常永莉，張莉媛，王惠琴，王冰，陳方園，李天浩(陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，陜西咸陽(yáng) 712000)

細(xì)胞因子可調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化，其中白細(xì)胞介素-13(interleukin-13,IL-13)基因、β2腎上腺素能受體(β2 adrenergic receptor,β2-AR)基因、人類白細(xì)胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)基因在哮喘患者發(fā)病過(guò)程中具有重要意義[1]。IL-13基因Intron3+1923位點(diǎn)C/T多態(tài)性對(duì)IL-13的生物學(xué)活性具有調(diào)節(jié)作用[2]。Mohamed-Hussein等[3]指出，β2-AR功能低下可能是導(dǎo)致哮喘發(fā)病的重要機(jī)制。谷亞星等[4]認(rèn)為，HLA基因在調(diào)節(jié)機(jī)體免疫方面具有重要作用，且對(duì)多種呼吸系統(tǒng)疾病具有易感性。因此，對(duì)上述基因多態(tài)性的研究已成為了哮喘遺傳學(xué)的研究熱點(diǎn)。本研究采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性法(PCR-PFLP)對(duì)90例哮喘患者IL-13、β2-AR及HLA基因進(jìn)行檢測(cè)，并測(cè)定其與T淋巴細(xì)胞亞群及免疫球蛋白E(IgE)之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.2儀器與試劑 限制性內(nèi)切酶NIAⅣ、TaqDNA聚合酶、IgE酶標(biāo)抗體、Trizol試劑(美國(guó)賽默飛世爾科技公司)，抗人CD3+、CD4+、CD8+單克隆抗體及IgG對(duì)照(北京同立海源生物科技公司)。Applied biosystems PCR熱循環(huán)儀(美國(guó)賽默飛世爾科技公司)，DNM-9602G酶聯(lián)儀(北京普朗新技術(shù)公司)，DYY-4C穩(wěn)壓穩(wěn)流定時(shí)電泳儀(上海滬粵明科學(xué)儀器公司)，BD流式細(xì)胞儀(昆山市賽特科學(xué)儀器公司)。

1.3方法

1.3.1標(biāo)本采集及DNA抽提 采集哮喘患者治療前及健康人對(duì)照組體檢時(shí)的晨起空腹靜脈血3 mL，477×g離心10 min。取血漿500 μL，置于-20 ℃保存，用以檢測(cè)血清IgE水平。其余部分抽提DNA。吸取細(xì)胞懸液至1.5 mL Ep管中，4 ℃、251×g離心5 min，棄上清液，按照Trizol試劑說(shuō)明書操作抽提DNA，采用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA樣本，取吸光度(A260/280 nm)值在1.8～2.1的樣本用于后續(xù)試驗(yàn)。樣本置-20 ℃保存。

1.3.2引物設(shè)計(jì)及PCR 根據(jù)GenBank收錄的IL-13、β2-AR、HLA基因序列，采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，并由上海生工公司合成特異性引物，引物序列見(jiàn)表1。PCR擴(kuò)增總體系為50 μL，包括基因組DNA 200 ng，10×PCR buffer 5 μL，dNTPs各10 nmol，1. 5 U Taq DNA 聚合酶，10 pmol上、下游引物，具體擴(kuò)增所需MgCl2濃度(IL-13和β2-ARR16G A/G均為1.5 μL，HLA為2.0 μL)，使用滅菌蒸餾水補(bǔ)充體積至50 μL。IL-13基因PCR循環(huán)參數(shù)：94 ℃ 變性2 min；94 ℃ 40 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 50 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸 5 min。β2-ARR16G A/G基因PCR循環(huán)參數(shù)：95 ℃變性5 min；95 ℃ 30 s，66 ℃ 45 s，72 ℃ 60 s，共40個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。HLA基因PCR循環(huán)參數(shù)：94 ℃變性 5 min；55 ℃ 60 s，72 ℃ 60 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。取3 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，采用Applied biosystems PCR熱循環(huán)儀檢測(cè)(220 V電壓，電泳20 min)，30 g/L瓊脂糖凝膠電泳并觀察。

表1 PCR引物序列及產(chǎn)物片段大小

1.3.3PCR-PFLP 取PCR產(chǎn)物10 μL，37 ℃酶切過(guò)夜。在30 g/L瓊脂糖凝膠中加溴化乙錠(0.7 mg/L)，取8 μL酶切產(chǎn)物上樣電泳凝膠，紫外分光光度計(jì)下觀察。IL-13基因型CC位點(diǎn)存在BsaAI位點(diǎn)，酶切產(chǎn)物為310 bp、249 bp，CT基因型出現(xiàn)酶切點(diǎn)，酶切產(chǎn)物為559 bp、310 bp、249 bp，而TT基因未出現(xiàn)酶切點(diǎn)。β2-ARR16G基因酶切后A/A基因型為168 bp，G/G基因型為150 bp+18 bp，A/G雜合子基因型為168 bp+150 bp+18 bp。

1.3.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)T淋巴細(xì)胞亞群 取各組患者靜脈血3 mL，經(jīng)EDTA-K2抗凝后，取100 μL加入試管，依次加入抗人CD3+、CD4+、CD8+單克隆抗體20 μL，取另一管加入MsIgG1-RD1/MsIgG2-FITC各20 μL作為陰性對(duì)照管，避光靜置30 min。加入0.2 mL溶血?jiǎng)┖筮M(jìn)行10倍稀釋，靜置5 min，240×g離心5 min后棄上清液。加入2 mL PBS洗滌2次，240×g離心5 min。加入1%多聚甲醛0.3 mL，采用BD流式細(xì)胞儀檢測(cè)。以CD3+、CD4+、CD8+陽(yáng)性率≥0.1%為陽(yáng)性表達(dá)。

1.3.5ELISA法檢測(cè)血清IgE 取上述2組患者的血清樣本，復(fù)溫后按照ELISA試劑盒及DNM-9602G酶聯(lián)儀說(shuō)明書操作檢測(cè)IgE水平。IgE參考范圍<85 KU/L。

2 結(jié)果

2.1IL-13、β2-AR、HLA基因頻率在2組中的分布 疾病組患者IL-13基因Intron3+1923位點(diǎn)TT、TC基因型頻率、β2-ARR16G基因位點(diǎn)AA基因型頻率、HLA基因0401、0601等位基因頻率較健康人對(duì)照組均顯著升高(P<0.05)。而IL-13基因Intron3+1923位點(diǎn)CC基因型頻率較健康人對(duì)照組顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 2組IL-13、β2-AR、HLA基因不同基因型頻率[n(%)]

2.2IL-13、β2-AR、HLA不同基因型對(duì)T淋巴細(xì)胞亞群及血清IgE水平的影響IL-13TT、TC，β2-ARAA，HLA0401、0601基因型患者CD3+、CD4+、CD4+/CD8+較IL-13CC，β2-ARGG、AG，HLA0101/0102、0103、0501基因型患者顯著降低，而血清IgE水平較IL-13CC、GG，β2-ARAG，HLA0101/0102、0103、0501基因型顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 IL-13基因不同基因型患者T淋巴細(xì)胞及IgE的水平

3 討論

既往的研究?jī)H針對(duì)單一基因位點(diǎn)進(jìn)行相關(guān)性分析，對(duì)多個(gè)基因位點(diǎn)研究報(bào)道較少，考慮到IL-13、β2-AR、HLA基因多態(tài)性在哮喘患者進(jìn)展過(guò)程中具有重要的臨床意義，本研究使用PCR-PFLP法進(jìn)行基因多態(tài)性分析，并對(duì)其與患者T淋巴細(xì)胞亞群及IgE水平關(guān)系進(jìn)行探討。

本研究結(jié)果顯示，哮喘患者IL-13基因Intron3+1923位點(diǎn)共出現(xiàn)CC、TT、TC 3種基因型，其中患者TT、TC基因型頻率顯著高于健康人對(duì)照組(P<0.05)，表明哮喘患者T等位基因頻率分布高于健康人對(duì)照組，C等位基因顯著低于健康人對(duì)照組，提示IL-13基因Intron3+1923位點(diǎn)上的T等位基因可能是哮喘的易感基因，而C等位基因可能是哮喘患者的抵抗基因。因此，具有T等位基因的人群可能因?yàn)殚L(zhǎng)期生活在污染嚴(yán)重或過(guò)敏原較多的環(huán)境中，哮喘發(fā)病率明顯增加[6]。此外，β2-ARR16G單核苷酸多態(tài)性(SNP)共出現(xiàn)AA、GG、AG 3種基因型，AA基因型頻率高于健康人對(duì)照組(P<0.05)。AA屬純合子基因型，提示純合子基因型與哮喘發(fā)作有一定關(guān)聯(lián)。劉曉華等[7]研究證實(shí)，β2-ARR16G中AA基因型與哮喘具有一定相關(guān)性，急性期和緩解期β2-ARR16G 16位點(diǎn)的分布基因頻率中精氨酸/精氨酸分別為17.7%和23.5%，精氨酸/甘氨酸為67.7%和66.2%，甘氨酸/甘氨酸為14.5%和10.3%，27位點(diǎn)分布基因頻率中谷氨酰胺/谷氨酰胺為80.6%和75.0%，谷氨酰胺/谷氨酸為12.9%和17.6%，谷氨酸/谷氨酸為6.5%和7.4%，二者在2個(gè)位點(diǎn)上基因型存在差異，與本研究結(jié)果相一致。HLA等位基因共出現(xiàn)0101/0102、0103、0401、0601、0501基因型，HLA0401、0601基因型頻率均高于健康人對(duì)照組(P<0.05)，提示0401、0601基因型可對(duì)哮喘產(chǎn)生影響。有學(xué)者證實(shí)，IL-13水平過(guò)高可誘導(dǎo)患者體內(nèi)B細(xì)胞合成IgE，導(dǎo)致患者出現(xiàn)免疫功能紊亂，出現(xiàn)T淋巴細(xì)胞亞群失衡[8]。本研究中TT、TC、AA、0401、0601型患者CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平均低于其余基因型患者，而血清IgE水平高于其余基因型患者，提示IL-13基因攜帶T基因型、β2-AR基因AA純合子基因型、HLA0401、0601等位基因可能具有協(xié)同作用。

通過(guò)研究IL-13、β2-AR、HLA基因位點(diǎn)突變導(dǎo)致哮喘進(jìn)展，引起T淋巴細(xì)胞亞群、IgE表達(dá)失衡，筆者認(rèn)為IL-13、β2-AR、HLA基因表達(dá)水平異常及基因多態(tài)性可導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)TH1/TH2失衡，IL-13表達(dá)水平增加，大量作用于B細(xì)胞，從而加重體內(nèi)炎癥反應(yīng)。Reich等[9]指出，IgE可調(diào)節(jié)嚴(yán)重特應(yīng)性皮炎患者皮膚組織中IL-13的表達(dá)，與本研究結(jié)果相一致。同時(shí)，IL-13基因可直接促進(jìn)IgE細(xì)胞因子合成，β2-AR、HLA基因可轉(zhuǎn)導(dǎo)相似信號(hào)[10]。雖然β2-AR、HLA基因與IL-13之間的作用機(jī)理目前尚不清楚，但I(xiàn)L-13可誘導(dǎo)MHC Ⅱ類分子及CD23表達(dá)，抑制嗜酸性粒細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)β2-AR及HLA-DR表達(dá)，促進(jìn)T細(xì)胞活化。本研究?jī)H證實(shí)IL-13基因攜帶T基因型、β2-AR基因AA純合子基因型、HLA0401、0601等位基因與哮喘患者存在一定關(guān)系，但在地域、人種之間的區(qū)別及如何形成遺傳易感性機(jī)制，還需進(jìn)一步研究。本研究今后將增加樣本量，并對(duì)患者病情嚴(yán)重程度及家族史進(jìn)行分析，從而為預(yù)防、診治哮喘提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。