施芬，羅漢清(武漢市中心醫(yī)院新洲院區(qū)&武漢市新洲區(qū)人民醫(yī)院兒科，武漢 430400)

兒童哮喘診斷和病情嚴(yán)重程度的判斷主要依據(jù)臨床癥狀和肺功能，在診斷和治療上缺乏特異性標(biāo)志物。炎癥和免疫反應(yīng)、細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)間的相互作用與支氣管哮喘進(jìn)展關(guān)系密切，檢測(cè)相關(guān)標(biāo)志物不僅輔助哮喘的診斷，而且可深入探討哮喘發(fā)作時(shí)的炎癥細(xì)胞和細(xì)胞因子的調(diào)控機(jī)制[1]。白三烯D4(LTD4)和干擾素γ(IFN-γ)是臨床上對(duì)哮喘發(fā)作及嚴(yán)重程度評(píng)估常用的診斷標(biāo)志物[2]，但二者的特異性及敏感性不高。尋找更特異的兒童哮喘診斷標(biāo)志物對(duì)提高兒童哮喘診治水平具有重要的意義。微纖維相關(guān)蛋白4(microfibrillar-associated protein 4, MFAP4)是一種屬于纖維蛋白原相關(guān)蛋白超家族的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，在先天免疫和內(nèi)皮細(xì)胞功能的發(fā)揮過(guò)程中起重要的作用[3]。研究顯示，MFAP4可調(diào)節(jié)支氣管平滑肌細(xì)胞增殖并促進(jìn)氣道嗜酸性粒細(xì)胞增多，氣道高反應(yīng)性和肺重塑并促進(jìn)過(guò)敏性哮喘的發(fā)生[4]?？扇苄晕⒗w維相關(guān)蛋白4(soluble microfibrillar-associated protein 4, sMFAP4)是一種分泌蛋白質(zhì)，以可溶性形式存在于外周循環(huán)中[5]。本研究通過(guò)檢測(cè)哮喘患兒和健康兒童中sMFAP4、LTD4和IFN-γ的表達(dá)水平，旨在分析其對(duì)兒童哮喘篩查及病情評(píng)估的價(jià)值。

1 材料和方法

1.1一般資料 納入武漢市新洲區(qū)人民醫(yī)院兒科2019年1月至12月收治的哮喘患兒100例為哮喘組，其中包括哮喘發(fā)作期患兒50例，其中男30例，女20例，年齡(8.9±2.7)歲。診斷均依據(jù)中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科學(xué)分會(huì)呼吸學(xué)組修訂《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南》標(biāo)準(zhǔn)診斷[6]。兒童哮喘嚴(yán)重程度標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)“全球哮喘防治創(chuàng)議”(GINA方案)進(jìn)行[7]。50例急性發(fā)作期患兒中，哮喘輕度發(fā)作21例，中度發(fā)作24例，重度發(fā)作5例，以及哮喘緩解期患兒50例。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)年齡4～12歲；(2)首次哮喘發(fā)作；(3)支氣管哮喘發(fā)作診斷明確，患兒存在急性發(fā)作期和臨床緩解期的臨床資料；(4)入選兒童在72 h內(nèi)未使用糖皮質(zhì)激素、β2受體激動(dòng)劑、抗膽堿能類(lèi)、抗組胺、白三烯拮抗劑及茶堿類(lèi)藥物。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)不符合上述納入標(biāo)準(zhǔn)；(2)患者臨床資料和隨訪資料不全的患者；(3)患者家屬拒絕參與研究者。選擇同期年齡和性別相匹配的體檢健康兒童50例為健康人對(duì)照組，其中男29例，女21例，年齡(8.8±2.3)歲。哮喘組患兒與健康人對(duì)照組兒童年齡和性別比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2分別為14.36,18.36，P均>0.05)。所有患兒發(fā)作后均收入院經(jīng)規(guī)則聯(lián)合吸入糖皮質(zhì)激素(inhaled corticosteroids，ICS)/長(zhǎng)效β2受體激動(dòng)劑(long-acting beta2 agonists，LABA)治療后哮喘緩解。本研究經(jīng)武漢市新洲區(qū)人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(No.WHXZ-P-20190112),各研究對(duì)象均簽署知情同意書(shū)。

1.2主要儀器及試劑 sMFAP4、白三烯D4(LTD4)和干擾素γ(IFN-γ)酶聯(lián)免疫試劑盒(武漢優(yōu)爾生科技股份公司)，Stat Fax-2100型酶聯(lián)儀(美國(guó)Awareness公司)，TGL-16M臺(tái)式高速離心機(jī)(濟(jì)南博科公司)，乙二胺四乙酸二鉀抗凝管(沈陽(yáng)寶康生物公司)。

1.3方法

1.3.1血液樣本收集 于哮喘患兒急性發(fā)病入院時(shí)，臨床緩解期于隨訪期間，采集患兒空腹靜脈血樣本，健康人對(duì)照組兒童在體檢當(dāng)日清晨采集外周血 5 mL，4 ℃、1 500×g離心10 min，取上清液，采用乙二胺四乙酸二鉀抗凝管收集，置于-80 ℃凍存待測(cè)。

1.3.2ELISA法測(cè)定血清sMFAP4、LTD4和IFN-γ濃度 按照人sMFAP4、LTD4和IFN-γ ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)哮喘組和健康人對(duì)照組血清中sMFAP4、LTD4和IFN-γ濃度。采用Stat Fax-2100型酶聯(lián)儀在450 nm波長(zhǎng)處依次測(cè)量各孔的吸光度(A450 nm值),并計(jì)算sMFAP4、LTD4和IFN-γ濃度。參考范圍：LTD4：2～10 ng/mL，sMFAP4：1～2 ng/mL，IFN-γ：70～120 ng/mL。

2 結(jié)果

2.1各組血清sMFAP4、LTD4和IFN-γ濃度比較 哮喘患兒急性發(fā)作期血清sMFAP4濃度及LTD4濃度顯著高于健康人對(duì)照組和哮喘緩解期患兒(P<0.05)，但哮喘患兒急性發(fā)作期血清IFN-γ 濃度顯著低于健康人對(duì)照組和緩解期患兒(P=0.001)。見(jiàn)表1。

表1 各組血清sMFAP4、LTD4和IFN-γ濃度比較(ng/mL)

2.2各指標(biāo)對(duì)兒童哮喘的篩查效能比較 以?xún)和\斷標(biāo)準(zhǔn)為金標(biāo)準(zhǔn)，選取哮喘患兒為實(shí)驗(yàn)組，健康兒童為對(duì)照組，將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組sMFAP4、IFN-γ、LTD4濃度納入ROC曲線分析，評(píng)估sMFAP4、IFN-γ及LTD4及聯(lián)合檢測(cè)篩查兒童哮喘的效能。ROC曲線分析結(jié)果表明，血清sMFAP4濃度篩查兒童哮喘癥的ROC曲線下面積(area undercurve，AUCROC)顯著高于IFN-γ及LTD4，而聯(lián)合檢測(cè)sMFAP4、IFN-γ、LTD4篩查兒童哮喘癥的AUCROC亦顯著高于單項(xiàng)指標(biāo)。見(jiàn)表2、圖1。

表2 血清sMFAP4、IFN-γ、LTD4對(duì)兒童哮喘癥的篩查價(jià)值比較

圖1 血清sMFAP4、IFN-γ、LTD4對(duì)兒童哮喘癥篩查價(jià)值的ROC曲線

2.3各指標(biāo)區(qū)分兒童哮喘急性發(fā)作期和臨床緩解期的效能比較 以?xún)和毙园l(fā)作期診斷標(biāo)準(zhǔn)為金標(biāo)準(zhǔn)，選取哮喘急性發(fā)作期兒童為實(shí)驗(yàn)組，以哮喘臨床緩解期患兒為對(duì)照組，將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組sMFAP4、IFN-γ、LTD4濃度納入ROC曲線分析，評(píng)估sMFAP4、IFN-γ及LTD4及聯(lián)合檢測(cè)區(qū)分兒童哮喘急性發(fā)作期和臨床緩解期的效能。血清sMFAP4區(qū)分兒童哮喘急性發(fā)作期和臨床緩解期的AUCROC高于IFN-γ、LTD4，聯(lián)合檢測(cè)sMFAP4、IFN-γ、LTD4區(qū)分兒童哮喘急性發(fā)作期和臨床緩解期的AUCROC高于單項(xiàng)指標(biāo)。見(jiàn)表3、圖2。

表3 血清sMFAP4、IFN-γ、LTD4篩查兒童哮喘急性發(fā)作期和臨床緩解期的效能比較

圖2 血清sMFAP4、IFN-γ、LTD4區(qū)分兒童哮喘急性發(fā)作期和臨床緩解期的ROC曲線

3 討論

哮喘發(fā)作和嚴(yán)重程度常用的臨床診斷標(biāo)志物包括LTD4和IFN-γ等[2]。LTD4是哮喘發(fā)病過(guò)程中的炎癥介質(zhì)，在哮喘發(fā)病中促進(jìn)炎性反應(yīng)細(xì)胞聚集，并促進(jìn)氣道高反應(yīng)性。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，哮喘急性發(fā)作期患兒LTD4濃度高于哮喘緩解期患兒及健康人對(duì)照組，這與劉芳君等[8]研究結(jié)果相一致。

在哮喘發(fā)病過(guò)程中，T細(xì)胞激活和細(xì)胞免疫發(fā)揮關(guān)鍵作用，TH1/TH2細(xì)胞平衡紊亂是哮喘發(fā)病機(jī)制之一[9]。哮喘發(fā)作時(shí)，TH2型細(xì)胞因子過(guò)度分泌，TH1細(xì)胞分化減少，繼而由TH1細(xì)胞分泌的IFN-γ濃度顯著降低，故而IFN-γ濃度在哮喘患者中下降明顯[10]。本研究亦發(fā)現(xiàn)哮喘急性發(fā)作期IFN-γ濃度顯著低于哮喘緩解期及健康人對(duì)照組。

MFAP4是種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，屬于纖維蛋白原相關(guān)蛋白超家族，在富含彈性蛋白的組織(如心臟和肺)中呈高表達(dá)[3,11-12]，MFAP4基因定位于12q15上，以膜蛋白和可溶性(sMFAP4)形式存在于機(jī)體[12]。另有研究發(fā)現(xiàn)，急性心肌梗死患者循環(huán)中sMFAP4顯著增加[5]；且MFAP4是肝臟和肺纖維化的潛在標(biāo)志物[13]。sMFAP4在支氣管哮喘發(fā)病及進(jìn)展中扮演著重要的角色。sMFAP4可促進(jìn)支氣管平滑肌細(xì)胞增殖及嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子分泌，進(jìn)而促進(jìn)氣道嗜酸性粒細(xì)胞增多、氣道高反應(yīng)性及肺重構(gòu)，誘導(dǎo)過(guò)敏性哮喘的發(fā)生[13]。Pilecki等[14]發(fā)現(xiàn)，在卵清蛋白誘導(dǎo)的小鼠過(guò)敏性哮喘動(dòng)物模型中，sMFAP4在支氣管平滑肌細(xì)胞中表達(dá)增加，并與α1β3整合素受體結(jié)合，促進(jìn)支氣管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移。Johansson等[15]報(bào)道慢性阻塞性肺病患者血清sMFAP4濃度與慢阻肺病情嚴(yán)重程度及急性發(fā)作呈正相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，哮喘患兒血清中sMFAP4濃度高于健康人對(duì)照組，同時(shí)哮喘急性發(fā)作期水平高于臨床緩解期，提示MFAP4參與哮喘發(fā)病過(guò)程，其表達(dá)變化可通過(guò)檢測(cè)外周循環(huán)中sMFAP4變化水平而反映出來(lái)。本研究結(jié)果與文獻(xiàn)[16]報(bào)道基本一致，其研究證實(shí)在成人哮喘患者中，輕度和重度哮喘患者血清sMFAP4濃度高于健康對(duì)照者，其表達(dá)水平改變與患者是否接受β2受體激動(dòng)劑治療無(wú)關(guān)。

血清中sMFAP4濃度具有良好的篩查兒童哮喘及區(qū)分急性發(fā)作期和臨床緩解期的臨床效能，血清sMFAP4濃度篩查兒童哮喘及區(qū)分急性發(fā)作期和臨床緩解期的AUCROC、敏感性及特異性均高于LTD4 和IFN-γ，顯示出良好的臨床篩查及評(píng)估病情嚴(yán)重程度的效能，有望成為兒童哮喘無(wú)創(chuàng)輔助診斷及病情判斷標(biāo)志物。筆者進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，sMFAP4、LTD4 和IFN-γ 三者聯(lián)合應(yīng)用篩查兒童哮喘及區(qū)分急性發(fā)作期和臨床緩解期的AUCROC、敏感性及特異性均高于單項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)，提示聯(lián)合檢測(cè)上述標(biāo)志物可提高兒童哮喘的篩查及對(duì)兒童哮喘病情評(píng)估價(jià)值。本研究亦存在一定的不足之處，如未能分析sMFAP4與不同程度哮喘的急性發(fā)作存在何種程度的關(guān)系，以及未進(jìn)一步明確sMFAP4與呼吸功能、白細(xì)胞及IgE的關(guān)系如何，值得進(jìn)一步研究。