黃鈺芳，張恩和，張新慧，曹 瑞，謝田朋，陳紅剛，高素芳

(1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；3.寧夏醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，寧夏 銀川 750004)

蘭州百合(Liliumdavidiivar.unicolor)是百合科(Liliaceae)百合屬(Lilium)川百合的變種，具有400多年的栽培歷史。因鱗莖潔白、肉質(zhì)甜美，享有“蔬菜人參”的美譽(yù)[1]。蘭州百合產(chǎn)業(yè)是蘭州市南郊二陰山區(qū)經(jīng)濟(jì)發(fā)展、農(nóng)民創(chuàng)收的主要產(chǎn)業(yè)。但是近年來(lái)，連作重茬現(xiàn)象嚴(yán)重，已造成蘭州百合產(chǎn)量和品質(zhì)的大幅下降，連作障礙問(wèn)題日漸凸顯，已嚴(yán)重影響到蘭州百合產(chǎn)業(yè)的持續(xù)性發(fā)展[2-4]。

連作障礙的發(fā)生是作物-土壤系統(tǒng)內(nèi)多種因素相互關(guān)聯(lián)、綜合作用的結(jié)果。土壤養(yǎng)分失衡、土壤鹽漬化和酸化、土壤酶活性的變化均能導(dǎo)致連作障礙[5]。除此之外，植物根系分泌物及殘?bào)w分解物所引起的自毒作用也是導(dǎo)致連作障礙發(fā)生的重要原因。自毒效應(yīng)在許多作物中已經(jīng)得到證實(shí)[6-9]。研究顯示[1,10]，自毒作用也是引起蘭州百合連作障礙的重要因素之一。鑒于此，本試驗(yàn)動(dòng)態(tài)研究了蘭州百合生長(zhǎng)旺盛期和收獲期各連作年限下根際土壤中的化感物質(zhì)，并利用生物活性試驗(yàn)對(duì)其中典型的化感物質(zhì)進(jìn)行了自毒效應(yīng)的驗(yàn)證，以期進(jìn)一步明確蘭州百合連作障礙發(fā)生的可能性機(jī)制，并為緩解和克服連作障礙奠定科學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)地位于甘肅省蘭州市七里河區(qū)蛟龍寺村，海拔1 700 m。該地區(qū)屬蘭州市南郊二陰山區(qū)，大陸性半干旱氣候，年平均氣溫5.8℃，生長(zhǎng)期平均232 d，≥10℃的年積溫為2 200℃，無(wú)霜期平均135 d，年均降水量460 mm，適合蘭州百合喜溫涼、喜光照、好濕潤(rùn)的生理特征。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)和種植管理

2017年3月于海拔相同、坡度相近的陽(yáng)坡選擇歇地3 a(前茬作物為蘭州百合)、連作2 a及連作4 a的蘭州百合地塊，每一地塊劃分3個(gè)小區(qū)作為相同處理的3個(gè)重復(fù)，每一小區(qū)面積為20 m2。以蛟龍寺蘭州百合種植基地提供的蘭州百合種球?yàn)槭茉噷?duì)象，進(jìn)行大田小區(qū)試驗(yàn)。

正茬、連作2 a和連作4 a地塊土壤均為沙壤土。3種土壤中速效氮分別為：571.0、613.8 mg·kg-1和140.8 mg·kg-1，速效磷分別為：229.6，23.7 mg·kg-1和30.4 mg·kg-1，速效鉀分別為：378.1、324.4 mg·kg-1和348.5 mg·kg-1，以最高值為基準(zhǔn)，將3種土壤肥力補(bǔ)充至相同水平。選擇包合緊密、基盤(pán)健康、大小均一的蘭州百合種球進(jìn)行種植，全生育期不再追肥，正常管理。

2017年8月和10月，即在蘭州百合生長(zhǎng)旺盛期和收獲期，分別于不同處理地塊隨機(jī)挖取健康植株，抖掉根系大塊土壤后，收集黏貼在根系4 mm以內(nèi)的土壤，過(guò)篩后將每一處理土壤混合均勻，分別留存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 不同連作年限土壤浸提液的制備及GC-MS分析

稱取生長(zhǎng)旺盛期及收獲期不同連作年限根際土壤各500 g，用8倍量蒸餾水振蕩浸漬24 h后抽濾，濾液離心10 min，取上清液濃縮至適量，用氯仿分別萃取后，收集氯仿液，減壓濃縮至0.5 mL，用于GC-MS測(cè)定。

GC-MS條件：采用黃鈺芳等[11]的GC-MS條件對(duì)不同連作年限根際土壤浸提液進(jìn)樣分析，應(yīng)用計(jì)算機(jī)檢索系統(tǒng)將質(zhì)譜數(shù)據(jù)與數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行匹配，得到未知物的結(jié)構(gòu)類型。

利用相似系數(shù)公式，比較不同連作年限土壤中化合物的相似度。

式中，a、b、c分別為正茬、連作2 a及4 a土壤中獨(dú)有的成分?jǐn)?shù)目，d為共有成分?jǐn)?shù)目(a、b、c代表的成分其相對(duì)含量均大于1%，d代表共有成分中至少有一個(gè)的相對(duì)含量大于1%)。

1.4 自毒物質(zhì)的生物活性檢測(cè)

為進(jìn)一步檢測(cè)被鑒定化學(xué)物質(zhì)的自毒效應(yīng)，利用對(duì)苯二甲酸二辛酯和抗氧劑2246的外源化合物(分別用D和A表示)，測(cè)定兩物質(zhì)在單施及共施條件下對(duì)蘭州百合幼苗的化感自毒效應(yīng)。對(duì)苯二甲酸二辛酯和抗氧劑2246均購(gòu)置于上海達(dá)瑞精細(xì)化學(xué)品有限責(zé)任公司。

1.4.1 單施時(shí)對(duì)苯二甲酸二辛酯和抗氧劑2246的自毒效應(yīng)研究 結(jié)合前期試驗(yàn)結(jié)果，用氯仿將上述2種外源化合物溶解后各配制成濃度為0.2 mg·mL-1和5.0 mg·mL-1的溶液，分別標(biāo)記為D0.2和D5、A0.2和A5。生物學(xué)試驗(yàn)采用培養(yǎng)皿法。于培養(yǎng)皿底部墊入2層濾紙，分別精密吸取不同處理溶液10 mL，待溶劑揮干后，選取基盤(pán)健康、大小均勻的蘭州百合種球，放入培養(yǎng)皿，每皿9粒種球。以溶劑氯仿為對(duì)照，每處理重復(fù)3次。將種植后的培養(yǎng)皿放入培養(yǎng)箱，25℃條件下培養(yǎng)15 d。之后，對(duì)蘭州百合幼苗的各項(xiàng)生長(zhǎng)指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定。

1.4.2 共施時(shí)對(duì)苯二甲酸二辛酯和抗氧劑2246的互作效應(yīng)研究 在單施試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行互作效應(yīng)試驗(yàn)，分別用D0.2A0.2、D0.2A5、D5A0.2及D5A5表示，研究2種物質(zhì)混合液對(duì)蘭州百合幼苗生長(zhǎng)的影響。試驗(yàn)方法同1.4.1節(jié)，在精密量取不同濃度的對(duì)苯二甲酸二辛酯溶液10 mL后，按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)再分別加入相應(yīng)濃度的抗氧劑2246溶液10 mL，待氯仿完全揮干后，種植蘭州百合種球，培養(yǎng)15 d后，測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)。

化感效應(yīng)指數(shù)(Response index ，RI)采用Williamson的方法計(jì)算[12]：

式中，C為對(duì)照值，T為處理值。

綜合化感效應(yīng)(Synthesis effect，SE)為各項(xiàng)指標(biāo)RI的平均值。RI>0、SE>0表示促進(jìn)；RI<0、SE<0表示抑制；絕對(duì)值的大小表示化感作用強(qiáng)度。

1.5 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS 21.0進(jìn)行單因子方差分析，采用新復(fù)極差法(Duncan)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 生長(zhǎng)旺盛期蘭州百合不同連作年限土壤中化感物質(zhì)的檢測(cè)

由表1可知，生長(zhǎng)旺盛期從蘭州百合正茬、連作2 a及連作4 a根際土壤中分別鑒定出11、15和19種化合物，主要包括：醇類、醛類、酯類、胺類、酚酸類及部分萜類物質(zhì)，其中大部分曾被報(bào)道為自毒物質(zhì)[13-15]，GC-MS色譜圖見(jiàn)圖1。對(duì)表1中各處理相對(duì)含量大于1%的組分進(jìn)行相似系數(shù)計(jì)算，發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)旺盛期各處理土壤中所含化合物的相似系數(shù)為15.38%。其中，抗氧劑2246 和對(duì)苯二甲酸二辛酯在各處理中均被檢出，且二者相對(duì)含量較高。正茬、連作2 a及連作4 a土壤中，抗氧劑2246的相對(duì)含量分別為16.69%、17.82%和18.96%，對(duì)苯二甲酸二辛酯相對(duì)含量分別達(dá)到26.97%、31.29%和63.21%。綜上可見(jiàn)，生長(zhǎng)旺盛期蘭州百合正茬、連作2 a及連作4 a土壤中自毒物質(zhì)的種類差異較大，且連作年限越長(zhǎng)，自毒物質(zhì)種類及數(shù)量的差異性越大。

表1 生長(zhǎng)旺盛期不同連作年限蘭州百合土壤中的化感物質(zhì)

2.2 收獲期蘭州百合不同連作年限土壤中化感物質(zhì)的檢測(cè)

表2顯示，收獲期蘭州百合正茬、連作2 a及連作4 a根際土壤中分別存在9種、15種及17種化合物，所含化合物類別與生長(zhǎng)旺盛期的檢測(cè)結(jié)果相類似，包含了醇類、醛類、酯類和少數(shù)酚酸及萜類物質(zhì)，GC-MS色譜圖見(jiàn)圖2。除正茬土壤中未檢測(cè)到抗氧劑2246外，其他處理中仍存在對(duì)苯二甲酸二辛酯和抗氧劑2246，且相對(duì)含量仍較高。與生長(zhǎng)旺盛期相比，收獲期各處理中被鑒定化合物的相似系數(shù)為12.50%，較前者下降了18.73%。綜合可見(jiàn)，隨連作年限的延長(zhǎng)，收獲期蘭州百合土壤中存在的自毒物質(zhì)種類同樣有所增加，且各處理土壤中存在的自毒物質(zhì)差異性較旺盛期增大。

表2 收獲期不同連作年限蘭州百合土壤中的化感物質(zhì)

2.3 對(duì)苯二甲酸二辛酯和抗氧劑2246的自毒效應(yīng)研究

2.3.1 單施時(shí)對(duì)苯二甲酸二辛酯和抗氧劑2246的自毒效應(yīng) 由表3可知，2種濃度條件下，對(duì)苯二甲酸二辛酯和抗氧劑2246對(duì)蘭州百合幼苗苗長(zhǎng)和根長(zhǎng)均表現(xiàn)出抑制作用，且5.0 mg·mL-1時(shí)抑制作用增強(qiáng)；對(duì)于苗鮮重和根鮮重，前者表現(xiàn)出“低促高抑”現(xiàn)象，而后者均表現(xiàn)出促進(jìn)作用，但隨濃度的升高促進(jìn)作用減小。綜合分析可知，在0.2 mg·mL-1和5.0 mg·mL-1條件下，同一化感物質(zhì)對(duì)蘭州百合幼苗的各項(xiàng)生長(zhǎng)指標(biāo)具有不同的化感效應(yīng)；而相同濃度時(shí)，不同的化感物質(zhì)對(duì)蘭州百合幼苗的化感效應(yīng)也存在差別。

就綜合化感效應(yīng)指數(shù)而言，對(duì)苯二甲酸二辛酯在0.2 mg·mL-1條件下就能抑制蘭州百合幼苗的生長(zhǎng)，而抗氧劑2246在濃度為5.0 mg·mL-1時(shí)才發(fā)揮抑制效應(yīng)。

表3 對(duì)苯二甲酸二辛酯和抗氧劑2246對(duì)蘭州百合幼苗的化感效應(yīng)

2.3.2 共施時(shí)對(duì)苯二甲酸二辛酯和抗氧劑2246的互作效應(yīng) 為進(jìn)一步深入考察化感物質(zhì)間的相互作用，在固定對(duì)苯二甲酸二辛酯濃度后，配合不同濃度的抗氧劑2246，進(jìn)行化感物質(zhì)間的互作效應(yīng)試驗(yàn)(表4)。

表4 對(duì)苯二甲酸二辛酯和抗氧劑2246混合液對(duì)蘭州百合幼苗的化感效應(yīng)

對(duì)表4和表3的SE分析后可以看出，D0.2和D5的SE為負(fù)值，表明D0.2和D5對(duì)蘭州百合幼苗表現(xiàn)出抑制作用，當(dāng)加入相同作用的A5后，D0.2A5和D5A5的SE仍為負(fù)值，但其絕對(duì)值并未增加，說(shuō)明D0.2A5和D5A5未表現(xiàn)出抑制協(xié)同作用；當(dāng)給D0.2和D5中加入促進(jìn)作用的A0.2后，D0.2A0.2的SE為正值，但絕對(duì)值較A0.2減小，D5A0.2的SE為負(fù)值，其絕對(duì)值較D5減小，說(shuō)明兩成分間表現(xiàn)出一定的疊加效應(yīng)。

綜合以上結(jié)果可以看出，對(duì)苯二甲酸二辛酯(D)和抗氧劑2246(A)間存在一定的相互作用，具體表現(xiàn)出：若兩成分單施作用方向相同，共施時(shí)沒(méi)有表現(xiàn)出同方向的協(xié)同效應(yīng)；若兩成分單施作用方向相反，共施時(shí)表現(xiàn)出反方向的疊加效應(yīng)。

3 討論與結(jié)論

3.1 蘭州百合各生育期不同連作年限土壤中自毒成分的比較

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，生長(zhǎng)旺盛期蘭州百合正茬、連作2 a及連作4 a根際土壤中分別存在11、15和19種化合物，收獲期各處理土壤中分別存在9、15及17種成分。主要包括：醇類、醛類、酯類、胺類、酚酸類及少量萜類化合物，其中大部分曾被報(bào)道為化感自毒物質(zhì)[13-15]。同一生育期不同連作年限相比，連作4 a土壤中分離得到的成分最多，連作2 a土壤次之，正茬土壤中存在的化合物最少?？梢?jiàn)，隨著連作年限的延長(zhǎng)，蘭州百合植株向土壤中分泌的次生代謝產(chǎn)物不斷累積，從而造成連作時(shí)間越長(zhǎng)，自毒物質(zhì)的種類和數(shù)量越多。就不同生育期而言，生長(zhǎng)旺盛期蘭州百合土壤中存在的化合物較多，收獲期較少。生長(zhǎng)旺盛期植物體內(nèi)代謝頻繁，形成的次生代謝產(chǎn)物較多，從而向土壤中分泌的化合物種類和數(shù)量也有所增加；收獲期植物體內(nèi)代謝減弱，加之各種微生物對(duì)土壤中化合物的不斷分解，造成土壤中自毒物質(zhì)種類較旺盛期有所減少且差異性有所增加。

研究顯示，孫鴻強(qiáng)[16]從蘭州百合連作土壤中檢測(cè)出香豆酸、烏頭酸、苯甲酸和鄰苯二甲酸等多種酚酸類成分，而在本試驗(yàn)中鑒定出的物質(zhì)主要有：醇類、醛類、酯類和少量酚酸類及萜類化合物，尚未檢測(cè)到諸多酚酸類物質(zhì)。這可能是研究者采用的檢測(cè)方法、利用的供試對(duì)象以及收集供試材料的時(shí)間和地點(diǎn)不同等多種因素造成的。

3.2 對(duì)苯二甲酸二辛酯和抗氧劑2246作為典型自毒物質(zhì)的原因闡釋

本試驗(yàn)中，除收獲期正茬土壤外，在其余處理土壤中均鑒定出對(duì)苯二甲酸二辛酯和抗氧劑2246，且其相對(duì)含量均較高。對(duì)苯二甲酸二辛酯與前人[17-23]檢測(cè)到的苯甲酸酯類化感物質(zhì)在結(jié)構(gòu)和性質(zhì)上存在更多的相似性，而抗氧劑2246在陳君良等[23]的研究中已證實(shí)具有化感效應(yīng)。故在本試驗(yàn)中將二者作為蘭州百合連作土壤中存在的典型自毒物質(zhì)，對(duì)其單施和共存時(shí)的化感效應(yīng)進(jìn)行了研究。

此外，前期結(jié)合生物活性試驗(yàn)測(cè)定了旺盛期對(duì)苯二甲酸二辛酯和抗氧劑2246在連作4 a土壤浸提液中的濃度貢獻(xiàn)大小分別為1.97 mg·mL-1和0.21 mg·mL-1；收獲期二者的濃度貢獻(xiàn)分別為1.90 mg·mL-1和0.02 mg·mL-1。自毒作用的大小與溶液濃度的高低有著密切的關(guān)系，故在預(yù)試驗(yàn)中結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道[24]設(shè)置了0.02、0.2、2.0 mg·mL-1及5.0 mg·mL-1的濃度溶液，研究了4種濃度條件下對(duì)苯二甲酸二辛酯和抗氧劑2246對(duì)蘭州百合幼苗生長(zhǎng)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)0.2 mg·mL-1和5.0 mg·mL-1的濃度溶液對(duì)蘭州百合幼苗生長(zhǎng)的影響最顯著。因此，在本試驗(yàn)中選擇了0.2 mg·mL-1和5.0 mg·mL-1的濃度條件對(duì)2種成分的自毒作用進(jìn)行了研究。

3.3 對(duì)苯二甲酸二辛酯和抗氧劑2246自毒效應(yīng)的比較

研究顯示[25]，自毒物質(zhì)在發(fā)揮自毒作用時(shí)具有一定的濃度效應(yīng)，即自毒效應(yīng)會(huì)隨著自毒物質(zhì)濃度的不同而呈現(xiàn)出不同的作用方向和作用大小。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，0.2 mg·mL-1和5.0 mg·mL-1條件下，對(duì)苯二甲酸二辛酯對(duì)蘭州百合幼苗的生長(zhǎng)均產(chǎn)生抑制作用，但5.0 mg·mL-1時(shí)抑制作用更強(qiáng)。與之相比，抗氧劑2246在0.2 mg·mL-1時(shí)對(duì)蘭州百合幼苗表現(xiàn)出促進(jìn)作用，而在5.0 mg·mL-1時(shí)表現(xiàn)出生長(zhǎng)抑制效應(yīng)?？梢?jiàn)，不同的自毒物質(zhì)具有不同的自毒效應(yīng)，而同一物質(zhì)在不同的濃度條件下也呈現(xiàn)出不同的作用方向和大小。這一結(jié)果與前人的研究結(jié)論相似[26]。

植物土壤中存在多種自毒物質(zhì)，它們對(duì)同種植物表現(xiàn)出的自毒作用是多種成分共同體現(xiàn)出來(lái)的，是這些物質(zhì)的復(fù)合效應(yīng)[27]。因此，許多學(xué)者總是在自毒物質(zhì)單獨(dú)作用效應(yīng)的基礎(chǔ)上研究自毒物質(zhì)間的復(fù)合效應(yīng)。如母容等[28]在研究阿魏酸、對(duì)羥基苯甲酸及其混合液對(duì)土壤氮素的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，混合液對(duì)土壤氮素轉(zhuǎn)化的抑制作用最強(qiáng)，表明阿魏酸和對(duì)羥基苯甲酸存在協(xié)同作用。姜男[29]研究發(fā)現(xiàn)，0.4 μmol·L-1的咖啡酸對(duì)灰菜根長(zhǎng)表現(xiàn)出顯著的抑制作用，但當(dāng)加入抑制貢獻(xiàn)率為0的水楊酸后，其混合液對(duì)灰菜根長(zhǎng)的抑制率下降了97.8%，表現(xiàn)出水楊酸對(duì)咖啡酸的拮抗效應(yīng)。本試驗(yàn)在研究對(duì)苯二甲酸二辛酯和抗氧劑2246的互作效應(yīng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，如果二者單施作用方向相同，即均能抑制蘭州百合幼苗生長(zhǎng)，共施時(shí)沒(méi)有表現(xiàn)出抑制協(xié)同效應(yīng)；而若單施作用方向相反，共施條件下表現(xiàn)出了反方向的疊加作用。綜合以上分析可以看出，不同的自毒物質(zhì)對(duì)同種植物產(chǎn)生的作用效果有所差異，且自毒物質(zhì)間的相互作用程度和作用方向也存在差別，體現(xiàn)出化感自毒物質(zhì)間復(fù)雜多樣的作用特點(diǎn)。