蔣萍萍，葉寧，徐寶靈(.桂林醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院急診科，廣西桂林5400；.桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院急診科，廣西桂林 54000)

急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)是急性肺損傷(ALI)的最終嚴(yán)重階段，病死率高達(dá)40%以上。因此，篩選出ARDS發(fā)病和預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志物至關(guān)重要。微小RNA(microRNA，miRNA)是小的非編碼RNA，其表達(dá)失調(diào)可能參與許多疾病的發(fā)病機(jī)制。有學(xué)者證實(shí)，miRNAs在ARDS發(fā)病機(jī)制和進(jìn)展過(guò)程中具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值[1]。另有研究表明，miRNA在ARDS炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著不可忽視的作用[2-3]。miR-150是定位于19q13.33，長(zhǎng)度為2 nt的單鏈miRNA，miR-150通過(guò)直接靶向絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶3(AKT3)表達(dá)，減輕脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的急性肺損傷[4]。然而，miR-150在ARDS中發(fā)病機(jī)制中作用的文獻(xiàn)報(bào)道少見。本研究通過(guò)檢測(cè)ARDS患者血清中miR-150的表達(dá)水平，分析其表達(dá)的臨床意義，評(píng)估其篩查或預(yù)后預(yù)測(cè)價(jià)值。

1 資料與方法

1.1臨床資料 收集2018年1月至2019年11月于桂林醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院急診科就診的ARDS患者50例，男31例，女19例；年齡(55.08±11.52)歲；BMI(23.25±2.27)kg/m2；APACHE Ⅱ評(píng)分(24.18±8.46)分。納入標(biāo)準(zhǔn)[5]：(1)符合ARDS診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)入住ICU時(shí)間>72 h。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡<18歲；(2)自身免疫病患者；(3)急性肺疾病或者慢性阻塞性肺疾病患者；(4)腫瘤或伴有肝、腎等其他臟器功能障礙患者。選取同期體檢的50例體檢健康者作為健康人對(duì)照組，男32例，女18例；年齡(55.14±12.14)歲；BMI(23.42±2.12)kg/m2。兩組研究對(duì)象年齡、性別和BMI間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究經(jīng)桂林醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)文號(hào)：2017GLMU1AYJS083)，患者及家屬均知情同意。

1.2標(biāo)本采集 采集ARDS患者入院第1天(體檢健康者于體檢當(dāng)日)的空腹靜脈血10 mL，置于生化采血管中，4 ℃、3 000 r/min離心10 min，分離并收集血清，置于-80 ℃保存。

1.3主要儀器及試劑 MR-96A酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(武漢科爾達(dá)醫(yī)療科技公司)，CFX96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)Bio-Rad公司)，Microfuge 20R高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)貝克曼公司)。miRNeasy Serum/Plasma Kit(德國(guó)Qiagen公司)，Prime Script RT試劑盒、Perfect Real time染料法實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒(日本TaKaRa公司)，miR-150和U6擴(kuò)增引物(上海生工公司)。

1.4RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 按照miRNeasy Serum/Plasma Kit說(shuō)明書提取總RNA，采用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的濃度和純度，取吸光度(A260/280 nm)值為1.8～2.0的樣本。按Prime Script RT試劑盒說(shuō)明書將miRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，樣本置于-20 ℃保存。

1.5RT-qPCR檢測(cè) 根據(jù)NCBI中GenBank提供的miR-150(序列號(hào)：NC_000019.10)，U6(序列號(hào)：NC_000898.1)的基因序列，由上海生工公司設(shè)計(jì)并合成引物，引物信息見表1。將獲得的cDNA采用Perfect Real time染料法，按照實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系為20 μL，包括：2×SYBR Green PCR Master Mix 5 μL，10 μmol/L上、下游引物各0.5 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 12 μL。循環(huán)參數(shù)：95 ℃變性30 s；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 15 s，共40個(gè)循環(huán)，在60 ℃時(shí)采集熒光信號(hào)，并用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀自帶的CFX96 Real-Time PCR Detection System軟件進(jìn)行熔解曲線分析。以U6為內(nèi)參照，并采用2-△△Ct法進(jìn)行相對(duì)定量分析。

表1 引物序列信息

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)均使用SPSS 24.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用卡方檢驗(yàn)分析血清中miR-150的表達(dá)水平與ARDS患者臨床病理參數(shù)的關(guān)聯(lián)。采用Pearson分析miR-150的表達(dá)與APACHE Ⅱ評(píng)分的相關(guān)性。Kaplan-Meier生存曲線進(jìn)行生存分析。生存資料的多因素分析應(yīng)用Cox回歸模型。根據(jù)ARDS組與健康人對(duì)照組血清miR-150的表達(dá)水平繪制ROC曲線，以評(píng)價(jià)血清miR-150用于評(píng)估ARDS的篩查價(jià)值。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1ARDS患者血清中miR-150的表達(dá)水平比較 與健康人對(duì)照組(5.44±1.27)相比，ARDS患者血清中miR-150的表達(dá)水平(2.18±0.87)顯著降低(t=14.972，P<0.05)。

2.2ARDS患者臨床病理資料分析 以miR-150表達(dá)水平的平均數(shù)(2.18)為界值，將ARDS患者分為低表達(dá)組(n=27)和高表達(dá)組(n=23)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-150低表達(dá)和APACHE Ⅱ評(píng)分有關(guān)(χ2=4.154，P=0.042)，而與患者年齡、性別、BMI以及吸煙史均無(wú)關(guān)(P>0.05)。見表2。

表2 ARDS患者臨床病理參數(shù)的比較

2.3ARDS患者血清miR-150表達(dá)水平與APACHE Ⅱ評(píng)分的相關(guān)性 Pearson分析結(jié)果顯示，ARDS患者血清miR-150的表達(dá)水平與APACHE Ⅱ評(píng)分呈負(fù)相關(guān)(r=-0.826，P<0.05)。進(jìn)一步分析miR-150低表達(dá)組和高表達(dá)組與APACHE Ⅱ評(píng)分相關(guān)性，結(jié)果顯示，血清miR-150低表達(dá)組與APACHE Ⅱ評(píng)分呈負(fù)相關(guān)(r=-0.436，P<0.05)，而血清miR-150高表達(dá)組與APACHE Ⅱ評(píng)分無(wú)相關(guān)性(r=-0.299，P>0.05)。

2.4血清miR-150水平與ARDS患者生存期的關(guān)系 Kaplan-Meier生存曲線顯示，血清miR-150低表達(dá)ARDS患者的28 d生存率顯著低于高表達(dá)者(33.33% vs 82.61%，χ2=12.320，P<0.001)。見圖1。Cox回歸分析顯示，ARDS患者生存期與血清miR-150表達(dá)水平和APACHE Ⅱ評(píng)分均有關(guān)。見表3。

圖1 miR-150表達(dá)水平與ARDS患者生存期的關(guān)系

表3 多因素Cox回歸分析患者生存期的影響因素

2.5血清miR-150用于篩查ARDS的價(jià)值 根據(jù)ARDS組與健康人對(duì)照組血清miR-150的表達(dá)水平繪制ROC曲線。miR-150篩查ARDS的ROC曲線下面積(AUCROC)為0.988(95%CI：0.975～1.000)，當(dāng)cut-off值為3.36時(shí)，其敏感性和特異性分別為96%和88%。見圖2。

圖2 miR-150篩查ARDS的ROC曲線

3 討論

ARDS病因復(fù)雜，發(fā)病機(jī)制尚不明確，miRNA作為調(diào)控因子在ARDS的發(fā)病和預(yù)后中發(fā)揮重要作用[6]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，miR-150在惡性腫瘤、系統(tǒng)性硬化病、肺動(dòng)脈高血以及組織纖維化等多種疾病中呈異常表達(dá)[7]。本研究檢測(cè)ARDS患者血清中miR-150的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-150在ARDS患者血清中低表達(dá)，且與APACHE Ⅱ評(píng)分相關(guān)呈負(fù)相關(guān)。本研究與Wei等[8]研究結(jié)果相似，其結(jié)果亦證實(shí)，血液循環(huán)中的miR-150呈異常表達(dá)。APACHE Ⅱ評(píng)分系統(tǒng)由急性生理學(xué)評(píng)分(APS)、年齡評(píng)分、慢性健康狀況評(píng)分3個(gè)部分組成，可作為評(píng)估ICU患者病情和預(yù)后的指標(biāo)[9]。筆者進(jìn)一步采用Kaplan-Meier生存曲線分析，結(jié)果顯示，血清miR-150低表達(dá)的ARDS患者28 d生存率顯著低于血清miR-150高表達(dá)者。Cox回歸模型結(jié)果表明，ARDS患者生存期與血清miR-150表達(dá)水平以及APACHE Ⅱ評(píng)分相關(guān)，這與Li等[4]研究相一致，其結(jié)果表明，miR-150表達(dá)水平在ARDS患者的血清中顯著降低，并且與疾病嚴(yán)重程度和ARDS 28 d生存率呈負(fù)相關(guān)。提示miR-150水平與ARDS患者病情嚴(yán)重程度和預(yù)后具有一定的相關(guān)性，可作為患者預(yù)后的重要生物學(xué)標(biāo)志物。

miRNA有望成為ARDS潛在的診斷指標(biāo)和治療靶點(diǎn)。研究表明，miR-122高表達(dá)與ARDS患者病情嚴(yán)重程度及預(yù)后相關(guān)，且miR-122聯(lián)合APACHE Ⅱ評(píng)分對(duì)ARDS患者預(yù)后具有較高的評(píng)估價(jià)值[10]。本研究采用ROC曲線對(duì)血清miR-150篩查ARDS的價(jià)值進(jìn)行分析，結(jié)果表明，miR-150篩查ARDS的AUCROC為0.988(95%CI：0.975～1.000)，敏感性和特異性分別為96%和88%。這與Gan等[11]研究結(jié)果一致，其研究表明髖部骨折后急性肺損傷(ALI)患者血清miR-150的表達(dá)明顯降低，進(jìn)一步進(jìn)行線性回歸分析結(jié)果顯示，血清miR-150與肺組織學(xué)得分顯著相關(guān)，且在髖部骨折后ALI患者的輔助診斷具有一定的價(jià)值。以上研究提示血液循環(huán)中的miR-150可能成為ARDS早期篩查及預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志物。

綜上所述，miR-150在ARDS患者血清中低表達(dá)，并與APACHE Ⅱ評(píng)分以及預(yù)后相關(guān)，有望成為ARDS發(fā)病和預(yù)后預(yù)測(cè)的生物學(xué)標(biāo)志物。但是本研究尚存一些不足：(1)樣本量較少，預(yù)后及篩查相關(guān)結(jié)果需通過(guò)擴(kuò)大樣本量進(jìn)行驗(yàn)證并補(bǔ)充；(2)未進(jìn)行連續(xù)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)miR-150的變化水平及療效評(píng)價(jià)；(3)本文缺乏相關(guān)作用機(jī)制研究，后期需通過(guò)體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行完善與補(bǔ)充。