xì)胞，加入FITC-CD29(1∶200)、PE-CD90(1∶300)、FITC-CD45(1∶300)和PE-CD31(1∶200)抗體，避光孵育30 min。PBS洗滌細(xì)胞并重懸。上流式細(xì)胞儀檢測CD29、CD90、CD45和CD31陽性細(xì)胞比例。

1.3.3 油紅O染色 當(dāng)BMSCs長至約80%～90%密度時(shí)，將培養(yǎng)基替換為成脂細(xì)胞特異性誘導(dǎo)培養(yǎng)基(含10%FBS，10 mMβ-甘油磷酸鈉，1 μM地塞米松，0.5 mM 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤， 10 μM胰島素和200 μM吲哚美辛的低糖DMEM)，每2 d更換一次培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)14 d。BMSCs棄去成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基，PBS清洗后，4%多聚甲醛固定。PBS清洗細(xì)胞后，0.3%紅油O室溫染色20 min。棄去染液，蒸餾水洗滌后，顯微鏡觀察并拍照。

1.3.4 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)分化 對數(shù)期生長的BMSCs經(jīng)0.25%胰酶消化后，將BMSCs移入離心管內(nèi)，1000 rpm離心5 min，去除上清，間充質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，以5×103cells/cm2細(xì)胞密度接種于培養(yǎng)皿，細(xì)胞置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔3～4 d換一次培養(yǎng)基。

1.3.5 茜素紅S染色 BMSCs經(jīng)過21 d成骨分化培養(yǎng)后，移除培養(yǎng)基，PBS清洗細(xì)胞，4%多聚甲醛室溫固定細(xì)胞30 min。PBS清洗后，加入茜素紅S染色3 min。PBS清洗后，光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行顯色觀察分析。

1.3.6 ALP活性檢測 BMSCs經(jīng)過21 d成骨分化培養(yǎng)后，收集BMSCs，按照ALP檢測試劑盒說明書進(jìn)行BMSCs的ALP活性檢測。

1.3.7 CCK-8檢測 BMSCs接種于96孔板中，5×103個(gè)/孔，96孔板置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。異槲皮苷用PBS溶解，分別以5、10、20、40、80 μmol/L終濃度處理BMSCs，對照組細(xì)胞添加PBS，細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。向每孔內(nèi)加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃條件下孵育3 h。酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光度(A)值。

1.3.8 Transwell實(shí)驗(yàn) 對數(shù)期生長的BMSCs經(jīng)0.25%胰酶消化后，無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整濃度為3×105個(gè)/mL。下室加入600 μL含10% FBS的培養(yǎng)基，上室加入150 μL細(xì)胞懸液，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，0.1%結(jié)晶紫染色，顯微鏡拍照和觀察。

1.3.9 Western blot檢測 BMSCs經(jīng)過21 d成骨分化培養(yǎng)后，收集BMSCs，RIPA裂解液裂解細(xì)胞，離心取上清，BCA法測定蛋白濃度。取30 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分離，隨后轉(zhuǎn)至PVDF膜上。10%脫脂奶粉封閉，隨后加入Runx2抗體(1∶1000)、OCN抗體(1∶1000)和GAPDH(1∶10000)，4 ℃條件下過夜孵育。加入HRP標(biāo)記二抗(1: 5000稀釋)室溫孵育1 h后，滴加BeyoECL Star工作液到膜上，化學(xué)發(fā)光成像儀檢測。

1.3.10 大鼠模型制備[9]與處理 40只SD大鼠適應(yīng)環(huán)境1周后，隨機(jī)分為對照組、BMSC組、異槲皮苷組和BMSC+異槲皮苷組，每組10只。所有大鼠使用腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉(40 mg/kg)。右膝行髕骨內(nèi)側(cè)切口，暴露股骨髁間凹，在髁內(nèi)鉆一個(gè)孔后，將克氏針沿脛骨平臺插入脛骨髓腔。使用鋼鋸橫行截?cái)喙晒?，形成橫行骨折。傷口青霉素消毒，隨后縫合傷口。術(shù)后給予注射青霉素預(yù)防感染。術(shù)后第1 d開始藥物干預(yù)：BMSC+異槲皮苷組尾靜脈注射2×106個(gè)BMSC，腹腔注射40mg/kg異槲皮苷[10]；對照組尾靜脈和腹腔注射等量PBS; BMSC組大鼠經(jīng)尾靜脈注射2×106個(gè)BMSC，腹腔注射等量PBS; 異槲皮苷組腹腔注射40 mg/kg異槲皮苷，尾靜脈注射等量PBS。每天給藥1次，最后一次給藥為處死大鼠前1 d。

1.3.11 X線檢測 骨折后2周或3周，使用戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉大鼠，使用數(shù)字X射線機(jī)，電壓45 kV，曝光時(shí)間0.06 ms，獲得前后位的放射照片，并采集股骨。對骨折愈合進(jìn)行評分[11]：1分，無鈣化；2分，斑片狀鈣化；3分，鈣化有骨痂出現(xiàn)；4分，骨痂跨越骨折間隙；5分，骨小梁連續(xù)；6分，正常骨重建。

1.3.12 免疫組化 取骨痂組織，常規(guī)石蠟包埋切片、脫蠟水化，H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶，在玻片上滴加正常山羊血清，室溫封閉30 min，加入OCN(1∶200)和I型膠原(Collagen type I，Col I)(1∶200)抗體4 ℃過夜孵育。二抗(1∶500)室溫孵育1 h。DAB顯色10 min，PBS沖洗后，蘇木精復(fù)染3 min，自來水沖洗1 min脫水、透明、封片、鏡檢。

免疫組化評分[12]是通過將免疫反應(yīng)細(xì)胞百分比(A，數(shù)量分?jǐn)?shù))與染色強(qiáng)度(B，染色強(qiáng)度分?jǐn)?shù))的估算值結(jié)合起來計(jì)算的：A，無陽性細(xì)胞=0，1%～10%陽性細(xì)胞=1，11%～50%陽性細(xì)胞=2，51%～80%陽性細(xì)胞=3，81%～100%陽性細(xì)胞=4；B： 陰性=0，弱陽性=1，中等陽性=2，強(qiáng)陽性=3。

2 結(jié)果

2.1 BMSCs分化潛能的鑒定 原代BMSCs細(xì)胞大小不一，形狀不規(guī)則；BMSCs傳代至第三代時(shí)，細(xì)胞形態(tài)呈紡錘形，大小均一，見圖1。流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CD29和CD90陽性率分別為99.0%和96.9%，CD45和CD31陽性率均為1.74%，見圖2。油紅O染色、ALP活性檢測和茜素紅S染色結(jié)果顯示，BMSCs具有誘導(dǎo)脂質(zhì)形成、ALP活性升高和鈣沉積的能力，即BMSCs具有成脂和成骨分化潛能，見圖3。因此，BMSCs可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 顯微鏡觀察BMSCs細(xì)胞形態(tài)(200×)

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測BMSCs表面分子標(biāo)志物CD29、CD90、CD45和CD31的表達(dá)

圖3 BMSCs成脂和成骨分化潛能的鑒定(200×)

2.2 異槲皮苷對BMSCs增殖的影響 與對照組相比，異槲皮苷在5、10、20 μmol/L濃度下促進(jìn)BMSCs增殖，其中10 μmol/L效果最為明顯，異槲皮苷在80 μmol/L濃度下抑制BMSCs增殖，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而異槲皮苷在40 μmol/L濃度下對BMSC增殖無明顯影響，見表1。

2.3 異槲皮苷促進(jìn)BMSCs遷移 Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照組相比，異槲皮苷在5 μmol/L和10 μmol/L濃度下促進(jìn)BMSCs遷移，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖4。

表1 異槲皮苷對BMSCs增殖的影響

2.4 異槲皮苷促進(jìn)BMSC的成骨分化 與對照組相比，異槲皮苷在5 μmol/L和10 μmol/L濃度下促進(jìn)BMSC中鈣沉積、ALP活性、Runx2和OCN蛋白表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，見圖5。

2.5 異槲皮苷協(xié)同BMSCs促進(jìn)大鼠股骨骨折模型的骨折愈合 與對照組相比，BMSC+異槲皮苷組大鼠在骨折2周后，骨折愈合評分升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，而BMSC組和異槲皮苷組大鼠在骨折2周后，骨折愈合評分無明顯差異(P>0.05)；與BMSC組相比，BMSC+異槲皮苷組大鼠在骨折2周后，骨折愈合評分升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與對照組相比，BMSC組、異槲皮苷組和BMSC+異槲皮苷組大鼠在骨折3周后，骨折愈合評分升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與BMSC組相比，BMSC+異槲皮苷組大鼠在骨折3周后，骨折愈合評分升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖6。

圖4 異槲皮苷促進(jìn)BMSCs遷移(100×)

圖5 異槲皮苷促進(jìn)BMSCs的成骨分化(100×)

圖6 異槲皮苷協(xié)同BMSC促進(jìn)大鼠股骨骨折模型的骨折愈合

2.6 異槲皮苷促進(jìn)骨痂中骨鈣素(Osteocalcin, OCN)OCN和ColⅠ的表達(dá) 與對照組相比，BMSC+異槲皮苷組大鼠在骨折2周后，骨痂中OCN和ColⅠ的表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而BMSC組和異槲皮苷組大鼠在骨折2周后，骨痂中OCN和ColⅠ的表達(dá)無明顯差異(P>0.05)；與BMSC組相比，BMSC+異槲皮苷組大鼠在骨折2周后，骨痂中OCN和ColⅠ的表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與對照組相比，BMSC組、異槲皮苷組和BMSC+異槲皮苷組大鼠在骨折3周后，骨痂中OCN和ColⅠ的表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與BMSC組相比，BMSC+異槲皮苷組大鼠在骨折3周后，骨痂中OCN和ColⅠ的表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖7～8。

圖7 異槲皮苷促進(jìn)骨痂中OCN的表達(dá)

3 討論

骨折是最常見的外科損傷之一，對患者的正常生活產(chǎn)生較大影響。骨折的一般治療方法是將移位的關(guān)節(jié)和骨結(jié)構(gòu)對齊，然后進(jìn)行固定，因?yàn)楣钦塾鲜瞧鞴僮陨淼男迯?fù)過程，該過程包括炎癥反應(yīng)、成骨、骨痂形成和重塑[13]。高能骨折是一種嚴(yán)重的創(chuàng)傷，愈合時(shí)間長[14]，5%～10%的高能骨折患者在接受常規(guī)治療后會導(dǎo)致愈合延遲或骨不連[1]。臨床醫(yī)生可以通過一些輔助治療促進(jìn)骨折愈合，以防止延遲愈合或骨不連。有研究表明，骨愈注射液，對骨痂的形成和重塑有很好的作用，但在骨折愈合早期愈合效果較差。骨瓜提取物注射液可促進(jìn)骨折愈合，但可能引起過敏性休克[15]。因此，開發(fā)安全有效的新藥物，對促進(jìn)骨折愈合具有重要意義。異槲皮苷在疾病中發(fā)揮抗氧化、抗凋亡和抗炎作用[16]。此外，有證據(jù)顯示，異槲皮苷可促進(jìn)上頜快速擴(kuò)弓中腭中縫骨形成[7]，但其對骨折的影響及可能的作用機(jī)制尚不明確。

圖8 異槲皮苷促進(jìn)骨痂中ColⅠ的表達(dá)

BMSCs具有高度的分化能力，是有效治療骨折的理想來源。據(jù)報(bào)道，干細(xì)胞療法對骨組織修復(fù)具有有益的作用，BMSCs移植可以刺激動(dòng)物骨缺損模型中的骨痂形成[17]。間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的生長因子和細(xì)胞因子通過多種信號途徑調(diào)節(jié)組織修復(fù)[18]。證據(jù)顯示，Runx2是成骨分化過程中的一個(gè)重要轉(zhuǎn)錄因子，ALP和OCN是成骨分化的標(biāo)志物，低濃度異槲皮苷能促進(jìn)成骨細(xì)胞和BMSCs增殖，高濃度的異槲皮苷可上調(diào)MC3T3-E1成骨細(xì)胞系A(chǔ)LP活性、Runx2和OCN表達(dá)，促進(jìn)成骨分化[19]。本研究結(jié)果顯示，異槲皮苷可促進(jìn)BMSCs增殖和遷移，促進(jìn)BMSCs中鈣沉積、ALP活性、Runx2和OCN蛋白表達(dá)。這表明，在體外實(shí)驗(yàn)中，異槲皮苷可促進(jìn)BMSCs遷移和成骨分化。褪黑素通過誘導(dǎo)間質(zhì)干細(xì)胞成骨細(xì)胞分化促進(jìn)股骨骨折大鼠模型的骨折愈合[20]。辛伐他汀通過Wnt/β-catenin途徑誘導(dǎo)MSCs成骨分化促進(jìn)骨折愈合[21]。在骨折愈合過程中，Col I主要在軟骨向編織骨過渡形成時(shí)，刺激成骨細(xì)胞合成[22]。本研究結(jié)果顯示，異槲皮苷和BMSCs均可促進(jìn)骨痂中OCN和Col I產(chǎn)生，從而促進(jìn)骨折愈合，其中異槲皮苷和BMSCs的聯(lián)合使用比BMSCs的單一使用效果更佳。該結(jié)果表明，異槲皮苷聯(lián)合BMSCs在骨折治療方面具有巨大潛力。

4 結(jié)論

異槲皮苷可能通過促進(jìn)BMSCs遷移和成骨分化加速大鼠骨折愈合。該研究結(jié)果為進(jìn)一步明確異槲皮苷在骨折中的作用及開發(fā)新的骨折相關(guān)的治療藥物提供了新的科學(xué)資料。但本研究沒有對異槲皮苷促進(jìn)BMSCs遷移和成骨分化的具體機(jī)制作進(jìn)一步探討，后續(xù)實(shí)驗(yàn)將以此為研究方向，進(jìn)一步探明異槲皮苷對BMSCs調(diào)控的具體機(jī)制。