賀 盼，孔東升,,3，王 立，馮宜明

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學林學院，甘肅 蘭州 730070；2.河西學院，甘肅 張掖 734000；3.甘肅省黑果枸杞工程研究中心，河西學院，甘肅 張掖 734000)

黑果枸杞(Lyciumruthenicum)是茄科(Solanaceae)枸杞屬(Lycium)多年生耐鹽、抗旱灌木[1]，漿果呈球形，成熟后為紫黑色、無毒、有甜味[2]。其天然分布于陜西北部、甘肅、寧夏、青海、新疆和西藏等地的荒漠地帶[3]，在甘肅主要分布于河西走廊的鹽化荒漠地帶[4-5]。相關(guān)研究表明[6]，黑果枸杞果實中含有人體必需的酚類、黃酮類、維生素、蛋白以及氨基酸，還含有豐富的花青素，被稱為“花青素之王”?；ㄇ嗨赜址Q“花色素”，是一種水溶性的天然植物色素，安全無毒[7-8]，具有抗氧化和抗自由基等功能[9-10]，有強腎、護肝、潤肺、明目、健胃、補腦、降血糖、抗發(fā)炎、抗衰老及通經(jīng)作用[11-12]，多酚和黃酮的藥理作用、功能與花青素有極高的相似性[13-15]，因此，黑果枸杞是西北地區(qū)重要的集藥用和生態(tài)功能于一體、極具開發(fā)價值的野生植物資源[16]。

黑果枸杞的經(jīng)濟價值曾引起農(nóng)戶大面積人工種植，但近2 a來，農(nóng)民的種植積極性不斷降低，苗木管理不善、種植面積大幅減少，主要原因是黑果枸杞栽培苗木為野生濫挖或種子自繁，缺乏良種苗木，果實質(zhì)量不高、產(chǎn)量低，導致種植效益低下，同時黑果枸杞的深加工、開發(fā)利用技術(shù)嚴重滯后，影響了黑果枸杞產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。現(xiàn)階段，黑果枸杞的研究大多集中在生理生化[17-19]、栽培[20-21]及各種有效成分的提取方法[22-23]，關(guān)于黑果枸杞良種選育卻未見報道。自1968年澳大利亞農(nóng)學家Donald提出了植物理想株型的理論[24]，國內(nèi)外便開展各種優(yōu)良品種選育、建立林木良種基地的實踐。目前中國有沙柳[25]、青海云杉[26]等幾十個優(yōu)良樹種的無性系選育研究及優(yōu)樹基地。紅枸杞的研究、發(fā)展較快，已成功選育的有‘寧杞1-9號’、‘柴杞1-3號’、‘青枸1號’和‘蒙杞1號’等14個不同地區(qū)栽培的品種[27]，這些品種成倍提高了枸杞的產(chǎn)量與品質(zhì)。因此，利用黑果枸杞天然群體豐富的表型變異，制定優(yōu)樹選擇參數(shù)，選育產(chǎn)量、花青素等含量高的優(yōu)良品種，是目前該產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的迫切需要。本試驗通過廣泛的外業(yè)調(diào)查，對其表型性狀連續(xù)2 a觀測，結(jié)合實驗室對花青素、多酚及黃酮營養(yǎng)成分含量的測定，以花青素含量高為目標，同時選擇藥理作用相似相輔的多酚、黃酮含量為輔助指標，利用K-均值聚類法和綜合評分法從初選優(yōu)樹中選出優(yōu)良的黑果枸杞單株，為進一步建立無性系良種繁育園，開展多世代選育、確定優(yōu)良品種提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2018年8月上旬在甘肅省玉門市和青海省諾木洪2個試驗地，利用項目組制定的黑果枸杞樹形、枝條、花、葉、果實、抗病蟲害狀況等30個優(yōu)樹表型參數(shù)選擇了180株優(yōu)良單株，編號18-1至18-180號，對優(yōu)樹進行定位、掛牌標記，并建立優(yōu)樹檔案。2019年8月在前一年選擇的優(yōu)樹中，選擇表型穩(wěn)定、果實成熟基本一致、無病蟲害、單株果實產(chǎn)量高的100株，編號19-1至19-100，并采集果實，迅速烘干，測定其營養(yǎng)指標。

1.2 指標測定

花青素：在預試驗中以甘肅省黑果枸杞為材料，利用正交試驗反復優(yōu)化，確定有機溶劑提取黑果枸杞花青素的乙醇濃度、提取溫度、提取時間、物料比等參數(shù)。隨后，以100株優(yōu)良單株的烘干果實為樣本，分別稱取一定質(zhì)量的樣品粉末，按照1∶15(質(zhì)量∶體積)加入pH=3.0的體積分數(shù)80%的乙醇，放入50℃水浴中加熱5 h，然后離心10 min，取上清液加入2.5 mL體積分數(shù)為30%的硫酸，搖勻后加入25 mL體積分數(shù)為1%的香草醛溶液避光30 min，在分光光度計545 nm處測定其吸光度。

多酚：參照嚴和平等[28]的方法進行測定。

黃酮：參照李淑珍[29]的方法進行測定。

1.3 優(yōu)樹綜合評分法

根據(jù)各個性狀的均值、標準差、極差確定每個性狀的打分標準，對于無法定量的性狀進行分級打分，制定黑果枸杞優(yōu)樹綜合評分體系。采用t檢驗法確定低于候選優(yōu)樹群體均值的顯著下限值，即為優(yōu)樹入選最低分數(shù)值[30]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用WPS 2019 excel、SPSS 17.0和MATLAB軟件對數(shù)據(jù)進行整理、聚類分析、K-S檢驗、相關(guān)性檢驗、回歸分析和繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單指標選優(yōu)

依據(jù)K-均值聚類法[31]，把花青素、多酚、黃酮以相似性原則分別進行分類，分成優(yōu)等、中等、低等3類，如圖1所示。

100株表型穩(wěn)定的初選優(yōu)樹花青素含量為0.16%～1.09%，優(yōu)、中、低等分別為30、41、29株，其平均值分別為0.94%、0.84%、0.39%；多酚含量為3.20%～12.93%，優(yōu)、中、低等分別為21、40、39株，其平均值分別為10.94%、7.72%、4.86%；黃酮含量為1.24%～5.05%，優(yōu)、中、低等分別為26、50、24株，其平均值分別為3.69%、2.68%、1.88%。

2.2 優(yōu)樹綜合評價

以黑果枸杞的花青素含量作為選優(yōu)的主要目標，黃酮、多酚含量作為輔助指標。因性狀較多且各性狀存在較大差異，根據(jù)各性狀的均值、標準差、極差選擇綜合評分法[32]進行選優(yōu)綜合評判。首先，對黑果枸杞花青素含量優(yōu)等的30株候選優(yōu)樹進行分析，根據(jù)數(shù)量性狀的平均值和標準差確定各量化指標的基礎(chǔ)值，即用平均值加上1個標準差作為基礎(chǔ)值(表1)。將極差每變化10%作為一個評分等級，在基礎(chǔ)值的基礎(chǔ)上將打分標準分為11分等級，分別賦予分值，建立各性狀評分標準。以花青素為例，其基礎(chǔ)值為0.89，極差為0.94，則以0.094為一個評分等級?；ㄇ嗨睾繛?.89～0.98評9分，0.79～0.89評8分，以此類推，最終建立黑果枸杞候選優(yōu)樹的評分標準(表2)。根據(jù)表2所建立的綜合評分標準對每株候選優(yōu)樹進行打分，將各性狀的得分求和得到每株候選優(yōu)樹的總分(表3)。

表1 黑果枸杞性狀變異分析

對初步入選的候選優(yōu)樹進行K-S(Kolmogorov-Smirnov)檢驗[33]，其總體數(shù)值服從正態(tài)分布。根據(jù)總體候選優(yōu)樹得分平均數(shù)進行單樣本平均數(shù)假設(shè)檢驗，確定顯著低于平均分數(shù)的上限值為18.07,即:

表4 黑果枸杞入選優(yōu)樹得分值

2.3 相關(guān)性分析

從圖2和表5中可以看出，回歸系數(shù)(R)與相關(guān)系數(shù)相同，即3個指標間的回歸分析與相關(guān)分析的結(jié)果一致?；ㄇ嗨嘏c黃酮含量呈極顯著正相關(guān)(p<0.01)；花青素與多酚含量呈顯著正相關(guān)(p<0.05)；黃酮與多酚含量呈弱相關(guān)，說明所選的3個指標具有合理性。

表5 各指標相關(guān)分析

3 討 論

3.1 黑果枸杞優(yōu)良品種選育方法的探討

育種的方式[34]有自然變異選優(yōu)、雜交育種、誘變育種、航天育種、生物技術(shù)育種等，但優(yōu)樹選擇是育種的重要步驟。那么如何進行黑果枸杞選優(yōu)工作呢？考慮到黑果枸杞豐富的天然變異及其營養(yǎng)價值的重要性，本研究采用種植戶薦優(yōu)和項目組實地調(diào)查相結(jié)合的傳統(tǒng)選優(yōu)方法，開展優(yōu)樹單株外業(yè)調(diào)查、登記，詳細調(diào)查產(chǎn)地條件、表型性狀，測定其營養(yǎng)物含量，最終采取綜合評分法[35]確定優(yōu)樹。針對花青素、黃酮、多酚的具體性狀數(shù)值，以花青素含量為主要選定目標，以黃酮、多酚為輔助指標，采用綜合評分法進行評定，該方法可以有效地避免單指標選優(yōu)存在較大偏差的問題，進而在綜合得分的基礎(chǔ)上通過K-S檢驗，將總體分值大于18.07的14株確定為復選優(yōu)樹。因此，本研究所用方法在統(tǒng)計學理論上依據(jù)充分。

3.2 黑果枸杞優(yōu)良品種選育的可持續(xù)性

果實的營養(yǎng)成分含量和產(chǎn)量決定著植株的優(yōu)良程度，對果實內(nèi)營養(yǎng)成分的測定和分析可以作為評判果實品質(zhì)好壞的依據(jù)。強日照、高海拔、寒冷、土壤鹽漬化、干旱等特殊的自然條件誘導黑果枸杞果實積累大量花青素，白紅進等[36]測得花青素含量為0.15%～1.09%，汪洋等[37]對青海、新疆、內(nèi)蒙、北京等地取樣測定的黑果枸杞花青素含量為0.07%～0.84%，祁銀燕等[13]測得柴達木野生和人工栽植黑果枸杞花青素含量分別為0.84%和0.90%，本研究在選優(yōu)過程中確定優(yōu)等黑果枸杞植株的花青素含量為0.81%～1.09%，遠高于上述含量，說明本研究2 a的選優(yōu)工作具有充分的可行性，也為進一步優(yōu)樹選擇提供了數(shù)據(jù)支撐。且本研究測得與花青素藥理作用相似的多酚、黃酮分別為3.19%～12.92%和1.24%～5.05%，與閆亞美等[38]測得26個不同地區(qū)的黑果枸杞多酚0.82%～8.80%、黃酮1.80%～6.00%基本相符；另外，花青素、多酚、黃酮三者之間的相關(guān)性與練冬梅等[39]對7個不同品種黃秋葵、劉佩等[40]對5種寒地果實(白穗醋栗、軟棗獼猴桃、草原櫻桃、黑果腺肋花楸和蔓越莓)以及曲文茹[41]測定的20個品種藍莓的花青素、多酚、黃酮含量的相關(guān)性結(jié)果相一致，而且研究表明[40]抗氧化能力與花青素、黃酮、多酚含量呈正相關(guān)，這正好印證了本試驗優(yōu)樹選擇時，以花青素含量為主要目標，黃酮、多酚為輔助指標的合理性。

3.3 黑果枸杞優(yōu)樹選擇的后續(xù)工作

該試驗通過2 a的表型穩(wěn)定性觀測和實驗室測定其營養(yǎng)成分含量，初步選擇出14株優(yōu)良植株，但是優(yōu)良品種是自然選擇和人工選擇的共同結(jié)果，此次優(yōu)樹選擇的過程中只考慮了人工栽培條件的基本相似，無法考慮其他復雜的外部環(huán)境對優(yōu)樹品質(zhì)的影響，且黑果枸杞果實是否受大小年的影響也未知，其他表型指標如何更好地應用于優(yōu)樹的選擇還需要仔細研究。因此，有必要對優(yōu)樹母株進行多世代觀察和測定，下一步優(yōu)良品種的選育工作應將初選的100株優(yōu)樹進行無性繁殖，將無性系苗木栽植到同一環(huán)境、同一地塊進行家系的進一步表型觀測和營養(yǎng)成分的含量測定，重點對已初選的14株優(yōu)樹開展再復選，建立黑果枸杞優(yōu)樹園，盡快得到穩(wěn)定的黑果枸杞優(yōu)良品種。

4 結(jié) 論

野外表型選定的100株黑果枸杞初優(yōu)樹中，采用綜合評分法對其花青素、多酚、黃銅進行綜合評定，得出編號為19-39、19-55、19-57、19-66、19-67、19-68、19-69、19-76、19-78、19-80、19-82、19-83、19-86、19-94的14株復選優(yōu)樹，占初選優(yōu)樹的14%，可作為下一步優(yōu)樹選擇的依據(jù)。