熊夢秋，王旭鴻，潘蓓，聶俊杰，王書奎，何幫順(.南京市第一醫(yī)院中心實驗室，南京0006; .東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院，南京89)

生長刺激表達基因2蛋白(growth stimulation expressed gene 2,ST2)基因片段大小約為4×104bp,編碼556個氨基酸的蛋白質(zhì)，相對分子質(zhì)量(Mr)約為63×103。ST2是白細胞介素-1(interleukin-1, IL-1)受體家族成員，具有2種異構(gòu)體。研究表明，可溶性ST2(soluble ST2,sST2)在介導(dǎo)炎癥的過程發(fā)揮關(guān)鍵作用，其通過調(diào)控網(wǎng)絡(luò)影響相關(guān)細胞因子的表達，特別是在心臟損傷伴隨的炎癥過程中起著重要作用[1]。

sST2作為心衰標志物越來越受到基礎(chǔ)及臨床研究的關(guān)注，美國心臟病學(xué)院(ACC)和美國心臟協(xié)會(AHA)自2017年開始對sST2作為標志物在心衰中的臨床應(yīng)用進行了評價，并評估其在病例管理中的臨床應(yīng)用價值[2]。我國心臟疾病相關(guān)的診療指南中亦將該指標作為預(yù)測心衰預(yù)后的二級指標[3]。眾多的臨床研究亦表明，sST2、半乳糖凝集素-3(galectin-3,Gal-3)等被認為具有預(yù)測心衰患者的病程和死亡預(yù)后價值[4-6]。因此，本研究對一種基于磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法檢測sST2的試劑盒進行性能評價，探討其臨床應(yīng)用穩(wěn)定性與可靠性。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2020年5至6月于南京市第一醫(yī)院體檢人群40例(男、女各20例，年齡：37.80±14.38歲)及60例臨床病例(男vs女：43例vs 17例，年齡：67.32±13.86歲)，血清樣本用于不同方法學(xué)試劑的平行對比試驗。健康人群納入標準：體檢結(jié)果為正常；排除標準：(1)有免疫性疾病史；(2)近期有感冒及感染性疾病史；(3)有心血管及呼吸系統(tǒng)疾病史。臨床病例樣本為隨機檢測樣本，依對比試劑檢測結(jié)果，隨機選擇低、中、高值各20例。

1.2儀器與試劑 磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法sST2測定試劑盒、CI2000S全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析儀(北京利德曼生化公司), 膽紅素及血紅蛋白(上海信帆生物科技公司), 脂肪乳(西安立邦制藥公司)，sST2蛋白檢測試劑盒(ELISA法，天津康爾克生物科技公司)，ST-360酶聯(lián)儀(上?？迫A生物工程公司)。

2 實驗與結(jié)果

2.1精密度 按照CLSI-EP15-A2指南[7]要求，使用高、低2個水平的室內(nèi)質(zhì)控，質(zhì)控品為廠家試劑盒提供的質(zhì)控品及實驗室自制的血清樣本質(zhì)控品，每個水平各分裝5管(冷凍保存)，每天檢測1次，共測5 d。計算批內(nèi)和總變異系數(shù)(CV)。所選擇的樣本經(jīng)過批內(nèi)以及批間精密度檢測結(jié)果顯示，低水平及高水平血清樣本的總CV值分別為2.2%和2.3%；低水平及高水平試劑盒質(zhì)控品的總CV值分別為1.7%及1.5%；以上4組CV值均滿足≤10%的要求。見表1。

表1 精密度檢測結(jié)果

2.3線性范圍 實驗方法一：將接近線性范圍上限的高值樣本按比例稀釋(1、1/2……1/512)，其中低值濃度的樣本接近線性區(qū)間的下限。每個稀釋濃度重復(fù)測試3次并求均值，計算線性相關(guān)系數(shù)r。認為合格標準的測量范圍在1.00～300.00 ng/mL內(nèi)，r應(yīng)≥0.99。檢測結(jié)果表明，在1.00～300.00 ng/mL范圍內(nèi)，血清樣本r=0.999 9，試劑盒質(zhì)控品線性范圍為6.40～200.00 ng/mL，試劑盒質(zhì)控品r=0.999 9，符合≥0.990 0。實驗方法二：選擇低濃度(L)和高濃度(H)患者標本各1份，H和L混合成6個樣本，混合比例：L，4L+1H，3L+2H，2L+3H，1L+4H，H。每份混合樣本測定2次，將實測值與預(yù)期值作回歸分析。若r>0.95，a在0.97～1.03范圍內(nèi)，b與0沒有顯著差異，則可判斷為線性，同時測定值與理論值偏差小于15%認為合格。檢測結(jié)果表明，血清樣本r=0.999 8,a=1.005 3;試劑盒質(zhì)控品r=0.999 9,a=0.994 4。見圖1。

注：A，血清樣本方法學(xué)一線性范圍檢測結(jié)果；B，血清樣本方法學(xué)二線性范圍檢測結(jié)果；C，試劑盒質(zhì)控品方法學(xué)一線性范圍檢測結(jié)果；D，試劑盒質(zhì)控品方法學(xué)二線性范圍檢測結(jié)果。

2.4最低檢測限及靈敏度 最低檢測限：取待檢試劑盒中濃度為0的空白質(zhì)控作為待測樣本，對樣本進行20次測定。同時取試劑盒中低濃度點標準品及血清進行2次測定。計算20次發(fā)光強度測量值的標準差(s)，通過內(nèi)插法從標準曲線上讀取sST2含量，即為空白檢測限。若計算的靈敏度不能滿足要求，需依據(jù)4倍均值法檢查有無離群點，若有離群點，則允許刪除1個點，并根據(jù)剩余19個數(shù)據(jù)計算最低檢測限。結(jié)果表明，以待檢試劑盒中0濃度點作為待測樣本，20次重復(fù)測定的最低檢測限為0.028 ng/mL，滿足≤1 ng/mL的要求，對比試劑要求≤2 ng/mL。靈敏度檢測：獲得1份略低于廠商給定的定量限(limit of detection，LoQ)濃度的樣本(用參考方法或已通過驗證的方法確定該樣本的靶值濃度A)，重復(fù)測定20次，計算CV值應(yīng)<目標CV(通常是20%)。結(jié)果表明，低于試劑盒給定的LoQ濃度的樣本經(jīng)過20次重復(fù)測定，測定值<1 ng/mL，樣本CV= 1.1%，最低檢測限及靈敏度驗證均符合要求。

2.5臨床可報告范圍 選取線性范圍附近的高值樣本，分別進行倍數(shù)稀釋后，連同原濃度一起進行測試，重復(fù)檢測2次取平均值。稀釋后樣本結(jié)果和原濃度樣本結(jié)果進行比較，計算回收率。通過對高值樣本血清以及試劑盒質(zhì)控品進行稀釋，計算回收率，結(jié)果表明，原倍、2倍(97.6%、98.9%)、5倍(101.2%、97.0%)、10倍(104.2%、98.2%)、20倍(100.3%、98.0%)、40倍(98.7%、103.4%)，證實血清樣本及試劑盒質(zhì)控品的40倍稀釋結(jié)果可靠。

2.6參考區(qū)間驗證 收集體檢結(jié)果為正常的男、女各20份參考個體樣本按要求各檢測1次，如果40例參考個體中不超過4例的觀測值在原始報告的參考區(qū)間之外則符合要求。使用磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法試劑盒對收集的體檢健康人群臨床樣本進行檢測，結(jié)果表明，40例樣本sST2檢測最小值為0.45 ng/mL，最大值為29.43 ng/mL，平均值為8.26 ng/mL，所有樣本檢測值均在原始報告的參考區(qū)間之內(nèi)，參考區(qū)間驗證符合要求。

2.7臨床樣本測試 將磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法sST2測定試劑盒與對照酶聯(lián)免疫法試劑盒對同一臨床樣本進行平行測定，分別記錄2種試劑盒的測定值,并使用配對t檢驗進行統(tǒng)計分析。使用2種不同方法學(xué)試劑盒對樣本進行對比測試，2種方法陰、陽性不一致共3例，發(fā)生率為5%，陽性符合率為96.88%，陰性符合率96.55%，總符合率96.72%，配對t檢驗結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.582，P=0.563)，樣本比對相關(guān)系數(shù)r為0.916 2。

2.8穩(wěn)定性測試 設(shè)置3個條件分別對高低水平濃度的樣本進行測試：(1)室溫條件下：檢測時間總長為72 h。間隔24 h測試1次，重復(fù)測試2次；(2)2～8 ℃條件下：將樣本分裝為7管，每天每濃度連續(xù)測試2次，連續(xù)測試7 d；(3)-20 ℃條件下：將樣本分裝為7管，每天每濃度連續(xù)測試2次，連續(xù)測試7 d。室溫條件下樣本在不同時間的檢測結(jié)果表明，儲存樣本在室溫間隔72 h后，測試高、低兩水平樣本與初始測試結(jié)果的相對偏差分別為-15.3%及-14.6%。2～8 ℃冰箱內(nèi)儲存樣本在7 d后，測試高、低水平樣本與初始測試結(jié)果的相對偏差分別為-0.44%及0.39%。-20 ℃冰箱內(nèi)儲存樣本在7 d后，測試高、低水平樣本與初始測試結(jié)果的相對偏差分別為-2.08%及-0.72%。見圖2。

注：A,血清-20 ℃儲存時不同靜置天數(shù)下sST2檢測結(jié)果；B，血清2～8 ℃儲存時不同天數(shù)下sST2檢測結(jié)果；C，血清室溫儲存時不同天數(shù)下sST2檢測結(jié)果。

2.9干擾實驗 分別取高、低濃度血清樣本，分別加入膽紅素(0.25 mmol/L、0.5 mmol/L、1 mmol/L)、血紅蛋白(2.5 g/L、5 g/L、10 g/L)、脂肪乳(5 g/L、10 g/L、20 g/L)等3個梯度的干擾物質(zhì)，以加入基質(zhì)的樣本作為對照，按照常規(guī)檢驗程序進行平行測定，計算加之前與加之后的相對偏差，以偏差不超過15%認為合格。結(jié)果表明加入不同濃度的膽紅素、血紅蛋白、脂肪乳后的標本相對偏差均不超過15%。見圖3。

注：A，血清樣本中不同濃度膽紅素干擾實驗結(jié)果；B，血清樣本中不同濃度血紅蛋白干擾實驗結(jié)果；C，血清樣本中不同濃度脂肪乳干擾實驗結(jié)果。

3 討論

sST2臨床應(yīng)用的優(yōu)勢在于其變異度受到心衰人群中普遍合并癥的影響較小，與炎癥狀態(tài)和合并癥高度相關(guān)的sST2在射血分數(shù)保留的心力衰竭病程監(jiān)測中具有獨特的應(yīng)用優(yōu)勢。研究表明，sST2連續(xù)監(jiān)測可以作為療效監(jiān)測及預(yù)后判斷的指標，對于制定治療方案及心衰精細化的管理顯示出良好的應(yīng)用前景[8]。故本研究對基于磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法的試劑盒從精密度、重復(fù)性、線性范圍、最低檢測限、臨床可報告范圍、參考區(qū)間驗證、臨床樣本對比測試、樣本穩(wěn)定性測試、干擾實驗等9個方面對sST2檢驗試劑盒進行了驗證，結(jié)果顯示，該試劑盒檢測效能均符合臨床需求。

磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法是將磁性分離技術(shù)、化學(xué)發(fā)光技術(shù)、免疫分析技術(shù)三者結(jié)合起來的一種新型分析方法[9]，利用磁微粒包被相應(yīng)的抗原抗體，結(jié)合酶標抗體以檢測目的抗原或抗體。該法具有高靈敏度，高準確性及穩(wěn)定性好等特點，已經(jīng)在臨床廣泛應(yīng)用，如：乙肝表面抗原、丙型肝炎病毒抗體、梅毒螺旋體(TP)抗體、人類免疫缺陷病毒抗體定量檢測等方面[10]。此外，該法還可用于25-羥基維生素D的檢測且被證實具有較高的準確性及靈敏度[11]。ELISA法在臨床試驗中廣泛使用，因此，筆者將本研究建立的方法與ELISA法試劑盒同時測定40例臨床樣本，比對結(jié)果表明，2種方法結(jié)果差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義，2種方法相比較而言，磁微粒化學(xué)發(fā)光法克服了ELISA法受反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間及加樣等因素的影響。本實驗中發(fā)現(xiàn)有3例樣本存在兩試劑盒檢驗陰陽性不一致的結(jié)果，其中1例患者為左心耳介入封堵術(shù)后，ELISA法測值高于參考值1 ng/mL，位于臨界值附近，磁微粒化學(xué)發(fā)光法檢測的ST2水平較參考值低5 ng/mL，這可能與兩方法所設(shè)定的cut-off值不同有關(guān)。2例患者采用兩方法檢測結(jié)果相差較大，可能由兩試劑盒選定的抗體不同或2種試劑盒抗體的標記方法不同從而導(dǎo)致敏感性不同；此外，磁微粒化學(xué)發(fā)光主要是用磁珠做載體，ELISA是固相載體，這也可能導(dǎo)致ST2檢測結(jié)果有差異。因此，建議患者臨床檢測結(jié)果出現(xiàn)可疑值時需結(jié)合病史，必要時進行多次檢測，為臨床治療提供可靠依據(jù)。

sST2目前臨床開展應(yīng)用較少，鮮有研究從方法學(xué)角度對該指標進行評價，本研究雖從多個角度闡述基于磁微粒化學(xué)發(fā)光法檢測sST2的可靠性，但本研究檢測的樣本還相對較少，還未完全評價涉及的影響臨床樣本結(jié)果的因素，因此，本研究結(jié)果還有待于更多的臨床試驗結(jié)果的驗證。

綜上，本研究對基于磁微粒化學(xué)發(fā)光法的sST2檢測試劑盒進行性能驗證，結(jié)果顯示精密度、重復(fù)性、線性范圍、最低檢測限、臨床可報告范圍、參考區(qū)間驗證、臨床樣本測試、樣本穩(wěn)定性測試、干擾實驗驗證均符合的要求。本研究可供其他sST2檢測性能驗證的設(shè)計作為參考。